Name: Subtyping von Campylobacter jejuni Ssp. doylei Massen Isolaten Spectrometry-basierte PhyloProteomics (MSPP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Erfahren Sie die massenspektrometrische PhyloProteomik (MSPP) zur Subtypisierung von Campylobacter jejuni ssp. doylei. Diese Methode ermöglicht schnelle, kostengünstige Stammtypen für epidemiologische Studien.

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Wir danken Hannah Kleinschmidt für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde gefördert durch das Open-Access-Förderprogramm der Deutschen Forschungsgemeinschaft und den Publikationsfonds der Georg-August-Universität Göttingen.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der wichtigste Schritt bei der Einrichtung eines MSPP Regelung ist die eindeutige genetische Bestimmung von Biomarkern Ionen-Identitäten. Wenn es nicht möglich ist , einen Biomarkers zweifellos zu identifizieren, dann sollte es aus dem Schema 13 ausgeschlossen. Die C. jejuni ssp. doylei Schema enthält 14 verschiedene Biomarker - Ionen. Diese sind 5 weniger im Vergleich zu dem C. jejuni ssp. jejuni MSPP Schema 13 .Die wesentlichste Unt...

Während des letzten Jahrzehnts, Matrix-assistierte Laser - Desorptions - Ionisations -Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF - MS) fortgeschritten in der klinischen Mikrobiologie 1, ein hoch geschätzter Standardmethode zur mikrobiellen Gattung und Art Identifizierung zu sein 2. Spezies Identifizierung wird auf die Aufzeichnung von kleinen Protein Fingerabdrücke von intakten Zellen oder Zell-Lysaten basiert. Der typische Massenbereich für eine Masse in der klinischen Routine Mikrobiologie verwendeten Spektrometer 2-20 kDa. Zusätzlich kann die resultierenden Spektren verwendet werden , Stämme bei den unten Spezies und unter subspecies Ebene 3 zu unterscheiden. Frühe Pionier Studien haben spezifische Biomarker - Ionen für eine bestimmte Untergruppe von Stämmen in Campylobacter jejuni 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica Serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7 bis 9, und Escherichia coli 10 bis 12. Die Kombination mehrerer variabler Biomarkers Massen allelische Isoformen entsprechenden bietet die Möglichkeit, für tiefere Subtyping. Früher führten wir erfolgreich eine Methode , um diese Variationen in Massenprofile in aussagekräftige und reproduzierbare phyloproteomic Beziehungen Massenspektrometrie phyloproteomics (MSPP) auf einem C genannt zu konvertieren jejuni ssp. jejuni - Isolat Sammlung 13. MSPP eine massenspektrometrische äquivalent zu DNA-Sequenz basiert Subtyping Techniken wie multilocus Sequenz Typisierung (MLST) verwendet werden. Campylobacter - Arten sind die Hauptursache von bakterieller Gastroenteritis weltweit 14, 15. Als Folge der Campylobacteriosis postinfektiöse sequela, nämlich Guillain Barré - Syndrom, reaktive Arthritis und entzündlicher Darmerkrankung kann 16 entstehen. Die Hauptinfektionsquellen sindkontaminiertes Tierfleisch aus Huhn, Pute, Schwein, Rind, Schaf und Enten, Milch und Oberflächenwasser 15, 17. regelmäßige epidemiologische Überwachung Studien im Zusammenhang mit der Lebensmittelsicherheit sind daher notwendig. MLST ist der &quot;Goldstandard&quot; in der molekularen Typisierung für Campylobacter - Arten 18. Weil die Sanger-Sequenzierung basiert MLST Verfahren ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig und relativ teuer ist MLST typing auf relativ kleine Isolat Kohorten beschränkt. Daher besteht ein Bedarf an preiswerter und schneller Subtypisierung Methoden. Dieser Bedarf könnte durch massenspektrometrische Methoden wie MSPP erfüllt werden. In diesem Beitrag wird ein ausführliches Protokoll für MSPP-Typisierung eine Sammlung von Campylobacter jejuni ssp. Doylei Isolate und Vergleich seines Potentials mit MLST.

<table><tbody><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex III TOF/TOF 200 System</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>GT02554 G201</td><td>Massenspektrometer</td></tr><tr><td>bakterieller Teststandard BTS</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>263564</td><td>Softwarepaket</td></tr><tr><td>Bruker IVD Bakterial Test Standard</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>8290190</td><td>5 Röhrchen</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolieren&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; Stamm 093</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350; CCUG 18265; Kasper, 71; LMG 8219; NCTC 11847</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolieren&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>Columbia Agar base&nbsp;</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.10455 .0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kompass für FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>251419</td><td>Softwarepaket</td></tr><tr><td>defibriertes Schafsblut&nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>02854 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>HCCA-Matrix</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Papiertaschentuch</td><td>Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td></td><td></td>Z188956</tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>259935</td><td>Softwarepaket</td></tr><tr><td>Mast Cryobank Fläschchen</td><td>Mast Diagnostica, Reinfeld, Deutschland</td><td>CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 polierter Stahl Target</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes Humaninsulin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, molekularbiologisches</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

subtyping von<em&gt; campylobacter jejuni</em&gt; ssp.<em&gt; doylei</em&gt; massen isolaten spectrometry-basierte phyloproteomics (mspp)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF-MS bietet die Möglichkeit, einige Bakterien nicht nur auf die Art und Unterart Ebene zu unterscheiden, sondern auch unten auf Stammebene. Allelische Isoformen der nachweisbaren Biomarker-Ionen führen zu Isolat-spezifische Massenverschiebungen. Die Massenspektrometrie-basierte phyloproteomics (MSPP) ist eine neuartige Technik, die die massenspektrometrische nachweisbar Biomarkers Massen in einem System kombiniert, das Abzug von phyloproteomic Beziehungen von Isolat spezifischen Massenverschiebungen im Vergleich zu einem Genom-Referenzstamm sequenziert werden kann. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden dann verwendet, MSPP Basis Dendrogramme zu berechnen. Hier beschreiben wir den Workflow von MSPP durch eine Campylobacter jejuni ssp eingeben. Doylei Isolat Sammlung von sieben Stämme. Alle sieben Stämme waren menschlichen Ursprungs und multilocus Sequenz Typisierung (MLST) ihre genetische Vielfalt unter Beweis gestellt. MSPP-Typisierung ergab sieben verschiedene Typen MSPP Sequenz, ausreichend ihre phy reflektierendenlogenetic Beziehungen. Die C. jejuni ssp. doylei MSPP Schema 14 verschiedene biomarker Ionen enthält, meistens ribosomalen Proteine in dem Massenbereich von 2-11 kDa. MSPP kann im Prinzip, mit einem erweiterten Massenbereich zu anderen massenspektrometrischen Plattformen angepasst werden. Daher hat diese Technik das Potenzial, ein nützliches Werkzeug für die Stammebene mikrobielle Typisierung zu werden.

Früher haben wir erfolgreich ein MSPP Schema für C einstellt jejuni ssp. jejuni 13. Hier wollten wir die Methode zu erweitern , um die Geschwister C. Unterart jejuni ssp. doylei. In dieser speziellen Einstellung, sieben C. jejuni ssp. doylei Isolate wurden von der belgischen Sammlung von Mikroorganismen / Labor für Mikrobiologie UGent BCCM / LMG Gent, Belgien erworben. Alle sieben Isolate für unsere Analys...

Die Massenspektrometrie-basierte phyloproteomics (MSPP) wurde verwendet , um eine Sammlung von Campylobacter jejuni ssp geben. Doylei isoliert auf Stammebene im Vergleich zu multilocus Sequenz Typisierung (MLST).

Subtyping von<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Massen Isolaten Spectrometry-basierte PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Das übergeordnete Ziel dieses massenspektrometrischen Verfahrens, das als MSPP oder Massenspektrometrie-basierte PhyloProteomik bezeichnet wird, ist die Subtypisierung von Bakterien auf der Ebene des Stammes. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen in den Bereichen Mikrobiologie, Epidemiologie und Hygiene zu beantworten. Beispielsweise lässt sich damit eine Ausbruchssituation analysieren, indem die phyloproteomische Verwandtschaft visualisiert wird.Im Vergleich zu anderen Typisierungsmethoden ist MSPP kostengünstig pro Probe und sehr schnell. Krankenhausinfektionen stellen ein Problem von wachsender Bedeutung dar, und wir hoffen, dass unser MSPP-Schema auf die epidemiologische Typisierung anderer Bakterien oder sogar von Pilzen ausgeweitet werden kann. Unser MSPP-Schema liefert Einblicke in die Verwandtschaft von Stämmen. Daher ist es sinnvoll, es dort anzuwenden, wo relevante Phänotypen – wie Arzneimittelresistenz oder sogar Virulenz – mit bestimmten Genotypen korrelieren.Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie zwei Reagenzgläser mit Matrixlösung vor, indem Sie 2,5 Milligramm HCCA in 250 Mikroliter einer organischen Lösungsmittelmischung, bestehend aus 50 % A

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Capture Compounds sind trifunktionelle kleinen Molekülen, um die Komplexität des Proteoms durch funktionelle reversible kleines Molekül-Protein-Wechselwirkung durch Photo-Vernetzung und Reinigung gefolgt reduzieren. Hier verwenden wir ein Capture Compound...

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium...

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Obwohl die Hockerkultur für Campylobacter ungenau ist, gilt sie immer noch als Goldstandard für die Identifizierung. Methoden zur Bestimmung der Nachweisgrenze und des Überlebens in Transportmedien von C. jejuni im menschlichen Stuhl werden beschrieben und mit einem neuen Immunoassay mit besserer Genauigkeit verglichen.

Kulturmethoden zur Bestimmung der Grenze der Detektion und des Überlebens in Transportmedien von Campylobacter Jejuni in humanen Fäkalproben

Die Protein-Arginin (R)-Methylierung ist eine weit verbreitete posttranslationale Modifikation, die mehrere biologische Signalwege reguliert. Die Massenspektrometrie ist die beste Technologie, um das R-Methylproteom global zu profilieren, wenn es mit biochemischen Ansätzen zur modifizierten Peptidanreicherung gekoppelt ist. Der Arbeitsablauf für die hochzuverlässige Identifizierung der globalen R-Methylierung in menschlichen Zellen wird hier beschrieben.

Ein massenspektrometrie-basierter Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse

Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

Die Machbarkeit von Gesamtgenomsequenzierungsstrategien (WGS) mit Tischgeräten hat die Genomabfrage jeder Mikrobe von Relevanz für die öffentliche Gesundheit in einer Laborumgebung vereinfacht. Eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS wird beschrieben und eine bioinformatische Pipeline zur Analyse vorgestellt.

Charakterisierung eines pathogenen Escherichia coli-Stammes aus Oreochromis spp. Farmen mit Ganzgenomsequenzierung

Campylobacter ist weltweit die Hauptursache für bakterielle lebensmittelbedingte Gastroenteritis. Obwohl Betriebe Maßnahmen ergreifen, um die Prävalenz in ihren Einrichtungen zu reduzieren, erreichen kontaminierte Produkte durchweg die Verbraucher. Die in den letzten zwölf Jahren entwickelte Technik adressiert die Grenzen bestehender Methoden zur Isolierung und zum Nachweis von Campylobacter spp. aus rohem Fleisch.

Nachweis und Isolierung von Campylobacter spp. aus rohem Fleisch

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Bewertung der mikrobiellen Zusammensetzung in Milchprodukten durch die Kombination von Kulturwissenschaften mit MALDI-TOF MS. Es liefert Taxonomieergebnisse, die mit der 16S-rRNA-Sequenzierung vergleichbar sind, mit einer kürzeren Durchlaufzeit als herkömmliche Kulturmethoden.

Bewertung der mikrobiellen Sicherheit von Molkereien mittels Bacterial Proteomic Profiling mittels MALDI-Ansatz

Erfahren Sie die massenspektrometrische PhyloProteomik (MSPP) zur Subtypisierung von Campylobacter jejuni ssp. doylei. Diese Methode ermöglicht schnelle, kostengünstige Stammtypen für epidemiologische Studien.

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