Subtyping von Campylobacter jejuni Ssp. doylei Massen Isolaten Spectrometry-basierte PhyloProteomics (MSPP)

Das übergeordnete Ziel dieses massenspektrometrischen Verfahrens, das als MSPP oder Mass Spectrometry-based PhyloProteomics bezeichnet wird, ist es, Bakterien auf Stammebene zu subtypisieren. Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragestellungen aus den Bereichen Mikrobiologie, Epidemiologie und Hygiene beantworten. Zum Beispiel kann es verwendet werden, um Ausbruchssituationen zu analysieren, indem die phyloprotomische Verwandtschaft visualisiert wird.

Im Vergleich zu anderen Typisierungsmethoden ist MSPP pro Probe günstig und sehr schnell. Nosokomiale Infektionen sind ein Thema von zunehmender Bedeutung, und wir hoffen, dass unser MSPP-Programm auf die epidemiologische Typisierung anderer Bakterien oder sogar Pilze ausgeweitet werden kann. Unser MSPP-Schema bietet Einblicke in die Verwandtschaft von Stämmen, so dass es für die Vorhersage relevanter Phänotypen, wie z. B. Arzneimittelresistenz oder sogar Virulenz, sinnvoll ist, es dort anzuwenden, wo diese Phänotypen mit spezifischen Genotypen korrelieren.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie zwei Röhrchen mit Matrixlösung vor, indem Sie 2,5 Milligramm HCCA in 250 Mikrolitern eines organischen Lösungsmittelgemisches, einem 50%igen Isonitril, lösen. Fügen Sie rekombinantes Humaninsulin als internes Kalibrat zu einem von ihnen hinzu, dann 47,5 % doppelt destilliertes Wasser und 2,5 % Trifluoressigsäure. Als nächstes verteilen Sie eine stecknadelkopfgroße Menge eines Volkes aus dem Referenzstamm direkt auf eine Maldi-Zielplatte.

Zur Bestimmung der genauen Masse des Kalibrierpeaks legen Sie den Mikroliter des Prüfstandards auf eine andere Stelle. Überlagern Sie jeden Bakterienfleck und den Standard mit 1 Mikroliter HCCA-Spike-Matrixlösung und lassen Sie sie bei Raumtemperatur kristallisieren. Wiederholen Sie für jeden zu analysierenden Stamm die Abstrichvorbereitung.

Jede Stelle mit 1 Mikroliter HCCA-Matrixlösung überziehen und bei Raumtemperatur kristallisieren lassen. Alternativ können Proteine aus schwer zu legenden Zellen extrahiert werden. Ernten Sie dazu ca. 5 Völker aus einer Agarplattenkultur mit einer Impfschlaufe.

Suspendieren Sie sie in 300 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen und mischen Sie sie durch wiederholtes Pipettieren gründlich, bis die Bakterienkolonien vollständig suspendiert sind. Dann 900 Mikroliter absolutes Ethanol hinzufügen und mischen. Zentrifugieren Sie die Probe 1 Minute lang bei 13.000 g.

Nachdem Sie das Pellet getrocknet haben, resuspendieren Sie es, indem Sie es in 50 Mikrolitern 70%iger Ameisensäure auf und ab pipettieren. Fügen Sie dann 50 Mikroliter Aceto-Nitril hinzu und mischen Sie. Entfernen Sie den Schmutz durch Zentrifugieren bei 13.000 g für 2 Minuten.

Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie 1 Mikroliter des Supernamed auf eine Probenposition auf einer Maldi-Zielplatte. Nachdem Sie die Probe trocknen gelassen haben, überlagern Sie jede Stelle mit einem Mikroliter HCCA-Matrixlösung und lassen Sie sie bei Raumtemperatur kristallisieren. Führen Sie an dieser Stelle eine MALDI-TOF-Analyse durch, indem Sie 600 Spektren in 100 Aufnahmeschritten für jeden Spot sammeln.

Klicken Sie zunächst in der Konfigurationssoftware des Massenspektrometers auf die Registerkarte Auto Execute. Öffnen Sie die Methode, indem Sie mit der linken Maustaste auf die Schaltfläche Methode klicken und die Methode aus dem Pulldown-Menü auswählen. Klicken Sie anschließend mit der linken Maustaste auf die Schaltfläche Bearbeiten, um den Editor für die automatische Ausführung der Methode zu öffnen.

Legen Sie auf der Registerkarte Akkumulation den Wert für einen zufriedenstellenden Schuss auf 100 und einen Wert für die Summe auf 600 fest. Wählen Sie für jedes Spektrum den Kalibrantenpeak aus der Liste aus, klicken Sie auf Automatische Zuweisung und drücken Sie OK. Nachdem Sie Massenspektren von jedem Spot erhalten haben, bestimmen Sie experimentell die genaue Masse des Kalibrierungspeaks, indem Sie ein Spektrum mit dem Spektrumbrowser öffnen und den Peak bei der erwarteten Masse im Vergleich zu einem Spektrum ohne Kalibrant ermitteln. Vergewissern Sie sich, dass der Calibrant-Peak nicht durch einen anderen Biomarker des interessierenden Organismus verdeckt wird.

Berechnen Sie aus den Genomsequenzierungsdaten des Referenzstamms das theoretische monoisotopische Molekulargewicht jedes der kodierten Proteine, indem Sie die DNA-Sequenz in die entsprechende Aminosäuresequenz übersetzen. Laden Sie diese Proteinsequenz in das Eingabefeld des entsprechenden Bioinformatik-Ressourcenpanels hoch oder kopieren Sie sie und berechnen Sie den theoretischen isoelektrischen Punkt und das Molekulargewicht. Kopieren Sie die Ergebnisse in eine Tabelle, wobei eine Spalte den Genidentifikator und eine weitere Spalte das Molekulargewicht enthält.

Sortieren Sie die Zeilen nach berechnetem Molekulargewicht, um das Nachschlagen von Massen zu erleichtern. Fügen Sie in die Tabelle eine zusätzliche Spalte für das Molekulargewicht der demathianinierten Form ein und subtrahieren Sie 135 Dautons vom Monoisotopen-Molekulargewicht. Ordnen Sie jede gemessene Biomarkermasse den berechneten Massen aus dem Referenzstamm zu, indem Sie die gemessene Masse in der Genomtabelle nachschlagen.

Notieren Sie in einer anderen Tabelle die Masse und den Identifikator für jedes Biomarker-Ion. Kalibrieren Sie nun die Massenspektren, die aus den Sammelisolaten erhalten wurden, wie es für den Referenzstamm getan wurde. Für ein Isolat pro Reihe sind variante Biomarker in den Massenspektren zu identifizieren, die gemessene Masse für jeden Biomarker und die vorhergesagte Isoform in den jeweiligen Spalten aufzuzeichnen.

Das MALDI-TOF-Massenspektrum der C-Jejuni-Unterspezies doylei ATCC 49349 enthält 14 einzigartig geladene Biomarker-Ionen, die durch Vergleich der berechneten Molekülmassen mit dem Referenzspektrum identifiziert werden konnten. Innerhalb der Sammlung wurden unterschiedliche Isoformen für L32 ohne Methionin, L33 und das hypothetische Protein, das von gil152939117, S20 M und S15 M kodiert wird, nachgewiesen. Die verbleibenden Massen, die den Biomarker-Ionen zugeordnet waren, waren in den getesteten Isolaten unveränderlich. Die Aminosäuresubstitution, die der Massenverschiebung entspricht, wurde durch PCR-Amplifikation und Sanger-Sequenzierung des jeweiligen Gens unter Verwendung der hier aufgeführten Primer identifiziert.

Hier sind die Aminosäuresequenzen aller Biomarker-Ionen, die im MSPP-Schema enthalten sind, sowie die detektierten alelischen Isoformen angegeben. Das MLST-basierte UPGMA-Dendrogramm, das aus den untersuchten Doylei-Isolaten der C-jejuni-Unterart erstellt wurde, zeigt, dass jedes Isolat zu einem anderen MLST-Sequenztyp gehört. Und Stamm LMG7790 hat die längste phylogenetische Distanz.

Wie bei der MLST-Alaysis zu sehen ist, hat das Isolat LMG7790 in der MSPP-Analyse der untersuchten Doylei-Isolate der C-jejuni-Subspezies die längste phyloprodeomische Distanz. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb eines Tages durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Während Sie diesem Verfahren folgen, ist es wichtig, sich an die Toxizität einiger Substanzen zu erinnern, die während des Experiments verwendet wurden.

So kann beispielsweise Acetonitril Hautreizungen verursachen. Zusätzlich zum MSPP können weitere Methoden, wie z.B. die DNA-Sequenzierung, durchgeführt werden, um weitere Parameter, wie z.B. das Vorhandensein von Resistenzgenen, zu analysieren. Die Entwicklung dieser Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Mikrobiologie den Weg zur Erforschung der Photogenese.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie MSPP funktioniert und wie es auf bestimmte Fragen angewendet werden kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit gewalttätigen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und immer Vorsichtsmaßnahmen wie S2-Laborgeräte getroffen werden sollten.