Methoden für die akute und subakute Murine hindlimb Ischemia

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die periphere arterielle Verschlusskrankheit des Menschen zu modellieren, indem Nähte oder ameroidale Konstriktoren an der femoralen Arterie der Maus platziert werden, um akute bzw. subakute Ischämie der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die periphere arterielle Verschlusskrankheit ist ein wichtiges klinisches Problem, und diese Techniken unter Verwendung von Tiermodellen wurden entwickelt, um die menschliche Erkrankung besser abzubilden. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass der Schweregrad und der Zeitpunkt des Auftretens der Gliedmaßenischämie vom Untersucher kontrolliert werden können.

Den Versuch wird Mike Padgett, ein Techniker aus meinem Labor, demonstrieren. Ein bis zwei Tage vor dem Eingriff überprüfen Sie, ob die Maus vollständig sediert ist, indem Sie feststellen, dass sie nicht auf eine Zehenquetschung reagiert, und tragen Augensalbe auf. Anschließend benutzen Sie einen kleinen elektrischen Rasierer, um das Haar an beiden Hinterbeinen abzurasieren.

Wenn das gesamte Fell abgeschnitten wurde, tragen Sie eine vorgewärmte Enthaarungscreme auf. Nach einer Minute entfernen Sie die Creme vorsichtig mit einem angefeuchteten Mulltupfer. Danach stellen Sie die Maus in einen leeren, mit Papiertüchern ausgelegten Erholungskäfig, bis sie die Brustlage stabil halten kann.

Am Tag der Operation wird die vollständig sedierte Maus in Rückenlage unter ein technisches Stereomikroskop gelegt und beide Beine mit Operationspflaster fixiert. Falls ein temperaturgeregelter Heizkissen verwendet wird, befestigen Sie die Temperatursonde und sichern Sie diese mit Operationspflaster am Untergrund der Operationsplattform. Anschließend wird der Operationsbereich mit drei abwechselnden Abreibungen aus Povidon-Iod und Alkohol gereinigt und das Tier mit einem sterilen Operationsfeld abgedeckt, das eine Öffnung an der Schnittstelle aufweist.

Erstellen Sie mit einem Skalpell einen ersten Schnitt entlang der Mitte der Innenseite des Oberschenkels vom Knie in Richtung Bauch. Verlängern Sie den Schnitt anschließend mit feiner Schere auf etwa einen Zentimeter. Öffnen Sie den Schnitt mit einer Pinzette, um die Membran freizulegen, die das Leistenfettgewebe bedeckt.

Verwenden Sie dann geschlossene Pinzetten, um durch die Membran in den Raum zwischen dem Fettgewebe und dem Bauch zu stechen. Lösen Sie vorsichtig den Druck auf die Pinzetten, um das Fettgewebe von den Bauchmuskeln zu trennen, wodurch das neurovaskuläre Bündel freigelegt wird. Es ist entscheidend, dass die großen Blutgefäße und ihre Seitenäste vor der Präparation des neurovaskulären Bündels korrekt identifiziert werden.

Abweichungen in der Position der Konstriktoren oder den Ligationsstellen können die Schwere der Ischämie erheblich verändern und zu einer beträchtlichen Variabilität der Ergebnisse führen. Führen Sie einen Retraktor in den Schnitt ein und ziehen Sie das Bauchgewebe in Richtung des Tierkopfes, um die proximale Stelle des ameroiden Konstriktors freizulegen, die sich unmittelbar proximal zur Arteria circumflexa femoris lateralis befindet. Anschließend bringen Sie einen medialen und einen lateralen Retraktor in den distalen Teil des Schnittes ein, um das Operationsfeld zu verbreitern, und ziehen das Leistenfettgewebe in Richtung der Fußseite und vom Operationsbereich weg.

Die proximalen und oberflächlichen kaudalen Äste der Arteria femoralis sollten leicht zu erkennen sein. Die Arteria circumflexa femoris lateralis befindet sich etwa fünf Millimeter proximal zu den kaudalen Ästen und kann durch Membran bedeckt sein. Gleiten Sie nun vorsichtig mit der Spitze einer Pinzette unter die Membran, die die Gefäße zusammenhält, um die Hälfte der Spitze zwischen Vene und Arterie einzuführen.

Dann schließen Sie die Pinzette und entfernen vorsichtig die Membran. Sobald die gesamte Membran entfernt ist, führen Sie die Spitze der geschlossenen Pinzette zwischen Vene und Arterie ein und lösen den Druck auf die Pinzette, um einen Spalt zwischen den Gefäßen zu erzeugen. Bei subakuter Extremitätenischämie schieben Sie die Spitze der Pinzette unter die A. femoralis, um das Gefäß vom neurovaskulären Bündel zu isolieren.

Verwenden Sie eine zweite Pinzette mit abgewinkelten Spitzen, um die Kante des Konstriktors zu greifen, und führen Sie den Konstriktor unter die Arteria femoralis. Legen Sie dann die Arterie in den Schlitz des Konstriktors. Positionieren Sie anschließend den distalen Konstriktor an der Arteria femoralis unmittelbar proximal zu der Stelle, an der sich die Arterie in die Arteria poplitea und die Arteria saphena aufteilt, und führen Sie die Arteria femoralis in den Konstriktorschlitz ein.

Bei akuter Extremitätenischämie führen Sie eine 7-0-Naht unterhalb der Arterie an der gleichen Stelle wie der proximale Konstriktor ein und ligieren die Arterie. Danach setzen Sie eine zweite Ligatur etwa einen Millimeter distal zur ersten und durchtrennen die Arterie mit einer Federschere zwischen den beiden Ligaturen. Für die distale arterielle Durchtrennung platzieren Sie die Ligaturen etwa einen Millimeter voneinander entfernt, unmittelbar proximal zur Stelle, an der die Arteria femoralis in die Arteria poplitea und die Arteria saphena bifurziert.

Danach die Inzision mit unterbrochenen Vicryl-Nähten der Stärke 5-0 verschließen und die Maus auf eine Heizplatte mit 37 Grad Celsius unter einem Laser-Doppler-Perfusionsbildgeber bringen. Schalten Sie nun den Bildgeber ein und starten Sie die Aufnahmesoftware. Klicken Sie auf das Symbol „Neues Einzelbild“, um das Scanner-Einrichtungsfenster zu öffnen, und stellen Sie die Scan-Größe auf groß und die Scan-Geschwindigkeit auf vier Millisekunden pro Pixel ein.

Ändern Sie die Werte für X und Y im Bereich Scan-Flächeneinheiten auf die entsprechenden Werte, klicken Sie dann auf die Registerkarte Video und Distanz und positionieren Sie beide Hintergliedmaßen innerhalb des Scan-Bereichs. Klicken Sie auf Automatische Distanz, dann auf Weiter, um das Fenster mit den Versuchspersonendaten zu öffnen, und geben Sie die Informationen zur Versuchsperson ein. Klicken Sie auf Weiter, um zum Scan-Fenster zu wechseln.

Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Messung starten“, um das Dialogfeld „Scan-Abstand bestätigen oder überschreiben“ zu öffnen, und klicken Sie auf „OK“, um den Scanvorgang zu starten. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, bewegen Sie die Maus in einen leeren Erholungskäfig und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig erholt hat. Neben den inhärenten Variationen bei Tierversuchen können weitere Faktoren Variabilität in der Laser-Doppler-Perfusionsbildgebung verursachen, darunter die Körpertemperatur und die Position des Tieres.

Das subakute Hintergliedmaßen-Ischämie-Modell hängt von der Qualität der Ameisenring-Konstriktoren ab, die innerhalb einer Charge stark variieren kann. Die Laser-Doppler-Perfusionsbildgebung sollte unmittelbar nach dem Eingriff durchgeführt werden, während das Tier noch anästhesiert ist, um die Auswirkungen der Operation zu demonstrieren und ein Basisniveau der postoperativen Perfusion zu etablieren. Nach der Induktion einer akuten Gliedmaßenischämie sollte ein vollständiger Verlust der Hintergliedmaßen-Perfusion beobachtet werden, wohingegen nach der Platzierung des Ameisenring-Konstriktors im subakuten Modell typischerweise nur eine leichte Verminderung der Perfusion festzustellen ist.

Mithilfe dieser Verfahren lässt sich die Wirkung unterschiedlicher Ausprägungen einer Ischämie auf die Gefäßremodelierung und Regeneration der Skelettmuskulatur bei der Maus als Modell für die periphere arterielle Verschlusskrankheit beim Menschen untersuchen. Wenn man einmal Erfahrung mit diesen Verfahren gesammelt hat, können sie bei korrekter Durchführung in etwa 15 Minuten abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieser Operationen ist es wichtig, stets die Körpertemperatur und die Angemessenheit der Anästhesie beim Tier zu überwachen.

Indem die Platzierung der Ligaturen oder Konstriktoren angepasst wird, kann das Ausmaß der ischämischen Verletzung modifiziert werden, was eine wichtige Variable darstellen kann, abhängig vom genetischen Hintergrund des Tieres oder dem Vorhandensein kardiovaskulärer Risikofaktoren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man sowohl eine akute als auch eine subakute Hintergliedmaßenischämie bei der Maus induziert, und wie man die vaskuläre Anatomie bestimmt, um ein korrektes Ergebnis und die Reproduzierbarkeit des Verfahrens sicherzustellen.