Name: Methoden für die akute und subakute Murine hindlimb Ischemia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur akuten und subakuten Hinterbeinischämie bei Mäusen durch Ameroid-Konstriktoren an der Femoralarterie. Dieses Modell ermöglicht kontrollierte Studien zur Angiogenese und peripheren arteriellen Verschlusskrankheit.

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Diese Studie wurde durch NIH-Zuschüsse R21HL118661, R56HL124444 und R01HL124444 an CDK und durch NIH-Zuschüsse R00HL103797 und R01HL125695 an JMM unterstützt.

Alle Tierversuche wurden gemäß dem Protokoll vom Herzog Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt. Männliche Mäuse wurden in dieser Studie verwendet, obwohl beiderlei Geschlechts verwendet werden, wie für den wissenschaftlichen Zweck der Studie angegeben. 1. Haarentfernung <ol><li> Vor der Einleitung der Narkose, eine präoperative Vorbereitungsbereich, bestehend aus einem abgedeckten Heizkissen gesetzt bei 37 ° C und einer nosecone Port angeschlossen kontinuierlichen Fluss von Isofluran eingerichtet. </li><li> Platzieren Sie die Maus in der Anästhesie Induktionskammer. Stellen Sie den O 2 Durchflussmesser auf 1 l / min und Isofluran auf 1 - 3%. HINWEIS: Anesthesia wird typischerweise in einer 25 g Maus mit 2% Isofluran induziert. </li><li> Überprüfen Sie die Reizantwort der Maus, indem Sie vorsichtig die Kammer Schaukeln und einen Mangel an einem aufrichtenden Reflex zu beobachten. </li><li> Spülen Sie die Kammer mit O 2 zu deaktivieren Sie die Isofluran vor dem Öffnen. bewegen Sie schnell die Maus an die Heizung pAnzeige und schließen Sie es über den nosecone zu Isofluran. </li><li> Stellen Sie die Isofluran auf 1,5%. Überprüfen Sie die Reizantwort durch Pedal Reflex (toe Prise). </li><li> Bewerben ophthalmische Schmiermittel großzügig auf beiden Augen Trocknen während der Operation zu vermeiden. </li><li> Rasieren Sie die Haare von beiden Hinterbeine einen kleinen elektrischen Trimmer. Halten Sie die straffe Haut während der Rasur zerreißt die Haut zu vermeiden. </li><li> Bewerben vorgewärmten Enthaarungscreme und lassen für 1 Minute sitzen. mit einem angefeuchteten Gazeauflage vorsichtig abwischen. </li><li> Für chirurgische Verfahren zu einem späteren Zeitpunkt, drehen Sie die Isofluran und bewegen Sie die Maus auf einen leeren Papiertuch gesäumten Erholungskäfig aus die Maus, um sicherzustellen, ist der Käfig Bettwäsche nicht ansaugen. Überwachen Sie das Tier, bis es in der Lage ist Brustlage zu halten. Andernfalls die Maus an den OP-Tisch zu bewegen. HINWEIS: Die Haarentfernung Prozess kann die Haut reizen und Perfusions - Messungen beeinflussen. Es wird empfohlen, 1 bis warten - 2 Tage nach den Tierhaaren vor p Entfernenerforming eine präoperative Perfusion Scan oder eine Operation durchgeführt wird. </li></ol> 2. Pre-OP-Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Werkzeuge während dieses Verfahrens; kleine gerade chirurgische Scheren, zwei fein kippte abgewinkelte Pinzette, kleine Graefe Pinzetten, Nadeltreiber Zange, 3 Retraktoren, kleine Feder Schere und fein kippte Wattestäbchen. </li><li> Sterilisieren alle Werkzeuge, einen Autoklaven vor dem Beginn der Operation verwendet wird. Verwenden eines Heiß bead Sterilisator vor und zwischen jedem chirurgischen Verfahren, für bis zu 5 Tieren. Sterilisieren zusätzliche chirurgische Werkzeug-Pakete für Operationen von Gruppen mit mehr als 5. </li><li> Bereiten Sie einen sterilen OP-Bereich, bestehend aus einer überdachten Heizkissen und einer Isofluran-Port. Alle Arbeiten im Rahmen eines 10-Stereo-Präpariermikroskop. </li><li> Anesthetize und die Maus herzustellen, wie in den Schritten 1.1 bis 1.5 beschrieben. </li><li> Überprüfen Sie, ob die Maus vollständig sediert und in einen Rückenlage auf dem OP-Tisch. Sichern Sie beide Beine chirurgische Klebeband. &lt;/ Li&gt; <li> Wenn ein temperaturgesteuertes Heizkissen verwendet, den Temperaturfühler befestigen und an der Basis der chirurgischen Plattform befestigen chirurgisches Band verwendet, um sicherzustellen, dass es nicht versehentlich während des Verfahrens herausgezogen werden. </li><li> Reinigen Sie die Inzisionsstelle mit 3 Wechsel Povidon-Iod und Alkoholtupfer. Decken Sie das Tier mit einem sterilen Operationstuch und schneiden Sie ein Loch, um die Einschnittstelle zu belichten. </li></ol> 3. Induktion von Limb Ischemia <ol><li> Verwenden Sie ein Skalpell einen anfänglichen Schnitt entlang der Mitte des medialen Oberschenkel zu machen, vom Knie in Richtung Bauch läuft, und verlängern den Schnitt auf etwa 1 cm mit einer feinen Schere (Abbildung 1A). </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig1.jpg" /> Abbildung 1. Operationsstelle und Gefäß Anatomische Leitstrukturen für Maus hindlimb Ischemia Chirurgie. (A) Außenansichtdie hinteren Gliedmaßen einer Maus in der Rückenlage. Die gestrichelte Linie zeigt die Einschnittstelle , um richtig die hinteren Gliedmaßen Ischämie Verfahren durchführen. (B) Ansicht des proximalen Maus hindlimb Gefäße. Das proximale Ende der Femoralarterie (FA) entsteht, von unterhalb des Leistenbandes (IL). Das distale Ende des FA ist an seinem Gabelung in die A. poplitea (PA) und die Saphena-Arterie (SA) angeordnet ist. Die Haupt Kollateralarterien aus der FA sind die seitlichen circumflex Femoralarterie (LCFA), der proximal caudal Femoralarterie (pCFA) und die oberflächliche caudal epigastric Arterie (SCEA). Die Oberschenkelvene (FV) läuft zum FA benachbarten und venösen Zweige können zu den großen Arterienäste parallel zu sehen. Sternchen (*) bezeichnen die proximalen und distalen Stellen für die Platzierung von Ameroid constrictors oder Ligaturen, je nachdem , ob subakute oder akute Ischämie wird induziert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54166/54166fig1large.jpg" target="_blank">Bitte cli</a>ck hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol start="2"><li> Mit einer Pinzette, öffnen Sie den Schnitt und setzen die Membran für den Leisten Fettgewebe (IFT). </li><li> Mit geschlossener Zange, durchdringen die Membran in die Trennung zwischen dem IFT und den Bauch. Lösen Sie vorsichtig Druck auf die Zange die IFT aus den Bauchmuskeln zu trennen, darunter das Gefäßnervenbündel ausgesetzt wird. Beachten Sie die proximalen und oberflächlichen Schwanz Zweige als wichtige anatomische Orientierungspunkte (Abbildung 1B). </li><li> Legen Sie eine Aufroller und ziehen proximal an den Bauchgewebe des proximalen Ameroid constrictor oder Ligierungsstelle auszusetzen, nur proximal der A. circumflexa femoris lateralis (1B). Die seitliche Kranzarterie liegt etwa 5 mm proximal zu dem proximalen und oberflächlichen Schwanzarterien. <ol><li> Legen Sie zwei weitere Retraktoren in den distalen Teil des Einschnitts, einer medialen und einer lateralen, die IFT distal weg von der zu ziehenOperationsstelle das Operationsfeld zu erweitern. </li></ol></li><li> Verwenden Sie zwei feinen Pinzette die äußerste Membran Abdeckung der Gefäßnervenbündel zu entfernen. Setzen Sie vorsichtig eine Hälfte der feinen Pinzette Spitze zwischen der Vene und Arterie, die Zangenspitze unter der Membran Gleiten, die sie zusammenhält. Schließen Sie die Zange und sanft reißen die Membran entfernt. </li><li> Legen Sie die Spitze eines geschlossenen Zange zwischen der Vene und Arterie und erstellen auf der Zange eine Lücke zwischen ihnen durch Druck freigibt. Wiederholen Sie diese Technik, um eine Lücke zwischen der Arterie und Nerven zu erzeugen. </li><li> Für subakute Extremitäten - Ischämie, legen Sie eine Ameroid constrictor auf der proximalen Arteria femoralis (Abbildung 2). <ol><li> Um den proximalen Ameroid constrictor installieren, schieben Sie die Spitze einer Zange unter der Femoralarterie es aus dem Gefäßnervenbündel zu isolieren. Verwenden Sie einen zweiten Satz von Winkel- Zange zu greifen den Rand des constrictor und führen ihn unter der Femoralarterie. </li><li> Legen Sie die Femoralarterie in die sviel in der constrictor. Wiederholen Sie dies für das distale constrictor, positionieren sie unmittelbar proximal zu der Gabelung der Arteria femoralis in die Arteria poplitea und Vena Arterie (Abbildung 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54166/54166fig2.jpg" /> Abbildung 2. Platzierung von Ameroid constrictor und Ligatures. (A) Beispiel für zwei Ameroid constrictor auf die Femoralarterie platziert subakute hindlimb Ischämie induzieren. Der proximale constrictor ist gerade proximal der A. circumflexa femoris lateralis (LCFA) gestellt. Das distale constrictor ist gerade proximal der Bifurkation der poplitea (PA) und Vena Arterien (SA) platziert. Constrictor sind mit der Schlitz richtig im constrictor. (B) Beispiel für Ligatur der A. femoralis zu induzieren akute hindlimb Ischämie festgelegt wird , um die Arterie , um sicherzustellen , nach oben eingelegt. LigaturES (gelbe Pfeile) sind so angeordnet, dass sie die Position der constrictors in Tafel (B) flankieren, und die Arteria femoralis ist zwischen jedem Satz von zwei Ligaturen (Sternchen) durchtrennt. Bar, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54166/54166fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54166/54166fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="8"><li> Für die akute Ischämie der Extremitäten, abzubinden und die proximalen Arteria femoralis transect. <ol><li> Um die Femoralarterie transect, Gewinde 7 - O Naht unter der Arterie proximal zu der Position des proximalen constrictor (siehe Schritt 3.7) und Ligat. Binden Sie eine zweite Ligatur etwa 1 mm distal der ersten. </li><li> Verwenden Sie Feder Schere, um die Arterie zwischen den beiden Ligaturen transect. Für die distale arterielle Durchtrennung, wiederholen Sie diese Schritte, wenn man zwei Ligaturen etwa 1 mm auseinander, gerade proximal zu der Gabelung der Arteria femoralis in die Arteria poplitea und Vena Arterie aber sicherzustellen, dass sie auf die oberflächliche caud distalal A. epigastrica (siehe Abbildung 1) </li></ol></li><li> Schließen Sie den Schnitt mit unterbrochen 5 - O Vicryl Nähten. </li></ol> 4. Perfusionsbildgebung <ol><li> Bewegen Sie die Maus auf eine 37 ° C Heizkissen unter dem Laser Doppler Perfusion Imager eingestellt (LDPI) und über eine nosecone an die Isofluran-Quelle verbinden. Wenn kein Temperaturmonitor verfügbar ist, erhalten Sie 5 min für die Maus auf 37 ° C zu erwärmen. </li><li> Schalten Sie den Scanner und starten Sie die Bild-Capture-Software. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Neue Single-Bild &#39;Symbol zum Öffnen des&quot; Scanner-Setup&#39; Fenster. Stellen Sie die &quot;Scanformat&quot; auf &quot;Large&quot; und die &quot;Scan-Geschwindigkeit&quot; auf &quot;4 ms / Pixel&quot;. Stellen Sie den Scanbereich durch die x- und y-Werte unter der &quot;Scanbereich (Einheiten)&quot; Scheibe ändern. </li><li> Klicken Sie auf die &#39;Video und Entfernung &quot;die Registerkarte Video-Feed anzuzeigen, und ordnen Sie die Maus in den Scanbereich durch eine rote Umrandung angezeigt zu passen. Klicken Sie auf &quot;Auto Distance &#39;zu kalibrierenDie Entfernung von dem Laser zu dem Thema. &quot;Weiter&quot; klicken, um das &quot;Betreff Details &#39;Fenster zu öffnen. </li><li> Geben Sie den Betreff und alle relevanten Kommentare ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Weiter&quot;, um Scanfenster zu bewegen. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Messung starten&quot; zu öffnen Sie die &quot;Bestätigen oder außer Kraft setzen Scan Distance &#39;Dialog. Klicken Sie auf &#39;OK&#39; Scan-Abstand zu bestätigen. Beachten Sie die Scan-Prozess beginnen und führen für 4 - 8 min von der Größe des Scanbereichs abhängig. </li><li> Nach Abschluss der Prüfung abgeschlossen ist, beachten Sie die &quot;Speichern unter&quot; Fenster. Benennen Sie die Datei und speichern Sie es. </li><li> Fahren Sie die Isofluran und bewegen Sie die Maus auf einen leeren Erholungskäfig ab und zu überwachen, bis das Tier in der Lage ist Brustlage zu halten. Stellen Sie niemals eine Maus aus der Narkose in einen Käfig mit anderen Mäusen erholt. </li><li> Öffnen Sie die Bildanalyse-Software. Klicken Sie auf die &quot;Öffnen&quot; Symbol und navigieren Sie zu und öffnen Sie die Bilddatei für die Analyse. Auf dem Dateifenster beobachten den Fluss,Foto und Farbbilder der Maus. </li><li> Um die Region of Interest (ROI) auf dem Fluss Bild zu markieren, klicken Sie auf die &#39;Show ROIs&#39; Symbol. Als nächstes klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Hinzufügen Polygon&quot; und ziehen Glied den Cursor auf dem nicht-chirurgische den ROI zu ziehen. Rechtsklick auf die Form zu schließen. Wählen Sie &#39;Add Polygon&#39; wieder und zeichnen Sie einen passenden ROI um den OP-Glied. </li><li> Klicken Sie auf das Symbol &quot;Statistik&quot;, das &quot;Image ROIs Statistik Ergebnisse (PU) &#39;zu öffnen Fenster. Beachten Sie die prozentuale Differenz im Fluss in der &quot;Flux%&quot; Spalte. HINWEIS: Der erste ROI gezogen wird als Referenz dienen. HINWEIS: Vor jedem Scan nachfolgende Perfusion befolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 1 der Maus und in Schritten von 4,1 bis 4,11 zu Bild zu betäuben das Tier. </li></ol>

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Vielleicht ist der schwierigste Schritt bei diesem Verfahren ist die Trennung von der Femoralarterie von der Femoralvene. Der größere Durchmesser und dünnere Wände der Femoralvene, die denen der Arterie im Vergleich zu erhöhen seine Anfälligkeit während der chirurgischen Manipulation zu durchstechen und zu zerreißen. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Vene stören können, indem sie die Wunde feucht mit einem sterilen Tupfer angefeuchtet mit PBS reduziert werden. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass alle Zange gesc...

Periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) ist eine führende Ursache für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität in den entwickelten Ländern 1. PAD Ergebnisse von atherosklerotischen Obstruktion der peripheren Arterien, die mit den daraus resultierenden Belastungs oder Ruheschmerzen zu Extremitäten-Ischämie führt und gelegentlich nicht heilende Geschwüre und Gangrän, die Amputation von Gliedmaßen erforderlich machen. Therapien PAD Targeting sind darauf gerichtet , in erster Linie in Richtung endovaskuläre 2 oder chirurgische Revaskularisation 3, wie im wesentlichen keine wirksame medizinische Therapien 4 existieren. Leider ist Revaskularisierung oft von begrenztem Nutzen, da Bypässen hohen Ausfallraten (bis zu 50% innerhalb von 5 Jahren) 5 , die in einigen Populationen schlimmer sind (zB Raucher, Frauen, nicht Vena saphena - Transplantate) 6,7. Endovaskuläre Ansätze, wie Angioplastie und Stent-Implantation, werden auch durch hohe Restenoseraten beeinträchtigt (mehr als 50% innerhalb von 1 Jahr), particulary in 8 femoropoplitealen Krankheit, obwohl die Verwendung von Medikamenten-freisetz Ballons und Stents Ergebnisse etwas 9-11 verbessert hat. Um neue Therapien für PAD zu entwickeln, ist es wichtig, Tiermodelle zu entwickeln, die zuverlässig die menschliche Krankheit zu reproduzieren. Bis heute ist das häufigste Modell der PAD ist die hinteren Gliedmaßen Ischämie - Modell (HLI), die am häufigsten in Mäusen durchgeführt 12,13. In ihrer häufigsten Manifestation bringt das Modell chirurgische Ligation des proximalen und distalen Oberschenkelarterie und die dazwischenliegenden Seitenäste durch Exzision des Schiffes gefolgt, in Okklusion des Blutflusses und die Induktion von akuter Ischämie der Gliedmaßen zur Folge hat. HLI wurde in erster Linie zur Untersuchung der Angiogenese und Arteriogenese Reaktionen in peripheren Gliedmaßen Muskelgewebe und die Wirkungen von verschiedenen Therapien (zB Medikamente, Genabgabe, Stammzellen) auf diesen Reaktionen verwendet. In jüngerer Zeit hat sich unsere Gruppe dieses Modell die Rolle von Skelettmuskelzellen zu untersuchen, verwendeten in die Antwort 14 Ischämie und die Auswirkungen der genetischen Unterschiede auf die Ergebnisse zu Gliedmaßen. Das HLI - Modell hat sich unser gegenwärtiges Verständnis erleichtert , dass die Gefäß- und Muskelreaktionen auf Ischämie auf Genetik abhängig sind (dh Inzuchtstamm) 15, 16 Jahre alt, und das Vorhandensein oder Fehlen von anderen Krankheiten oder Bedingungen , die für Atherosklerose, einschließlich Diabetes mellitus 17 und Hypercholesterinämie 18. Allerdings ist eine wichtige Schwäche des traditionellen HLI - Modell , dass es sich um ein Modell der akuten Extremitäten - Ischämie ist 12,13, während menschliche PAD chronische Ischämie als Folge der allmählichen Entwicklung der okklusiven atherosklerotischen Läsionen in den peripheren Arterien verursacht. In einem Versuch , diese Schwäche zu umgehen, Tang und Kollegen zunächst ein Rattenmodell der allmählichen Oberschenkelarterienverschluss entwickelt mit Ameroid constrictors 19 und die gleiche Gruppe , die später developed ein ähnliches Mausmodell 20. Ameroid constrictors wurden in einem Hunde - Modell der chronischen Myokardischämie 21,22 ursprünglich in den 1950er Jahren beschrieben. Diese Vorrichtungen haben eine äußere Metallhülse umschließt eine innere Schicht aus einem hygroskopischen Material, üblicherweise Casein und wenn sie um eine Arterie platziert sie induzieren graduelle Gefäßverschluss, da sie Feuchtigkeit aus den umgebenden Geweben zu absorbieren. In ihrer Modifikation des Modells, Yang et al. Platziert constrictors sowohl auf der proximalen und distalen Oberschenkelarterie an Stellen analog zu den chirurgischen Ligationsstellen, und sie ligiert , die Seitenzweige der Femoralarterie, wie in dem herkömmlichen Modell. Im Vergleich zu akuten HLI führte Ameroid constrictor-induzierte Ischämie bei niedriger Expression von inflammatorischen und schubspannungsabhängigen Gene, senkt den Blutfluss Recovery 4 - 5 Wochen nach der Operation, und weniger Muskelnekrose 20. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen wurde es, dass die schrittweise Arterienverschluss fühlte ein Modell P liefern könnteAD mehr relevant für die menschliche Krankheit. Bemerkenswert ist , in dem ursprünglichen Bericht, Auswirkungen von Ameroid Konstriktor induzierte Ischämie wurden nur in C57BL / 6 - Mäusen 19, untersucht , die auf 15 - Nekrose ischämisch induzierter Muskel relativ resistent sind. Wir modifizierte kürzlich die allmähliche Ischämie - Modell weiter und erforscht ihre Auswirkungen in der mehr Ischämie-anfälligen BALB / c - Maus - Stamm 23. In der ersten Manifestation des Modells, legten wir constrictors sowohl auf der proximalen und distalen Oberschenkelarterie ließ aber alle Seitenzweige intakt. In einer zweiten, milder Modifikation, legten wir einen einzigen constrictor nur auf der proximalen Arteria femoralis und wieder links alle Seitenzweige der Arterie intakt. In beiden Modifikationen dieses Modells haben wir festgestellt, dass BALB / c-Mäusen, aber nicht C57BL / 6-Mäuse, zeigten eine signifikante Muskelnekrose trotz ähnlicher Blutfluss und Gefäßdichte. Ähnlich wie unsere früheren Studie 14 zeigten diese Ergebnisse , dass Gliedmaßen MuskelVerletzungen nicht allein durch den Blutfluss beeinflusst, sondern ist teilweise abhängig von genetischen Hintergrund. Darüber hinaus fanden wir, dass Gliedmaßen Blutfluss zu seinem Nadir innerhalb von 3 Tagen fiel, so dass das Modell scheint mehr ein von &#39;subakute&#39; zu sein, anstatt schrittweise Extremitäten-Ischämie. Auf der Grundlage dieser früheren Studien scheint es klar, dass ein einheitliches Verfahren zur hinteren Gliedmaßen Ischämie induziert nicht in allen Fällen geeignet sein können. Da eine Vielzahl von Bedingungen (zB genetische Unterschiede und das Vorhandensein oder Fehlen von Komorbiditäten) beeinflussen sowohl die vaskuläre und Skelettmuskel-spezifischen Antworten, Ermittler finden es notwendig , die Chronifizierung und / oder die Schwere der hinteren Gliedmaßen Ischämie am besten zu ändern passen ihre Zwecke. Des Weiteren vor Beschreibungen des Modells typischerweise geeignete anatomische Orientierungspunkte fehlten zuverlässige inter Ermittler Reproduzierbarkeit der Technik zu erleichtern. In diesem Dokument werden Verfahren zur entweder akute oder subakute hindlimb Ischämie in der Maus zu induzierenwerden beschrieben und präzise sind anatomische Orientierungspunkte zur Verfügung gestellt.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5/45 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Dumoxel</td></tr><tr><td>Dumont Style 5 Mini Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-14</td><td>Inox</td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>7 - 0 Seide Naht</td><td>Sharpoint</td><td>DA-2527N</td><td></td></tr><tr><td>5 - 0 Coated Vicryl Naht</td><td>Ethicon</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Künstliche Tränen Salbe</td><td>Rugby Laboratories</td><td>0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Klebeband</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>Feine Wattestäbchen</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2DF</td><td></td></tr><tr><td>Ameroid-Konstriktoren</td><td>Forschungsinstrumente SW</td><td>MMC-0,25 x 1,00-SS</td><td></td></tr><tr><td>Heißperlen-Sterilisator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltaphasen-Isotherm-Pad</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Nadeltreiber</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Moor LDPI</td><td>Moor Instruments</td><td>moorLDI2</td><td></td></tr><tr><td>moorLDI Messsoftware</td><td>Moor Instruments</td><td>v. 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Haarentfernungscreme</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methoden für die akute und subakute murine hindlimb ischemia

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) ist eine führende Ursache für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität in den entwickelten Ländern und Tiermodellen, die zuverlässig die menschliche Krankheit zu reproduzieren sind notwendig, um neue Therapien für diese Krankheit zu entwickeln. Die Maus hindlimb Ischämie-Modell wurde für diesen Zweck, aber die gängige Praxis zu induzieren akute Ischämie der Extremitäten durch Ligatur der Arteria femoralis kann führen zu erheblichen Gewebsnekrosen, gefährden Ermittler die Fähigkeit zur Untersuchung der Gefäß und Skelettmuskelgewebe Reaktionen auf Ischämie weit verbreitet . Ein alternativer Ansatz zur Femoralarterie Ligierung ist die Induktion der graduellen Femoralarterie Okklusion durch die Verwendung von Ameroid constrictors. Wenn sie um die Oberschenkelarterie in der gleichen oder verschiedenen Stellen wie die Stellen der Femoralarterie Ligatur gelegt, okkludieren diese Vorrichtungen die Arterie über 1 - 3 Tage, was zu allmählicher, subakute Ischämie. Dies führt zu weniger beträchtliche Nekrose Skelettmuskelgewebe, which mehr nachahmen kann genau die Reaktionen im menschlichen PAD gesehen. Da der genetische Hintergrund Einflüsse Ergebnisse in den beiden akuten und subakuten Ischämie-Modellen Berücksichtigung der Mausstamm beobachtet, die bei der Auswahl der besten Modell wichtig ist. Dieses Papier beschreibt die richtige Verfahren und anatomische Platzierung der Ligatur oder Ameroid constrictor auf der Maus Femoralarterie subakuten oder akuten hinteren Gliedmaßen Ischämie in der Maus zu induzieren.

Richtige Identifizierung der Maus hindlimb Vaskulatur ist kritisch Reproduzierbarkeit der Techniken zur Gewährleistung sowohl subakute und akute Ischämie der hinteren Gliedmaßen Induzieren wie hier beschrieben. Zusätzlich zu der inhärenten Variation in Tierstudien können andere Faktoren Variabilität in Laser Doppler Perfusion Imaging (LDPI) einzuführen, einschließlich der Art der Anästhesie, die Position des Tieres (supine vs. anfällig) und Körpertemperatur (siehe Abbild...

Die chirurgische Induktion der Ischämie der Hintergliedmaßen bei der Maus ist nützlich, um die Angiogenese zu untersuchen, jedoch ist dies bei bestimmten Inzucht-Mausstämmen, die eine ausgeprägte Ischämie-induzierte Gewebenekrose aufweisen, beeinträchtigt. Es werden Methoden zur Induktion einer subakuten Ischämie der Gliedmaßen unter Verwendung von Ameroid-Konstriktoren beschrieben, um dieses Problem durch die Induktion eines allmählichen arteriellen Verschlusses zu umgehen.

Methoden für die akute und subakute Murine hindlimb Ischemia

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die periphere arterielle Verschlusskrankheit des Menschen zu modellieren, indem Nähte oder ameroidale Konstriktoren an der femoralen Arterie der Maus platziert werden, um akute bzw. subakute Ischämie der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die periphere arterielle Verschlusskrankheit ist ein wichtiges klinisches Problem, und diese Techniken unter Verwendung von Tiermodellen wurden entwickelt, um die menschliche Erkrankung besser abzubilden. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass der Schweregrad und der Zeitpunkt des Auftretens der Gliedmaßenischämie vom Untersucher kontrolliert werden können.Den Versuch wird Mike Padgett, ein Techniker aus meinem Labor, demonstrieren. Ein bis zwei Tage vor dem Eingriff überprüfen Sie, ob die Maus vollständig sediert ist, indem Sie feststellen, dass sie nicht auf eine Zehenquetschung reagiert, und tragen Augensalbe auf. Anschließend benutzen Sie einen kleinen elektrischen Rasierer, um das Haar an beiden Hinterbeinen abzurasieren.Wenn das gesamte Fell abgeschnitten wurde, tragen Sie eine vorgewärmte Enthaarungscreme auf. Nach einer Minute entfernen Sie die Creme vorsichtig mit einem angefeuchteten Mulltupfer. Danach stellen Sie die Maus in einen leeren, mit Papiertüchern ausgelegten Erholungskäfig, bis sie die Brustlage stabil halten kann.Am Tag der Operation wird die vollständig sedierte Maus in Rückenlage unter ein technisches Stereomikroskop gelegt und beide Beine mit Operationspflaster fixiert. Falls ein temperaturgeregelter Heizkissen verwendet wird, befestigen Sie die Temperatursonde und sichern Sie diese mit Operationspflaster am Untergrund der Operationsplattform. Anschließend wird der Operationsbereich mit drei abwechselnden Abreibungen aus Povidon-Iod und Alkohol gereinigt und das Tier mit einem sterilen Operationsfeld abgedeckt, das eine Öffnung an der Schnittstelle aufweist.Erstellen Sie mit einem Skalpell einen ersten Schnitt entlang der Mitte der Innenseite des Oberschenkels vom Knie in Richtung Bauch. Verlängern Sie den Schnitt anschließend mit feiner Schere auf etwa einen Zentimeter. Öffnen Sie den Schnitt mit einer Pinzette, um die Membran freizulegen, die das Leistenfettgewebe bedeckt.Verwenden Sie dann geschlossene Pinzetten, um durch die Membran in den Raum zwischen dem Fettgewebe und dem Bauch zu stechen. Lösen Sie vorsichtig den Druck auf die Pinzetten, um das Fettgewebe von den Bauchmuskeln zu trennen, wodurch das neurovaskuläre Bündel freigelegt wird. Es ist entscheidend, dass die großen Blutgefäße und ihre Seitenäste vor der Präparation des neurovaskulären Bündels korrekt identifiziert werden.Abweichungen in der Position der Konstriktoren oder den Ligationsstellen können die Schwere der Ischämie erheblich verändern und zu einer beträchtlichen Variabilität der Ergebnisse führen. Führen Sie einen Retraktor in den Schnitt ein und ziehen Sie das Bauchgewebe in Richtung des Tierkopfes, um die proximale Stelle des ameroiden Konstriktors freizulegen, die sich unmittelbar proximal zur Arteria circumflexa femoris lateralis befindet. Anschließend bringen Sie einen medialen und einen lateralen Retraktor in den distalen Teil des Schnittes ein, um das Operationsfeld zu verbreitern, und ziehen das Leistenfettgewebe in Richtung der Fußseite und vom Operationsbereich weg.Die proximalen und oberflächlichen kaudalen Äste der Arteria femoralis sollten leicht zu erkennen sein. Die Arteria circumflexa femoris lateralis befindet sich etwa fünf Millimeter proximal zu den kaudalen Ästen und kann durch Membran bedeckt sein. Gleiten Sie nun vorsichtig mit der Spitze einer Pinzette unter die Membran, die die Gefäße zusammenhält, um die Hälfte der Spitze zwischen Vene und Arterie einzuführen.Dann schließen Sie die Pinzette und entfernen vorsichtig die Membran. Sobald die gesamte Membran entfernt ist, führen Sie die Spitze der geschlossenen Pinzette zwischen Vene und Arterie ein und lösen den Druck auf die Pinzette, um einen Spalt zwischen den Gefäßen zu erzeugen. Bei subakuter Extremitätenischämie schieben Sie die Spitze der Pinzette unter die A. femoralis, um das Gefäß vom neurovaskulären Bündel zu isolieren.Verwenden Sie eine zweite Pinzette mit abgewinkelten Spitzen, um die Kante des Konstriktors zu greifen, und führen Sie den Konstriktor unter die Arteria femoralis. Legen Sie dann die Arterie in den Schlitz des Konstriktors. Positionieren Sie anschließend den distalen Konstriktor an der Arteria femoralis unmittelbar proximal zu der Stelle, an der sich die Arterie in die Arteria poplitea und die Arteria saphena aufteilt, und führen Sie die Arteria femoralis in den Konstriktorschlitz ein.Bei akuter Extremitätenischämie führen Sie eine 7-0-Naht unterhalb der Arterie an der gleichen Stelle wie der proximale Konstriktor ein und ligieren die Arterie. Danach setzen Sie eine zweite Ligatur etwa einen Millimeter distal zur ersten und durchtrennen die Arterie mit einer Federschere zwischen den beiden Ligaturen. Für die distale arterielle Durchtrennung platzieren Sie die Ligaturen etwa einen Millimeter voneinander entfernt, unmittelbar proximal zur Stelle, an der die Arteria femoralis in die Arteria poplitea und die Arteria saphena bifurziert.Danach die Inzision mit unterbrochenen Vicryl-Nähten der Stärke 5-0 verschließen und die Maus auf eine Heizplatte mit 37 Grad Celsius unter einem Laser-Doppler-Perfusionsbildgeber bringen. Schalten Sie nun den Bildgeber ein und starten Sie die Aufnahmesoftware. Klicken Sie auf das Symbol „Neues Einzelbild“, um das Scanner-Einrichtungsfenster zu öffnen, und stellen Sie die Scan-Größe auf groß und die Scan-Geschwindigkeit auf vier Millisekunden pro Pixel ein.Ändern Sie die Werte für X und Y im Bereich Scan-Flächeneinheiten auf die entsprechenden Werte, klicken Sie dann auf die Registerkarte Video und Distanz und positionieren Sie beide Hintergliedmaßen innerhalb des Scan-Bereichs. Klicken Sie auf Automatische Distanz, dann auf Weiter, um das Fenster mit den Versuchspersonendaten zu öffnen, und geben Sie die Informationen zur Versuchsperson ein. Klicken Sie auf Weiter, um zum Scan-Fenster zu wechseln.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Messung starten“, um das Dialogfeld „Scan-Abstand bestätigen oder überschreiben“ zu öffnen, und klicken Sie auf „OK“, um den Scanvorgang zu starten. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, bewegen Sie die Maus in einen leeren Erholungskäfig und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig erholt hat. Neben den inhärenten Variationen bei Tierversuchen können weitere Faktoren Variabilität in der Laser-Doppler-Perfusionsbildgebung verursachen, darunter die Körpertemperatur und die Position des Tieres.Das subakute Hintergliedmaßen-Ischämie-Modell hängt von der Qualität der Ameisenring-Konstriktoren ab, die innerhalb einer Charge stark variieren kann. Die Laser-Doppler-Perfusionsbildgebung sollte unmittelbar nach dem Eingriff durchgeführt werden, während das Tier noch anästhesiert ist, um die Auswirkungen der Operation zu demonstrieren und ein Basisniveau der postoperativen Perfusion zu etablieren. Nach der Induktion einer akuten Gliedmaßenischämie sollte ein vollständiger Verlust der Hintergliedmaßen-Perfusion beobachtet werden, wohingegen nach der Platzierung des Ameisenring-Konstriktors im subakuten Modell typischerweise nur eine leichte Verminderung der Perfusion festzustellen ist.Mithilfe dieser Verfahren lässt sich die Wirkung unterschiedlicher Ausprägungen einer Ischämie auf die Gefäßremodelierung und Regeneration der Skelettmuskulatur bei der Maus als Modell für die periphere arterielle Verschlusskrankheit beim Menschen untersuchen. Wenn man einmal Erfahrung mit diesen Verfahren gesammelt hat, können sie bei korrekter Durchführung in etwa 15 Minuten abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieser Operationen ist es wichtig, stets die Körpertemperatur und die Angemessenheit der Anästhesie beim Tier zu überwachen.Indem die Platzierung der Ligaturen oder Konstriktoren angepasst wird, kann das Ausmaß der ischämischen Verletzung modifiziert werden, was eine wichtige Variable darstellen kann, abhängig vom genetischen Hintergrund des Tieres oder dem Vorhandensein kardiovaskulärer Risikofaktoren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man sowohl eine akute als auch eine subakute Hintergliedmaßenischämie bei der Maus induziert, und wie man die vaskuläre Anatomie bestimmt, um ein korrektes Ergebnis und die Reproduzierbarkeit des Verfahrens sicherzustellen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Das chirurgische Verfahren zur Induktion einer einseitigen Hinterlauf Ischämie nachgewiesen wird, mit der Bestätigung der Ischämie durch Laser-Doppler-Perfusion.

Mausmodell der hinteren Gliedmaßen Ischämie

Zahlreiche genetische Manipulationen und / oder intramyokardialen Injektionen von Genen, Proteinen, Zellen und / oder Biomaterialien basieren auf die Dimension der Zeit in Studien zur akuten Ischämie / Reperfusion und chronischer Umbau in Mäusen überlagert. Dieses Video zeigt die mikrochirurgische Verfahren für die Ischämie / Reperfusion, permanent koronare Ligation und intramyokardialen Injektion Studien.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Wir stellen ein chirurgisches Verfahren, experimentelle Ischämie / Reperfusions (I / R) Schädigung induzieren Myokardinfarkt (MI) in Mausmodellen, die für mehr Klarheit in der Positionierung der Ligation an der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) simulieren können, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen MI Experimente in Mäusen.

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Hier beschreiben wir die Einzelheiten des Verfahrens der intestinalen Ischämie-Reperfusion bei Mäusen, die ohne Mortalität in reproduzierbarer Verletzungen führt die Standardisierung dieser Technik auf dem Gebiet zu fördern. Dieses Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusions-Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.

Murine Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden

Wir beschreiben ein chirurgisches Verfahren, das zur indufären Ischämie bei Kaninchen mit Hyperlipidämie und Diabetes eingesetzt wird. Diese Operation dient als präklinisches Modell für Erkrankungen der peripheren Arterienerkrankung bei Patienten. Die Angiographie wird auch als Mittel zur Messung des Ausmaßes der eingeführten Ischämie und der Wiederherstellung der Perfusion beschrieben.

Präklinische Modell von Hind Limb Ischemia in diabetischen Kaninchen

Hier wird ein kritisches Hinterlimb Ischämie-Experimentalmodell vorgestellt, gefolgt von einer Batterie funktioneller, histologischer und molekularer Tests zur Beurteilung der Wirksamkeit angiogener Therapien.

Beurteilung der therapeutischen Angiogenese in einem Murine-Modell von Hindlimb Ischemia

Hierin beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren, das zeigt, wie eine dauerhafte Ligation der links-vorderen absteigenden Herzkranzgefäße bei Mäusen erreicht werden kann. Dieses Modell ist von hoher Relevanz für die Untersuchung der Pathophysiologie des Myokardinfarkts und der damit einhergehenden biologischen Prozesse.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Technik und die notwendigen Kontrollen für die Laser Doppler-Perfusionsbildgebung demonstriert, um den Blutfluss im Maushinterglied zu messen.

Laser Doppler Perfusion Imaging in der Maus Hindlimb

Dieser Artikel zeigt einen effizienten chirurgischen Ansatz zur Feststellung einer akuten Ischämie bei Mäusen mit einem kleinen Schnitt. Dieser Ansatz kann von den meisten Forschungsgruppen ohne Labor-Upgrades angewendet werden.

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mäuse mit einem Miniaturschnitt

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einzigartiges, klinisch relevantes Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit, das die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitors kombiniert, um bei FVB-Mäusen Gangrän der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die intrakardiale DiI-Perfusion wird dann für die hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung des Gefäßes des Fußpolsters verwendet.

Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Etablierung eines distalen Modells für einen Verschluss der mittleren Hirnarterie (dMCAO) durch transkranielle Elektrokoagulation bei C57BL/6J-Mäusen vor und bewerten das anschließende neurologische Verhalten und die histopathologischen Merkmale.

Induktion eines akuten ischämischen Schlaganfalls bei Mäusen mit der Technik des distalen Mittelarterienverschlusses

Erfahren Sie Methoden zur akuten und subakuten Hinterbeinischämie bei Mäusen durch Ameroid-Konstriktoren an der Femoralarterie. Dieses Modell ermöglicht kontrollierte Studien zur Angiogenese und peripheren arteriellen Verschlusskrankheit.

Methoden für die akute und subakute Murine hindlimb Ischemia

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