Name: Subtyping von Campylobacter jejuni Ssp. doylei Massen Isolaten Spectrometry-basierte PhyloProteomics (MSPP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Erfahren Sie die massenspektrometrische PhyloProteomik (MSPP) zur Subtypisierung von Campylobacter jejuni ssp. doylei. Diese Methode ermöglicht schnelle, kostengünstige Stammtypen für epidemiologische Studien.

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Wir danken Hannah Kleinschmidt für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde gefördert durch das Open-Access-Förderprogramm der Deutschen Forschungsgemeinschaft und den Publikationsfonds der Georg-August-Universität Göttingen.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der wichtigste Schritt bei der Einrichtung eines MSPP Regelung ist die eindeutige genetische Bestimmung von Biomarkern Ionen-Identitäten. Wenn es nicht möglich ist , einen Biomarkers zweifellos zu identifizieren, dann sollte es aus dem Schema 13 ausgeschlossen. Die C. jejuni ssp. doylei Schema enthält 14 verschiedene Biomarker - Ionen. Diese sind 5 weniger im Vergleich zu dem C. jejuni ssp. jejuni MSPP Schema 13 .Die wesentlichste Unt...

Während des letzten Jahrzehnts, Matrix-assistierte Laser - Desorptions - Ionisations -Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF - MS) fortgeschritten in der klinischen Mikrobiologie 1, ein hoch geschätzter Standardmethode zur mikrobiellen Gattung und Art Identifizierung zu sein 2. Spezies Identifizierung wird auf die Aufzeichnung von kleinen Protein Fingerabdrücke von intakten Zellen oder Zell-Lysaten basiert. Der typische Massenbereich für eine Masse in der klinischen Routine Mikrobiologie verwendeten Spektrometer 2-20 kDa. Zusätzlich kann die resultierenden Spektren verwendet werden , Stämme bei den unten Spezies und unter subspecies Ebene 3 zu unterscheiden. Frühe Pionier Studien haben spezifische Biomarker - Ionen für eine bestimmte Untergruppe von Stämmen in Campylobacter jejuni 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica Serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7 bis 9, und Escherichia coli 10 bis 12. Die Kombination mehrerer variabler Biomarkers Massen allelische Isoformen entsprechenden bietet die Möglichkeit, für tiefere Subtyping. Früher führten wir erfolgreich eine Methode , um diese Variationen in Massenprofile in aussagekräftige und reproduzierbare phyloproteomic Beziehungen Massenspektrometrie phyloproteomics (MSPP) auf einem C genannt zu konvertieren jejuni ssp. jejuni - Isolat Sammlung 13. MSPP eine massenspektrometrische äquivalent zu DNA-Sequenz basiert Subtyping Techniken wie multilocus Sequenz Typisierung (MLST) verwendet werden. Campylobacter - Arten sind die Hauptursache von bakterieller Gastroenteritis weltweit 14, 15. Als Folge der Campylobacteriosis postinfektiöse sequela, nämlich Guillain Barré - Syndrom, reaktive Arthritis und entzündlicher Darmerkrankung kann 16 entstehen. Die Hauptinfektionsquellen sindkontaminiertes Tierfleisch aus Huhn, Pute, Schwein, Rind, Schaf und Enten, Milch und Oberflächenwasser 15, 17. regelmäßige epidemiologische Überwachung Studien im Zusammenhang mit der Lebensmittelsicherheit sind daher notwendig. MLST ist der &quot;Goldstandard&quot; in der molekularen Typisierung für Campylobacter - Arten 18. Weil die Sanger-Sequenzierung basiert MLST Verfahren ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig und relativ teuer ist MLST typing auf relativ kleine Isolat Kohorten beschränkt. Daher besteht ein Bedarf an preiswerter und schneller Subtypisierung Methoden. Dieser Bedarf könnte durch massenspektrometrische Methoden wie MSPP erfüllt werden. In diesem Beitrag wird ein ausführliches Protokoll für MSPP-Typisierung eine Sammlung von Campylobacter jejuni ssp. Doylei Isolate und Vergleich seines Potentials mit MLST.

<table><tbody><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex III TOF/TOF 200 System</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>GT02554 G201</td><td>Massenspektrometer</td></tr><tr><td>bakterieller Teststandard BTS</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>263564</td><td>Softwarepaket</td></tr><tr><td>Bruker IVD Bakterial Test Standard</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>8290190</td><td>5 Röhrchen</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolieren&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; Stamm 093</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350; CCUG 18265; Kasper, 71; LMG 8219; NCTC 11847</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolieren&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, Belgien</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>Columbia Agar base&nbsp;</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.10455 .0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kompass für FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>251419</td><td>Softwarepaket</td></tr><tr><td>defibriertes Schafsblut&nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Deutschland</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>02854 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>HCCA-Matrix</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Papiertaschentuch</td><td>Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td></td><td></td>Z188956</tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>259935</td><td>Softwarepaket</td></tr><tr><td>Mast Cryobank Fläschchen</td><td>Mast Diagnostica, Reinfeld, Deutschland</td><td>CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 polierter Stahl Target</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes Humaninsulin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, molekularbiologisches</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

subtyping von<em&gt; campylobacter jejuni</em&gt; ssp.<em&gt; doylei</em&gt; massen isolaten spectrometry-basierte phyloproteomics (mspp)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF-MS bietet die Möglichkeit, einige Bakterien nicht nur auf die Art und Unterart Ebene zu unterscheiden, sondern auch unten auf Stammebene. Allelische Isoformen der nachweisbaren Biomarker-Ionen führen zu Isolat-spezifische Massenverschiebungen. Die Massenspektrometrie-basierte phyloproteomics (MSPP) ist eine neuartige Technik, die die massenspektrometrische nachweisbar Biomarkers Massen in einem System kombiniert, das Abzug von phyloproteomic Beziehungen von Isolat spezifischen Massenverschiebungen im Vergleich zu einem Genom-Referenzstamm sequenziert werden kann. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden dann verwendet, MSPP Basis Dendrogramme zu berechnen. Hier beschreiben wir den Workflow von MSPP durch eine Campylobacter jejuni ssp eingeben. Doylei Isolat Sammlung von sieben Stämme. Alle sieben Stämme waren menschlichen Ursprungs und multilocus Sequenz Typisierung (MLST) ihre genetische Vielfalt unter Beweis gestellt. MSPP-Typisierung ergab sieben verschiedene Typen MSPP Sequenz, ausreichend ihre phy reflektierendenlogenetic Beziehungen. Die C. jejuni ssp. doylei MSPP Schema 14 verschiedene biomarker Ionen enthält, meistens ribosomalen Proteine in dem Massenbereich von 2-11 kDa. MSPP kann im Prinzip, mit einem erweiterten Massenbereich zu anderen massenspektrometrischen Plattformen angepasst werden. Daher hat diese Technik das Potenzial, ein nützliches Werkzeug für die Stammebene mikrobielle Typisierung zu werden.

Früher haben wir erfolgreich ein MSPP Schema für C einstellt jejuni ssp. jejuni 13. Hier wollten wir die Methode zu erweitern , um die Geschwister C. Unterart jejuni ssp. doylei. In dieser speziellen Einstellung, sieben C. jejuni ssp. doylei Isolate wurden von der belgischen Sammlung von Mikroorganismen / Labor für Mikrobiologie UGent BCCM / LMG Gent, Belgien erworben. Alle sieben Isolate für unsere Analys...

Die Massenspektrometrie-basierte phyloproteomics (MSPP) wurde verwendet , um eine Sammlung von Campylobacter jejuni ssp geben. Doylei isoliert auf Stammebene im Vergleich zu multilocus Sequenz Typisierung (MLST).

Subtyping von<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Massen Isolaten Spectrometry-basierte PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Das übergeordnete Ziel dieses massenspektrometrischen Verfahrens, das als MSPP oder Massenspektrometrie-basierte PhyloProteomik bezeichnet wird, ist die Subtypisierung von Bakterien auf der Ebene des Stammes. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen in den Bereichen Mikrobiologie, Epidemiologie und Hygiene zu beantworten. Beispielsweise lässt sich damit eine Ausbruchssituation analysieren, indem die phyloproteomische Verwandtschaft visualisiert wird.Im Vergleich zu anderen Typisierungsmethoden ist MSPP kostengünstig pro Probe und sehr schnell. Krankenhausinfektionen stellen ein Problem von wachsender Bedeutung dar, und wir hoffen, dass unser MSPP-Schema auf die epidemiologische Typisierung anderer Bakterien oder sogar von Pilzen ausgeweitet werden kann. Unser MSPP-Schema liefert Einblicke in die Verwandtschaft von Stämmen. Daher ist es sinnvoll, es dort anzuwenden, wo relevante Phänotypen – wie Arzneimittelresistenz oder sogar Virulenz – mit bestimmten Genotypen korrelieren.Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie zwei Reagenzgläser mit Matrixlösung vor, indem Sie 2,5 Milligramm HCCA in 250 Mikroliter einer organischen Lösungsmittelmischung, bestehend aus 50 % Acetonitril, lösen. Geben Sie rekombinantes humanes Insulin als internen Kalibrator zu einem der beiden hinzu, gefolgt von 47,5 % zweifach destilliertem Wasser und 2,5 % Trifluoressigsäure. Anschließend streichen Sie eine erbsengroße Menge einer Kolonie des Referenzstamms direkt auf eine MALDI-Target-Platte auf.Zur Bestimmung der exakten Masse des Kalibrierungssignals pipettieren Sie einen Mikroliter Teststandard auf eine andere Stelle. Überlagern Sie jeden Bakterientropfen und den Standard mit je einem Mikroliter HCCA-Matrixlösung und lassen Sie die Tropfen bei Raumtemperatur kristallisieren. Wiederholen Sie die Abstrichpräparation für jeden zu analysierenden Stamm.Überlagern Sie jeden Punkt mit 1 Mikroliter der angereicherten HCCA-Matrixlösung und lassen Sie diese bei Raumtemperatur kristallisieren. Alternativ können Proteine aus schwer zu lysierenden Zellen extrahiert werden. Dazu ernten Sie etwa 5 Kolonien mit einer Inokulationsöse aus einer Agar-Plattenkultur.Suspendieren Sie sie in 300&nbsp;Mikroliter doppelt destilliertem Wasser in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen und mischen Sie gründlich durch mehrmaliges Pipettieren, bis die bakteriellen Kolonien vollständig suspendiert sind. Geben Sie anschließend 900&nbsp;Mikroliter absolutes Ethanol hinzu und mischen Sie erneut. Zentrifugieren Sie die Probe bei 13.000&nbsp;g für 1&nbsp;Minute.Nach dem Trocknen des Pellets dieses durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in 50 µL 70%iger Ameisensäure resuspendieren. Anschließend 50 µL Acetonitril hinzufügen und mischen. Die Partikel durch Zentrifugation bei 13.000 ×g für 2 Minuten entfernen.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, übertragen Sie 1 Mikroliter der oben genannten Überstandslösung auf eine Probenposition einer MALDI-Target-Platte. Nach dem Trocknen der Probe überlagern Sie jeden Fleck mit einem Mikroliter HCCA-Matrixlösung und lassen die Kristallisation bei Raumtemperatur erfolgen. Führen Sie anschließend die MALDI-TOF-Analyse durch, indem Sie für jeden Fleck 600 Spektren in Schritten von jeweils 100 Aufnahmen sammeln.Klicken Sie zuerst auf den Reiter „Automatische Ausführung“ in der Konfigurationssoftware des Massenspektrometers. Öffnen Sie die Methode, indem Sie die Methodenschaltfläche mit der linken Maustaste anklicken und die Methode aus dem Dropdown-Menü auswählen. Klicken Sie anschließend links auf die Bearbeitungsschaltfläche, um den Editor für die automatische Ausführungsmethode zu öffnen.Legen Sie im Register „Accumulation“ den zufriedenstellenden Shot-Wert auf 100 und den Summenwert auf 600 fest. Wählen Sie für jedes Spektrum den Kalibrierpeak aus der Liste aus, klicken Sie auf „Automatisch zuweisen“ und bestätigen Sie mit „OK“. Nachdem Massenspektren von jedem Spot erhalten wurden, bestimmen Sie experimentell die exakte Masse des Kalibrierpeaks, indem Sie ein Spektrum mit dem Spektrumbrowser öffnen und den Peak bei der erwarteten Masse im Vergleich zu einem Spektrum ohne Kalibrierstandard identifizieren. Stellen Sie sicher, dass der Kalibrierpeak nicht durch einen anderen Biomarker des interessierenden Organismus überlagert wird.Berechnen Sie anhand der Genomsequenzierungsdaten des Referenzstamms das theoretische monoisotopische molekulare Gewicht jedes kodierten Proteins, indem Sie die DNA-Sequenz in die entsprechende Aminosäuresequenz übersetzen. Laden Sie die Datei hoch oder kopieren und fügen Sie die Proteinsequenz in das Eingabefeld des entsprechenden bioinformatischen Ressourcenbereichs ein und berechnen Sie den theoretischen isoelektrischen Punkt sowie das molekulare Gewicht. Kopieren Sie die Ergebnisse in eine Tabellenkalkulation, wobei eine Spalte den Genidentifikator und eine andere Spalte das molekulare Gewicht enthält.Sortieren Sie die Zeilen nach dem berechneten molekularen Gewicht, um die Suche nach Massen zu erleichtern. Fügen Sie eine zusätzliche Spalte in die Tabelle für das molekulare Gewicht der demathianinierten Form ein, indem Sie 135 Da vom monoisotopen molekularen Gewicht abziehen. Weisen Sie jeder gemessenen Hauptbiomarker-Masse die berechneten Massen des Referenzstamms zu, indem Sie die gemessene Masse in der Genomtabelle nachschlagen.Notieren Sie in einer anderen Tabelle die Masse und die Kennung für jedes Biomarker-Ion. Kalibrieren Sie nun die Massenspektren, die aus den gesammelten Isolaten gewonnen wurden, wie bereits für den Referenzstamm durchgeführt. Identifizieren Sie für jedes Isolat pro Zeile varianten Biomarker in den Massenspektren, und tragen Sie die gemessene Masse für jeden Biomarker sowie das vorhergesagte Isoform in die jeweiligen Spalten ein.Das MALDI-TOF-Massenspektrum von C-Jejuni Subspecies doylei ATCC 49349 enthält 14 einfach geladene Biomarker-Ionen, die durch Vergleich der berechneten molekularen Massen mit dem Referenzspektrum identifiziert werden konnten. Innerhalb der Sammlung wurden für L32 ohne Methionin, L33 und das hypothetische Protein, das durch gil152939117 kodiert wird, sowie für S20 M und S15 M unterschiedliche Isoformen nachgewiesen. Die verbleibenden Massen, die Biomarker-Ionen zugeordnet wurden, waren in den getesteten Isolaten unveränderlich. Die der Massenverschiebung entsprechende Aminosäuresubstitution wurde durch PCR-Amplifikation und Sanger-Sequenzierung des jeweiligen Gens mit den hier aufgelisteten Primern identifiziert.Die Aminosäuresequenzen aller im MSPP-Schema enthaltenen Biomarkerionen sowie der nachgewiesenen allelischen Isoformen sind hier angegeben. Das auf MLST basierende UPGMA-Dendrogramm, das aus den untersuchten C jejuni subsp. doylei-Isolaten erstellt wurde, zeigt, dass jedes Isolat zu einem anderen MLST-Sequenztyp gehört. Der Stamm LMG7790 weist den größten phylogenetischen Abstand auf.Wie bei der MLST-Analyse zu sehen ist, weist der Isolat LMG7790 den größten phyloproteomischen Abstand in der MSPP-Analyse der untersuchten C jejuni-Subspezies doylei auf. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie innerhalb eines Tages durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Toxizität einiger während des Experiments verwendeter Substanzen zu berücksichtigen.Beispielsweise kann Acetonitril Hautreizungen verursachen. Außerdem können neben der MSPP weitere Methoden wie die DNA-Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Parameter zu analysieren, beispielsweise das Vorhandensein von Resistenzgenen. Die Entwicklung dieser Technik eröffnet Forschern auf dem Gebiet der Mikrobiologie neue Möglichkeiten, die Photogenie zu erforschen.Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie MSPP funktioniert und wie es auf spezifische Fragestellungen angewendet werden kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit gefährlichen Krankheitserregern äußerst riskant sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von S2-Laborausrüstung stets getroffen werden sollten.

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Forschung

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Genetik

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Kulturmethoden zur Bestimmung der Grenze der Detektion und des Überlebens in Transportmedien von Campylobacter Jejuni in humanen Fäkalproben

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Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

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Charakterisierung eines pathogenen Escherichia coli-Stammes aus Oreochromis spp. Farmen mit Ganzgenomsequenzierung

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Nachweis und Isolierung von Campylobacter spp. aus rohem Fleisch

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