Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Stammzelltransplantationsverfahrens besteht darin, ein neuartiges chimäres Mausmodell mit menschlicher Leberfunktion mithilfe menschlicher unreifer hepatischer Stammvorläuferzellen zu erzeugen, die Zellproliferation, Reifung und Differenzierung zur Erfassung des Arzneimittelmetabolismus ermöglichen. Diese Methode stellt ein leistungsstarkes Werkzeug dar, um ein Mikromilieu zu schaffen, das die Progenese menschlicher Spender-hepatischer Stammzellen unterstützt, um diese zu vermehren, zu differenzieren und die geschädigte Leber der empfängenden Maus wiederherzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass gereifte proliferierte Zellen verwendet werden können und die Leber nahezu vollständig rekolonisiert wird.

Beginnen Sie damit, eine Stammlösung von einem Milligramm pro Milliliter Diphtherietoxin oder DT herzustellen, indem Sie ein Milliliter phenolisiertes 0,85-%-Natriumchlorid-Lösung zu einem Milligramm DT hinzufügen. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von DT durch, indem Sie eine Albtrek-SCID-Maus in dorsaler Rückenlage halten und unterhalb der Kniebeuge links oder rechts der Mittellinie die Nadel in einem Winkel von 45 Grad zum Körper einführen. Injizieren Sie mit einer Insulinspritze 100 Mikroliter einer frisch hergestellten DT-Lösung mit einer Konzentration von 0,3 Mikrogramm pro Milliliter pro 20 Gramm Maus. 48 Stunden nach der DT-Injektion wird die Maus in einen Fixierapparat gebracht und der Schwanz etwa 10 Minuten lang in einem Wasserbad mit 30 Grad Celsius erwärmt, um die Blutgefäße zu weiten.

Dann zwei Zentimeter von der Schwanzspitze entfernt, mit einer scharfen Skalpellklinge einen einen Millimeter langen Schnitt in den Schwanz machen und mit einem Kapillarrohr das Blut sammeln. Das Mikrokappillarrohr mit dem Blut bei 1500 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren und das Serum gewinnen, indem man den Überstand vom Zellpellet trennt. 50 Mikroliter einer 1:20-Verdünnung des Serums auf GOT-ASTP3-Slides pipettieren.

Dann unter Verwendung eines vielseitigen automatischen Trockenchemie-Analysators gemäß der Herstellerprotokoll die Extinktion des Reaktionsprodukts bei 650 Nanometern messen. Unter Verwendung eines Zellseparators humane hepatische Stammzellen aus primären humanen fetalen Leberzellen mit den Zellantigenen CDCP1, CD90 und CD66 isolieren, um eine CDCP1-positive, CD90-positive, CD66-negative Teilpopulation zu erhalten. Die Zellen in mit Kollagen vier kodierten Kulturschalen ansiedeln und bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht haben, die Zellen einmal mit PBS waschen. Anschließend 0,05 % Trypsin-EDTA hinzufügen und bei Raumtemperatur inkubieren. Wenn die Zellen unter dem Mikroskop frei schwebend oder fließend erscheinen, die enzymatische Verdauung durch Zugabe von acht Milliliter DMF12 mit 10 % FBS stoppen.

Mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette die Zellen langsam suspendieren, bevor sie in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführt werden. Die Zellen bei 100 × g und 4 °C fünf Minuten lang zentrifugieren. Mit 10 Millilitern DMEM/F12 mit 10 % FBS das Zellpellet vorsichtig resuspendieren und ein Zellzählgerät verwenden, um die Zellanzahl zu bestimmen.

Teilen Sie die Zellen in Aliquote von je einer mal 10 hoch sechs Zellen pro 50 Mikroliter PBS pro Maus auf und lagern Sie sie auf Eis, bis zur Transplantation. Nachdem eine Maus gemäß dem schriftlichen Protokoll anästhesiert wurde, überprüfen Sie die Reflexe durch leichtes Zudrücken des Hinterfußpolsters. Tragen Sie anschließend Tierarzt-Salbe auf die Augen auf, um Austrocknung zu verhindern.

Den Operationsbereich mit elektrischen Haarschneidemaschinen rasieren und mit 70 % Ethanol sowie Povidon-Iod zur Desinfektion behandeln. Einen einen Zentimeter langen Hautschnitt in der linken Flanke knapp unterhalb des Rippenbogens anlegen. Anschließend einen Schnitt in der linken Bauchwand und danach einen Schnitt in das Peritoneum führen.

Als Nächstes exponieren Sie vorsichtig die Milz. Führen Sie dann unter einem Winkel von fünf Grad eine 100-Mikroliter-Mikroinjektionsspritze mit einer 32-Gauge-einhalb-Zoll-Nadel in einer Tiefe von der Hälfte der Dicke der Milz ein und injizieren Sie direkt von einem Ende des Organs zum anderen eine Zellmenge von ein mal 10 hoch sechs humanen hepatischen Stammzellen in 50 Mikrolitern PBS in das Organ, und ziehen Sie anschließend die Nadel heraus. Um ein Austreten der Zellen nach der Injektion zu verhindern, üben Sie mit einem Finger sanft zwei Minuten lang Druck aus.

Legen Sie die Milz zurück in den Körper der Maus und verwenden Sie einen normalen Laufstich für die Muskulatur und die Haut, um die Körperhöhle zu verschließen. Überführen Sie die Maus unverzüglich seitlich in einen auf 37 Grad Celsius vorgewärmten Käfig. Vermeiden Sie Kontakt zwischen dem Einstreu im Käfig und der Operationsstelle, und überwachen Sie das Tier gemäß dem schriftlichen Protokoll.

Vier bis sechs Wochen nach der Transplantation, nachdem die Maus gemäß dem Textprotokoll euthanasiert wurde, öffnen Sie mit einer Schere die Bauchhöhle, indem Sie gleichzeitig die Haut und die Faszie durchtrennen. Verwenden Sie die Schere als Spatel, um das Bindegewebe über dem Peritoneum entlang der Linea alba zu dissezieren und so die Bauchhöhle zu öffnen. Heben Sie mit einer Pinzette das Brustbein an.

Dann durchstechen Sie das Zwerchfell und schneiden an jeder Seite des Brustbeins bis zum Halswirbel hinauf. Durchtrennen Sie die Vena cava auf der thorakalen Seite der Leber und ziehen Sie die Speiseröhre in anteriorer Richtung durch die Leber hindurch. Entfernen Sie das Zwerchfell und ziehen Sie mithilfe dessen als Griff die Leber aus der Bauchhöhle heraus.

Die Vena cava inferior hält die Leber an Ort und Stelle. Schneiden Sie daher die Vena cava inferior durch, wobei darauf geachtet werden muss, die rechte Nebenniere nicht vorzeitig zu lösen. Trennen Sie die Leberlappen an ihren Verbindungsstellen voneinander und betten Sie sie gemäß der Anweisungen des Herstellers in OCT ein.

Die OCT mit dem Lebergewebe in den Metallgittern am Kryostaten einfrieren. Mit dem Kryostaten fünf Mikrometer dicke Probenschnitte bei minus 18 Grad Celsius schneiden und auf Objektträgern mit Raumtemperatur aufbringen. Den Vorrat bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Schließlich bereiten Sie die Objektträger gemäß zuvor beschriebener Verfahren für die H&E-Färbung und gemäß dem Textprotokoll für das ELISA vor. Wie in diesen H&E-gefärbten Schnitten gezeigt, wiesen die mit DT behandelten Mäuse eine desorganisierte hepatische Architektur auf und zeigten eine Korrektur der Kongestion mit erhöhter serumstammiger AST-Aktivität. Sechs Wochen nach der Transplantation rekonstituierten aus humanen hepatischen Stammzellen abgeleitete Zellen die Leberstruktur, indem sie die residenten Maushepatocyten ersetzten.

Makroskopisch wurden vier Tage nach der Transplantation kleine, gleichmäßig um die Leber verteilte humane hepatische Zellverbände nachgewiesen. Nach 45 Tagen hatten sich diese Zellverbände zu größeren Verbänden vermehrt. Wie hier zu sehen, wurde das Vorhandensein menschlicher Hepatozyten in Mauslebern erstmals sechs Wochen nach der Transplantation durch Färbung mit Antikörpern gegen humane Kerne sowie Cytokeratin 8/18 bestätigt.

Menschliche ALB-positive und CK19-negative Hepatozyten ähnelten funktionellen Hepatozyten, während Zellen, die sowohl für menschliches ALB als auch für CK19 positiv färbten, eine bipotente Differenzierungsfähigkeit in Hepatozyten und Cholangiozyten zeigten. Es wurden mehrere runde Zellverbände beobachtet, die die Leberlappen umgaben und klare menschliche Kerne sowie Expression von CK8/18 aufwiesen, was die koloniebildende Fähigkeit menschlicher hepatischer Stammzellen in den humanisierten Lebern belegt. Schließlich erreichte der Rekapitalisierungsgrad innerhalb eines Monats nach Transplantation bis zu 90 %, und die Sekretion menschlichen Albumins wurde in den rekapitalisierten Mauslebern nachgewiesen.

Wenn die chirurgische Zelltransplantation einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass Leberschäden auf die elastische Leber beschränkt bleiben sollten. Bei Zellaustritt muss die Zelltransplantation verhindert werden.

In Kombination mit diesem Verfahren können andere Methoden wie die Gen-Transfektion für die direkte Umdifferenzierung von menschlichen Zellen in vitro durchgeführt werden, um die Konvergenz menschlicher Zellen mit unserem derzeitigen Modell zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Hepatologie den Weg, um menschlichen Arzneistoffwechsel, Arzneimittel-Wechselwirkungen, hepatische Toxizität und Hepatitisviren in einem humanisierten Lebermodell zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hepatische Stammzellen isoliert und vergrößert, eine Leberschädigung induziert und Zellen über die Milz transplantiert, um ein chimäres Mausmodell mit menschlicher Leberfunktion zu erzeugen.

Vergessen Sie nicht, dass Diphtherietoxin kontrolliert werden kann, und wichtige Vorsichtsmaßnahmen wie die Vermeidung einer Nekrose von Herz und Leber stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.