Methoden für die akute und subakute Murine hindlimb Ischemia

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Modellierung der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit beim Menschen durch das Platzieren von Nähten oder Ameroid-Konstriktoren an der Oberschenkelarterie der Maus zur Induktion einer akuten bzw. subakuten Ischämie der Hintergliedmaßen. Die periphere arterielle Verschlusskrankheit ist ein wichtiges klinisches Problem, und diese Techniken wurden unter Verwendung von Tiermodellen entwickelt, um die menschliche Krankheit besser darzustellen. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass die Schwere und der Zeitpunkt des Auftretens einer Ischämie der Gliedmaßen vom Prüfarzt kontrolliert werden können.

Mike Padgett, ein Techniker aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Bestätigen Sie ein bis zwei Tage vor dem Eingriff, dass die Maus vollständig sediert ist, da sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagiert, und tragen Sie Augensalbe auf. Verwenden Sie anschließend einen kleinen elektrischen Trimmer, um die Haare von beiden Hinterbeinen zu rasieren.

Wenn alle Haare getrimmt sind, tragen Sie vorgewärmte Haarentfernungscreme auf. Wischen Sie die Creme nach einer Minute vorsichtig mit einem angefeuchteten Mullpad ab. Legen Sie die Maus dann in einen leeren, mit Papiertuch ausgekleideten Aufspannkäfig, bis sie in der Lage ist, die sternale Liege aufrecht zu erhalten.

Legen Sie die vollständig sedierte Maus am Tag der Operation in Rückenlage unter ein technisches Stereo-Dissektionsmikroskop und fixieren Sie beide Beine mit chirurgischem Klebeband. Wenn ein temperaturgesteuertes Heizkissen verwendet wird, befestigen Sie den Temperaturfühler und befestigen Sie den Fühler mit chirurgischem Klebeband an der Basis der Operationsplattform. Verwenden Sie anschließend drei abwechselnd Povidon-Jod- und Alkoholtücher, um die Operationsstelle zu reinigen, und decken Sie das Tier mit einem sterilen OP-Tuch mit einem Loch an der Inzisionsstelle ab.

Machen Sie mit einem Skalpell einen ersten Schnitt entlang der Mitte des medialen Oberschenkels vom Knie zum Bauch. Verlängern Sie dann mit einer feinen Schere den Schnitt auf etwa einen Zentimeter. Öffnen Sie mit einer Pinzette den Schnitt, um die Membran freizulegen, die das Leistenfettgewebe bedeckt.

Dann dringen Sie mit einer geschlossenen Pinzette durch die Membran in den Raum zwischen dem Fettgewebe und dem Bauch. Lassen Sie den Druck auf die Pinzette sanft los, um das Fettgewebe von den Bauchmuskeln zu trennen und das neurovaskuläre Bündel freizulegen. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass die großen Blutgefäße und ihre Äste vor der Dissektion des neurovaskulären Bündels richtig identifiziert werden.

Variationen in der Lokalisation der Konstriktoren oder der Ligaturstellen können den Schweregrad der Ischämie signifikant verändern und zu einer erheblichen Variabilität der Ergebnisse führen. Führen Sie einen Retraktor in den Schnitt ein und ziehen Sie das Bauchgewebe in Richtung des Kopfes des Tieres, um die proximale Ameroid-Constrictor-Stelle freizulegen, die sich genau proximal der Zirkumflex-Oberschenkelarterie befindet. Führen Sie dann einen medialen und einen lateralen Retraktor in den distalen Teil des Schnitts ein, um das Operationsfeld zu erweitern und das leistende Fettgewebe in Richtung Fuß und weg von der Operationsstelle zu ziehen.

Die proximalen und oberflächlichen kaudalen Äste der Arteria femoralis sollten leicht beobachtet werden. Die Arteria femoralis lateralis befindet sich etwa fünf Millimeter proximal der kaudalen Äste und kann durch eine Membran verdeckt sein. Schieben Sie nun vorsichtig die Spitze einer Pinzette unter die Membran, die die Gefäße miteinander verbindet, um 1/2 der Spitze zwischen Vene und Arterie einzuführen.

Dann zwickt er die Membran und reißt sie sanft weg. Wenn die gesamte Membran entfernt wurde, führen Sie die Spitze der geschlossenen Pinzette zwischen Vene und Arterie ein und lassen Sie den Druck auf die Pinzette los, um einen Spalt zwischen den Gefäßen zu schaffen. Bei subakuter Ischämie der Extremitäten schieben Sie die Spitze der Pinzette unter die Oberschenkelarterie, um das Gefäß vom neurovaskulären Bündel zu isolieren.

Verwenden Sie eine zweite abgewinkelte Pinzette, um den Rand der Würgeschlange zu greifen, und führen Sie die Würgeschenge unter der Oberschenkelarterie hindurch. Legen Sie dann die Arterie in den Constrictor-Schlitz. Positionieren Sie als nächstes den distalen Konstriktor auf der Oberschenkelarterie unmittelbar proximal an der Stelle, an der sich die Arterie in die Kniekehle und die Arteria saphena gabelt, und platzieren Sie die Oberschenkelarterie in den Konstriktorschlitz.

Bei akuter Ischämie der Gliedmaßen fädeln Sie eine 7-0-Naht unter die Arterie an der gleichen Position wie der proximale Konstriktor und ligieren Sie die Arterie. Binden Sie dann eine zweite Ligatur etwa einen Millimeter distal an die erste und durchtrennen Sie mit einer Federschere die Arterie zwischen den beiden Ligaturen. Für die distale arterielle Durchtrennung platzieren Sie die Ligaturen etwa einen Millimeter voneinander entfernt, genau proximal an der Stelle, an der sich die Arteria femoralis in die Arteria poplitea und saphena gabelt.

Schließen Sie dann den Schnitt mit unterbrochenen Fünf-0-Vicryl-Nähten und bewegen Sie die Maus auf ein 37 Grad Celsius heißes Heizkissen unter einem Laser-Doppler-Perfusions-Imager. Schalten Sie nun den Imager ein und starten Sie die Bildaufnahmesoftware. Klicken Sie auf das Symbol Neues Einzelbild, um das Setup-Fenster des Scanners zu öffnen, und stellen Sie die Scangröße auf groß und die Scangeschwindigkeit auf vier Millisekunden pro Pixel ein.

Ändern Sie die X- und Y-Werte im Bereich "Einheiten des Scanbereichs" in die entsprechenden Werte, klicken Sie dann auf die Registerkarte "Video und Entfernung" und ordnen Sie beide hinteren Gliedmaßen im Scanbereich an. Klicken Sie auf "Automatischer Abstand" und dann auf "Weiter", um das Fenster "Motivdetails" zu öffnen, und geben Sie die Motivinformationen ein. Klicken Sie auf Weiter, um zum Scanfenster zu gelangen.

Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Messung starten, um das Dialogfeld Scanabstand bestätigen oder überschreiben zu öffnen, und klicken Sie auf OK, um den Scanvorgang zu starten. Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, bewegen Sie die Maus in einen leeren Wiederherstellungskäfig mit Überwachung, bis er vollständig wiederhergestellt ist. Zusätzlich zu den Schwankungen, die Tierversuchen inhärent sind, können andere Faktoren zu Variabilität innerhalb der Laser-Doppler-Perfusionsbildgebung führen, darunter die Körpertemperatur und die Position des Tieres.

Das Modell der subakuten Ischämie der hinteren Gliedmaßen hängt von der Qualität der ameroiden Konstriktoren ab, die innerhalb einer bestimmten Charge stark variieren kann. Die Laser-Doppler-Perfusionsbildgebung sollte unmittelbar nach dem Eingriff durchgeführt werden, während das Tier noch anästhesiert ist, um die Auswirkungen der Operation zu demonstrieren und ein postoperatives Perfusionsniveau zu etablieren. Ein vollständiger Verlust der Perfusion der Hintergliedmaßen sollte nach der Induktion einer akuten Ischämie der Extremitäten beobachtet werden, während nach der Platzierung des Ameroid-Constrictors im subakuten Modell typischerweise nur eine leichte Abnahme der Perfusion beobachtet wird.

Diese Verfahren ermöglichen die Erforschung der Auswirkungen unterschiedlicher Ischämie auf den Gefäßumbau und die Regeneration der Skelettmuskulatur bei der Maus als Modell der humanen peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Einmal gemeistert, können diese Verfahren in etwa 15 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie korrekt ausgeführt werden. Bei diesen Operationen ist es wichtig, daran zu denken, die Körpertemperatur und die Angemessenheit der Anästhesie beim Tier kontinuierlich zu überwachen.

Durch die Anpassung der Platzierung der Ligaturen oder der Konstriktoren kann der Schweregrad der ischämischen Verletzung verändert werden, was je nach genetischem Hintergrund des Tieres oder dem Vorhandensein kardiovaskulärer Risikofaktoren eine wichtige Variable sein kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man sowohl eine akute als auch eine subakute Ischämie der Hintergliedmaßen bei der Maus induziert und die Gefäßanatomie definiert, um ein ordnungsgemäßes Ergebnis und die Reproduzierbarkeit des Eingriffs zu gewährleisten.