Name: Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung eines humanisierten Maus-Lebermodells mittels Transplantation menschlicher Leberstammzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung menschlicher Leberfunktion und Arzneimittelstoffwechsels in vivo.

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Wir möchten dem Mammalian Genetics Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, für die Bereitstellung der Mäuse danken. Wir danken auch S. Aoyama und Y. Adachi vom ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) & Toxicology Research Institute, Sekisui Medical Company Ltd., Japan, sowie K. Kozakai und Y. Yamada für die Unterstützung bei der LC-MS/MS-Analyse. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) an Y-W.Z. (18591421, 20591531 und 23591872) unterstützt; durch das innovative und unternehmerische Projekt Jiangsu zur Einführung hochrangiger Talente und das Jiangsu Science and Technology Planning Project (BE2015669); und durch Zuschüsse an H.T. zur strategischen Förderung innovativer Forschung und Entwicklung (S-Innovation, 62890004) von der Japan Science and Technology Agency.

Alle Tierversuchsverfahren wurden nach den Tierschutzrichtlinien von Yokohama City University durchgeführt. 1. Erzeugung des akuten Leberschädigung Mausmodell <ol><li> 1 ml phenolisiert 0,85% NaCl-Lösung (0,6 g Phenol in 100 ml 0,85% NaCl-Lösung) auf 1 mg Diphtherietoxin (DT), um eine 1 mg / ml Stammlösung DT zu machen. Anmerkung: DT in einer Konzentration von 1 mg / ml für etwa 2 Jahre bei 3 ° C bis 8 ° C gelagert werden. </li><li> Seriell verdünnt das 1 mg / ml Stammlösung DT bis 0,3 &amp; mgr; g / ml in DT phenolisiert 0,85% NaCl-Lösung und ein Aliquot der 0,3 ug / ml DT Lösung als Arbeitslösung herzustellen. Hinweis: Diese Arbeitslösung sollte frisch zubereitet werden. </li><li> Zur Durchführung der Versuche einer subletalen Dosis verwendet (~ 50% Letalität), verabreichen 8 Wochen alte Mäuse eine 1,5 &amp; mgr; g / kg Dosis von DT. <ol><li> Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von DT mit der Maus in Rückenlage halten und legen Sie die needle unterhalb der Biegung der Knie, links oder rechts von der Mittellinie. Vermeiden, dass die Mittellinie Eindringen der Blase zu verhindern. Winkel der Nadel bei etwa 45 ° an den Körper. </li><li> Verwendung einer Insulinspritze, injizieren die Mäuse mit 100 ul frisch hergestellten 0,3 &amp; mgr; g / ml DT pro 20 g Mausgewicht. Beispielsweise ein 18-g Maus sollte 90 &amp; mgr; l der 0,3 &amp; mgr; g / ml DT-Lösung erhalten. </li></ol></li><li> Bei 48 Stunden nach der DT-Injektion, sammeln Blut aus der Schwanzvene mit der Maus in einem Verzögerer platzieren und Erwärmung der Maus Schwanz in einem 37 ° C Wasserbad für ca. 10 min, die Blutgefäße zu erweitern. Dann machen Sie einen 1-mm-nick in den Schwanz 2 cm von der Spitze mit einem scharfen Skalpell und sammeln das Blut mit einem Mikrokapillarröhre. <ol><li> Zentrifugieren Sie die Mikrokapillarröhre das Blut bei 1.500 × g für 5 min enthält, und sammeln das Serum durch den Überstand und Zellpellet zu trennen. </li></ol></li><li> Pipettieren von 50 &amp; mgr; l von 1:20 verdünnt Mausserum auf GOT / AST-PIII gleitet. Messen der Extinktion des Reaktionsprodukts (blauer Farbstoff) bei 650 nm eine Mehrzweck automatische Trockenchemie-Analysesystem unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers. HINWEIS: Das Auslesen von Aspartat-Aminotransferase (AST) / Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) -Aktivität wird automatisch angezeigt. 2 Tage Post DT, bei ungefähr 60% der Mäuse AST-Werte zwischen 12.000 ausgestellt - 16.000 IE / l und wurden als von einer akuten Leberschäden zu leiden. Diese Mäuse wurden in einen neuen Käfig übertragen und als Zelltransplantat-Empfängern verwendet. </li></ol> 2. Herstellung von menschlichen Leberstammzellen <ol><li> Isolieren der menschlichen Leber Stammzellen aus menschlichen primären fötalen Leberzellen mit einem Zellsortierer mit den CDCP1, CD90 und CD66 Zell-Antigene eine CDCP1 + CD90 + CD66- Subpopulation zu erhalten, dann Samen der isolierten Zellpopulation auf Kollagen IV-beschichteten Kulturschalen, wie zuvor berichtet 15. Verwenden menschliche primäre fetale Leberzellen eines embryonalenAlter zwischen 14 und 18 Wochen. </li><li> Sammeln der menschlichen Leber Stammzellen kultiviert auf 80% - 90% Konfluenz auf 100-mm-Kulturschalen, die das Kulturmedium anzusaugen, wasche die Zellen mit 10 ml PBS und anschließend die PBS zu entfernen. Trypsinize die Zellen mit 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung für 5 min bei 37 ° C. Anmerkung: Die Zellen mit mehr als 90% Konfluenz für die Zelltransplantation nicht geeignet sind, da die Zelldifferenzierung ihre Proliferationsfähigkeit bei Mäusen beeinflussen. </li><li> Überwachen Sie den Status der Zelldispersion unter einem Mikroskop. Wenn die Zellen frei zu schweben oder fließenden erscheinen, durch Hinzufügen von 8 ml DMEM / F12, enthaltend 10% FBS, die enzymatische Verdauung zu stoppen. </li><li> Suspend die Zellen langsam eine 10-ml serologische Pipette und übertragen Sie die Zellen in einen 15-ml konischen Röhrchen. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 100 xg und 4 ° C. </li><li> resuspendieren vorsichtig das Zellpellet in 10 ml DMEM / F12 10% FBS enthält, und zu bestimmen, die Zellzahlen ein Mikroskop Zählkammer verwenden. </li><li>Teilen Sie die Zellen in 1,0 x 10 6 Zellen pro 50 ul PBS Aliquots für jede einzelne Maus und speichern auf Eis bis zur Transplantation. </li></ol> 3. intralienale Transplantation von menschlichen Leberstammzellen <ol><li> Einen sauberen Käfig auf einem 37 ° C elektrische Heizkissen. </li><li> Anästhesieren der Maus Isofluran Inhalation (1 - 1,5% (vol / vol) in 2 l Sauerstoff pro min), indem sie unterhalb des Düsen platzieren. Alternativ können Sie Rohre Gaze mit Isofluran getränkt enthält. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Maus leicht betäubt durch den hinteren Fußballen Kneifen. Wenn ein Kniereflex ausgelöst wird, legen Sie die Maus wieder in der Kammer. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li></ol></li><li> Rasur die Operationsstelle mit elektrischen Haarschneidemaschine und wenden 70% (vol / vol) Ethanol und Povidon-Iod zu sterilisieren. Dann machen Sie eine 1-cm Hautschnitt in der linken Flanke knapp unterhalb der Costal Grenze der Rippen, durch einen Einschnitt folgte aufdie Bauchdecke sowie das Peritoneum. </li><li> aussetzen vorsichtig die Milz. Verwenden eine 100-ul Mikroinjektionsspritze mit einer 32-G 1/2-Zoll - Nadel zu injizieren direkt 1,0 x 10 6 menschliche Leberstammzellen in 50 &amp; mgr; l PBS in die Milz jeder Maus. Kippen Sie die Nadel in einem Winkel von 5 ° zur Injektion. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Tiefe der Injektion ist weniger als die Hälfte der Dicke der Milz. Die Nadel sollte die Milz an einem Ende (der Kopf) und deponieren die Zellen am anderen Ende (der Schwanz) eingeben. </li></ol></li><li> Um ein Auslaufen der Zellen verhindern Injektion folgende, leicht anzuwenden Druck einen Finger für 2 min und anschließend die Nadel entfernen. </li><li> Legen Sie die Milz wieder in die Maus Körper und schließen Sie den Hohlraum mit einer normalen Lauf Naht für die Muskulatur und die Haut. </li><li> Übertragen Sie die Mäuse in eine 37 ° C vorgewärmten Käfig unmittelbar nach der Transplantation. Um die Maus sorgen in der Lage, bequem zu atmen, legen Sie die Maus auf die Seite in den Käfig einMiktion Kontakt zwischen dem Käfig Betten und der Operationsstelle. </li><li> Überwachen Sie die Mäuse, bis die Betäubung die Nähte zu gewährleisten nachlässt bleiben geschlossen und die Mäuse wieder in Vorchirurgischer Bedingungen. </li><li> Sicherstellen, dass die Mäuse mit normalem Trinkwasser und Lebensmittel zur Verfügung gestellt. Nach 1 Stunde, bringen Sie den Käfig an der Maus Raum des Tieres Zentrum und die Mäuse täglich überwachen. </li></ol> 4. Nachweis von transplantierten menschlichen Leber-Zellen abgeleiteten Hepatozyten in der Mausleber Stem Hinweis: Für die folgenden Verfahren, einschläfern alle Tiere eine Überdosis von Ketamin und Xylazin durch Genickbruch gefolgt werden. <ol><li> Bei 4 - 6 Wochen nach der Transplantation, einschläfern die Mäuse und öffnen Sie die Bauchhöhle, indem Sie gleichzeitig die Kutis Schneiden und Faszien mit chirurgische Scheren. </li><li> Präparieren Sie das Bindegewebe über dem Peritoneum, mit der Schere als Spreizer, und schneiden Sie das Peritoneum entlang der linea alba die Peritonealdialyse zu öffnenHohlraum. </li><li> Heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette, die Membran durchstechen, und schneiden Sie durch jede Seite des Brustbeins nach oben durch den Gebärmutterhals-Gürtel. </li><li> Sever die Hohlvene auf der Brustseite der Leber und ziehen Sie die Speiseröhre durch die Leber in der vorderen Richtung. Entfernen Sie die Membran, um die Leber zu entfernen. Hinweis: Achten Sie darauf, die Spitzen der Schere zu halten nach oben gerichtet, um unter eine Beschädigung der Brustorgane zu verhindern. Der Thymus hat eine Tendenz, gelegentlich an der dorsalen Seite des Sternums klammern und diese sorgfältig vermieden werden müssen. </li><li> Verwendung der Membran als Griff, beginnen die Leber aus der Bauchhöhle herausziehen. Das Innere Hohlvene wird die Leber an Ort und Stelle zu halten. Schneiden Sie das Innere Hohlvene; nicht vorzeitig zu befreien, die rechte Neben vorsichtig sein. Hinweis: Die Mäuse haben ein vier-lappigen Leber, bestehend aus einem Mittellappen, linken Lappen, rechten Lappen und den Lobus caudatus. Die Gallenblase ist in der kleinen Gabelung suspendiertendie Mittellappen. </li><li> Trennen Sie die Lappen voneinander an den Übergängen und betten sie in optimale Schnitttemperatur (OAT) Verbindung nach dem Protokoll des Herstellers. Frieren Sie das OAT das Lebergewebe in den Metallgittern auf dem Kryostaten enthält. </li><li> Schneiden Sie 5 um dicke Probenabschnitte einen Kryostat bei -18 ° C unter Verwendung und montieren sie auf RT Mikroskop-Objektträger. Lagern Sie die Lager bei -80 ° C. Bereiten Sie die Folien für Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) und Immunfluoreszenzanfärbung nach zuvor berichteten Verfahren 16. </li></ol> 5. Nachweis von Humanalbumin-Sekretion und Berechnung der Rate Chimäre <ol><li> Menschliche Leber Rekonstitution messen, führen Humanalbumin ELISA unter Verwendung von Serum und einer menschlichen Albumin-ELISA-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Berechnen Sie die humanisierte Leber chimären Rate von real-time PCR-Analyse der Expressionsniveaus in der gesamten-humanisiert Leber. Zur Ermittlung der relativen expression Pegelverhältnis von human-spezifischen Aktin zu Mensch-Maus Quer Aktin (Verhältnis 1) und das Verhältnis von Maus-spezifischen Aktin an Mensch-Maus Quer Aktin (Verhältnis 2). Die chimären Rate wird als Verhältnis 1 / (Verhältnis 1 + Verhältnis 2) berechnet. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Jüngste Studien haben gezeigt , dass die Maus Leber kann mit humanen Hepatozyten neu besiedelt werden, einschließlich Erwachsenen Hepatozyten und proliferative hepatische Stammzellen 17. Diese repopulated Lebern wurden als präklinische Versuchsmodelle für Arzneimittelmetabolismus Test und Arzneimittelentdeckung und -entwicklung 18 verwendet wird ; Darüber hinaus haben sie eine in vivo Umgebung für die Zellreifung und Differenzierung 19 versehen. Das Hauptziel der vorliegenden St...

Mäuse werden häufig für pharmazeutische Tests verwendet, da die biomedizinische Forschung am Menschen eingeschränkt ist1; diese Modelle sind jedoch nicht immer nützlich, da sie die beim Menschen beobachteten Effekte ungenau simulieren können. Die meisten Medikamente, die derzeit medizinisch verwendet werden, werden hauptsächlich in der Leber metabolisiert. Ein und dasselbe Medikament kann jedoch aufgrund von Unterschieden zwischen den Spezies in der Leber von Mäusen und Menschen in unterschiedliche Metaboliten metabolisiert werden. Daher ist es oft schwierig, während der Entwicklung festzustellen, ob ein potenzielles Medikament Risiken für die klinische Anwendung birgt2,3. 
Um dieses Problem zu lösen, wurden "humanisierte" Mauslebern entwickelt, indem menschliche Leberzellen in Mäusen gezüchtet wurden4-6; diese Modelle zeigen Arzneimittelreaktionen, die denen in der menschlichen Leber ähneln. Zu den primären Mausmodellen, die derzeit für die humanisierte Lebererzeugung verwendet werden, gehören Uroplasminogenaktivator-Mäuse (uPA+/+)4,7, Fumarylacetoacetat-Hydrolase (Fah-/--) Mäuse6 und die kürzlich berichteten Thymidinkinase (TK-NOG)-Mäuse. 
Frühere Berichte haben jedoch gezeigt, dass transplantierte menschliche unreife Zellen oder Stammzellen in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) Mauslebern8-10 weniger wettbewerbsfähig sind als adulte menschliche Hepatozyten. Darüber hinaus bieten Fah-/-Mäuse nur für differenzierte Hepatozyten und nicht für unreife Lebervorläuferzellen einen Wachstumsvorteil11. Die Transplantation von humanen hepatischen Stammzellen (HpSCs) in TK-NOG-Mäuse im Labor war bisher nicht erfolgreich. Daher gibt es derzeit kein brauchbares Mausmodell für die effiziente Transplantation von menschlichen unreifen Leberzellen. 
Daher haben wir ein neuartiges Alb-TRECK/SCID-Mausmodell entwickelt, das effizient mit menschlichen unreifen Hepatozyten bestückt werden konnte. Dieses transgene Mausmodell exprimiert humane Heparin-bindende EGF-ähnliche Wachstumsfaktor-Rezeptoren (HB-EGF) unter der Kontrolle eines leberzellspezifischen Albumin-Promotors. Nach der Verabreichung von Diphtherietoxin (DT) entwickeln diese Mäuse aufgrund der bedingten Ablation von Hepatozyten eine fulminante Hepatitis, die den Aufenthalt und die Proliferation von Spenderzellen ermöglicht12. Obwohl in früheren Studien13,14 Maus-Hepatozyten erfolgreich in Alb-TRECK/SCID-Mäuse transplantiert wurden, wurde die Erzeugung einer humanisierten Leber mit Alb-TRECK/SCID-Mäusen noch nicht berichtet. 
In dieser Studie wurden humanisierte Lebern in Alb-TRECK/SCID-Mäusen durch Transplantation von HpSCs erzeugt. Diese humanisierte Leber bietet eine In-vivo-Umgebung für die universelle Differenzierung von Stammzellen und die Möglichkeit, Stoffwechselmuster und Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln beim Menschen vorherzusagen.

<table><tbody><tr><td>Humanes Albumin</td><td>Sigma</td><td>A6684</td><td>Maus</td></tr><tr><td>Mensch CK19</td><td>Dako</td><td>M088801</td><td>Maus</td></tr><tr><td>Menschliche Zellkerne</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Maus</td></tr><tr><td>Mensch CK8/18</td><td>Progen</td><td>GP11</td><td>Meerschweinchen</td></tr><tr><td>CDCP1</td><td>Biolegend</td><td>324006</td><td>Maus</td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>559869</td><td>Maus</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>551479</td><td>Maus</td></tr><tr><td>GOT/AST-PIII</td><td>Fujifilm</td><td>14A2X10004000009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Diphtherietoxin</td><td>Sigma</td><td>D0564-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Humanalbumin ELISA Kit</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (1 ml)</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>32G 1/2" Nadel</td><td>TSK</td><td>PRE-32013</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound (118 ml)</td><td>Sakura Finetek Japan</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Hochgeschwindigkeits-Zellsortierer</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>DRI-CHEM 7000</td><td>Fujifilm</td><td>14B2X10002000046</td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung eines humanisierten maus-leber unter einsatz von menschlichem leberstammzellen

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Ein neuartiges Tiermodell mit chimären Mäusen mit humanisierten Lebern, das durch eine humane Hepatozytentransplantation etabliert wurde, wurde entwickelt. Diese Mäuse, bei denen die Leber wieder mit funktionsfähigen menschlichen Hepatozyten besiedelt wurde, könnten als nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Biologie menschlicher Leberzellen, des Arzneimittelstoffwechsels und anderer präklinischer Anwendungen dienen. Einer der Schlüsselfaktoren, die für eine erfolgreiche Transplantation menschlicher Hepatozyten in Mäuse erforderlich sind, ist die Eliminierung der endogenen Hepatozyten, um eine Konkurrenz mit den menschlichen Zellen zu verhindern und einen geeigneten Raum und eine geeignete Mikroumgebung für die Förderung der Expansion und Differenzierung menschlicher Spenderzellen zu schaffen. Bisher wurden zwei große Mausmodelle für Leberschäden etabliert, bei denen Fumarylacetoacetat-Hydrolase (Fah) und Uroplasminogen-Aktivator (uPA) verwendet werden. Fah-Mäuse werden jedoch hauptsächlich mit reifen Hepatozyten verwendet und die Anwendung des uPA-Modells ist durch eine verminderte Zucht eingeschränkt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Alb-Toxin-Rezeptor-vermittelte Zell-Knockout-Mäuse (TRECK)/SCID-Mäuse für die in vivo-Differenzierung unreifer humaner Hepatozyten und die humanisierte Lebergenerierung eingesetzt. Humane hepatische Stammzellen (HpSCs) besiedelten erfolgreich die Lebern von Alb-TRECK/SCID-Mäusen, die nach einer Behandlung mit Diphtherietoxin (DT) ein letales fulminantes Leberversagen entwickelt hatten. Dieses Modell einer humanisierten Leber in Alb-TRECK/SCID-Mäusen wird funktionelle Anwendungen in Studien zum Arzneimittelmetabolismus und zu Arzneimittelwechselwirkungen haben und andere in vivo und in vitro Studien fördern.

Alb-TRECK / SCID - Mäuse - Hepatozyten exprimieren das menschliche DT Rezeptor HB-EGF - Gen unter der Kontrolle eines Albumin - Promotor und nach Verabreichung DT 12 cytotoxische Effekte aufweisen. Um die Auswirkungen der DT-Behandlung auf eine Leberschädigung, DT-Dosen von 1,5 &amp; mgr; g / kg zu bewerten, wurden in injizierten 8 Wochen alte Alb-TRECK / SCID-Mäuse und die pathologischen Veränderungen in der Leber 48 h nach Verabreichung DT wurden histologisch untersucht. Im ...

Hier präsentieren wir ein neuartiges humanisiertes Mauslebermodell, das in Alb-Toxin-Rezeptor-vermittelten Zell-Knockout-Mäusen (TRECK)/SCID-Mäusen nach der Transplantation von unreifen und expandierbaren humanen Leberstammzellen erzeugt wurde.

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Stammzelltransplantationsverfahrens besteht darin, ein neuartiges chimäres Mausmodell mit menschlicher Leberfunktion mithilfe menschlicher unreifer hepatischer Stammvorläuferzellen zu erzeugen, die Zellproliferation, Reifung und Differenzierung zur Erfassung des Arzneimittelmetabolismus ermöglichen. Diese Methode stellt ein leistungsstarkes Werkzeug dar, um ein Mikromilieu zu schaffen, das die Progenese menschlicher Spender-hepatischer Stammzellen unterstützt, um diese zu vermehren, zu differenzieren und die geschädigte Leber der empfängenden Maus wiederherzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass gereifte proliferierte Zellen verwendet werden können und die Leber nahezu vollständig rekolonisiert wird.Beginnen Sie damit, eine Stammlösung von einem Milligramm pro Milliliter Diphtherietoxin oder DT herzustellen, indem Sie ein Milliliter phenolisiertes 0,85-%-Natriumchlorid-Lösung zu einem Milligramm DT hinzufügen. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von DT durch, indem Sie eine Albtrek-SCID-Maus in dorsaler Rückenlage halten und unterhalb der Kniebeuge links oder rechts der Mittellinie die Nadel in einem Winkel von 45 Grad zum Körper einführen. Injizieren Sie mit einer Insulinspritze 100 Mikroliter einer frisch hergestellten DT-Lösung mit einer Konzentration von 0,3 Mikrogramm pro Milliliter pro 20 Gramm Maus. 48 Stunden nach der DT-Injektion wird die Maus in einen Fixierapparat gebracht und der Schwanz etwa 10 Minuten lang in einem Wasserbad mit 30 Grad Celsius erwärmt, um die Blutgefäße zu weiten.Dann zwei Zentimeter von der Schwanzspitze entfernt, mit einer scharfen Skalpellklinge einen einen Millimeter langen Schnitt in den Schwanz machen und mit einem Kapillarrohr das Blut sammeln. Das Mikrokappillarrohr mit dem Blut bei 1500 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren und das Serum gewinnen, indem man den Überstand vom Zellpellet trennt. 50 Mikroliter einer 1:20-Verdünnung des Serums auf GOT-ASTP3-Slides pipettieren.Dann unter Verwendung eines vielseitigen automatischen Trockenchemie-Analysators gemäß der Herstellerprotokoll die Extinktion des Reaktionsprodukts bei 650 Nanometern messen. Unter Verwendung eines Zellseparators humane hepatische Stammzellen aus primären humanen fetalen Leberzellen mit den Zellantigenen CDCP1, CD90 und CD66 isolieren, um eine CDCP1-positive, CD90-positive, CD66-negative Teilpopulation zu erhalten. Die Zellen in mit Kollagen vier kodierten Kulturschalen ansiedeln und bei 37 Grad Celsius inkubieren.Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht haben, die Zellen einmal mit PBS waschen. Anschließend 0,05 % Trypsin-EDTA hinzufügen und bei Raumtemperatur inkubieren. Wenn die Zellen unter dem Mikroskop frei schwebend oder fließend erscheinen, die enzymatische Verdauung durch Zugabe von acht Milliliter DMF12 mit 10 % FBS stoppen.Mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette die Zellen langsam suspendieren, bevor sie in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführt werden. Die Zellen bei 100 × g und 4 °C fünf Minuten lang zentrifugieren. Mit 10 Millilitern DMEM/F12 mit 10 % FBS das Zellpellet vorsichtig resuspendieren und ein Zellzählgerät verwenden, um die Zellanzahl zu bestimmen.Teilen Sie die Zellen in Aliquote von je einer mal 10 hoch sechs Zellen pro 50 Mikroliter PBS pro Maus auf und lagern Sie sie auf Eis, bis zur Transplantation. Nachdem eine Maus gemäß dem schriftlichen Protokoll anästhesiert wurde, überprüfen Sie die Reflexe durch leichtes Zudrücken des Hinterfußpolsters. Tragen Sie anschließend Tierarzt-Salbe auf die Augen auf, um Austrocknung zu verhindern.Den Operationsbereich mit elektrischen Haarschneidemaschinen rasieren und mit 70 % Ethanol sowie Povidon-Iod zur Desinfektion behandeln. Einen einen Zentimeter langen Hautschnitt in der linken Flanke knapp unterhalb des Rippenbogens anlegen. Anschließend einen Schnitt in der linken Bauchwand und danach einen Schnitt in das Peritoneum führen.Als Nächstes exponieren Sie vorsichtig die Milz. Führen Sie dann unter einem Winkel von fünf Grad eine 100-Mikroliter-Mikroinjektionsspritze mit einer 32-Gauge-einhalb-Zoll-Nadel in einer Tiefe von der Hälfte der Dicke der Milz ein und injizieren Sie direkt von einem Ende des Organs zum anderen eine Zellmenge von ein mal 10 hoch sechs humanen hepatischen Stammzellen in 50 Mikrolitern PBS in das Organ, und ziehen Sie anschließend die Nadel heraus. Um ein Austreten der Zellen nach der Injektion zu verhindern, üben Sie mit einem Finger sanft zwei Minuten lang Druck aus.Legen Sie die Milz zurück in den Körper der Maus und verwenden Sie einen normalen Laufstich für die Muskulatur und die Haut, um die Körperhöhle zu verschließen. Überführen Sie die Maus unverzüglich seitlich in einen auf 37 Grad Celsius vorgewärmten Käfig. Vermeiden Sie Kontakt zwischen dem Einstreu im Käfig und der Operationsstelle, und überwachen Sie das Tier gemäß dem schriftlichen Protokoll.Vier bis sechs Wochen nach der Transplantation, nachdem die Maus gemäß dem Textprotokoll euthanasiert wurde, öffnen Sie mit einer Schere die Bauchhöhle, indem Sie gleichzeitig die Haut und die Faszie durchtrennen. Verwenden Sie die Schere als Spatel, um das Bindegewebe über dem Peritoneum entlang der Linea alba zu dissezieren und so die Bauchhöhle zu öffnen. Heben Sie mit einer Pinzette das Brustbein an.Dann durchstechen Sie das Zwerchfell und schneiden an jeder Seite des Brustbeins bis zum Halswirbel hinauf. Durchtrennen Sie die Vena cava auf der thorakalen Seite der Leber und ziehen Sie die Speiseröhre in anteriorer Richtung durch die Leber hindurch. Entfernen Sie das Zwerchfell und ziehen Sie mithilfe dessen als Griff die Leber aus der Bauchhöhle heraus.Die Vena cava inferior hält die Leber an Ort und Stelle. Schneiden Sie daher die Vena cava inferior durch, wobei darauf geachtet werden muss, die rechte Nebenniere nicht vorzeitig zu lösen. Trennen Sie die Leberlappen an ihren Verbindungsstellen voneinander und betten Sie sie gemäß der Anweisungen des Herstellers in OCT ein.Die OCT mit dem Lebergewebe in den Metallgittern am Kryostaten einfrieren. Mit dem Kryostaten fünf Mikrometer dicke Probenschnitte bei minus 18 Grad Celsius schneiden und auf Objektträgern mit Raumtemperatur aufbringen. Den Vorrat bei minus 80 Grad Celsius lagern.Schließlich bereiten Sie die Objektträger gemäß zuvor beschriebener Verfahren für die H&E-Färbung und gemäß dem Textprotokoll für das ELISA vor. Wie in diesen H&E-gefärbten Schnitten gezeigt, wiesen die mit DT behandelten Mäuse eine desorganisierte hepatische Architektur auf und zeigten eine Korrektur der Kongestion mit erhöhter serumstammiger AST-Aktivität. Sechs Wochen nach der Transplantation rekonstituierten aus humanen hepatischen Stammzellen abgeleitete Zellen die Leberstruktur, indem sie die residenten Maushepatocyten ersetzten.Makroskopisch wurden vier Tage nach der Transplantation kleine, gleichmäßig um die Leber verteilte humane hepatische Zellverbände nachgewiesen. Nach 45 Tagen hatten sich diese Zellverbände zu größeren Verbänden vermehrt. Wie hier zu sehen, wurde das Vorhandensein menschlicher Hepatozyten in Mauslebern erstmals sechs Wochen nach der Transplantation durch Färbung mit Antikörpern gegen humane Kerne sowie Cytokeratin 8/18 bestätigt.Menschliche ALB-positive und CK19-negative Hepatozyten ähnelten funktionellen Hepatozyten, während Zellen, die sowohl für menschliches ALB als auch für CK19 positiv färbten, eine bipotente Differenzierungsfähigkeit in Hepatozyten und Cholangiozyten zeigten. Es wurden mehrere runde Zellverbände beobachtet, die die Leberlappen umgaben und klare menschliche Kerne sowie Expression von CK8/18 aufwiesen, was die koloniebildende Fähigkeit menschlicher hepatischer Stammzellen in den humanisierten Lebern belegt. Schließlich erreichte der Rekapitalisierungsgrad innerhalb eines Monats nach Transplantation bis zu 90 %, und die Sekretion menschlichen Albumins wurde in den rekapitalisierten Mauslebern nachgewiesen.Wenn die chirurgische Zelltransplantation einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass Leberschäden auf die elastische Leber beschränkt bleiben sollten. Bei Zellaustritt muss die Zelltransplantation verhindert werden.In Kombination mit diesem Verfahren können andere Methoden wie die Gen-Transfektion für die direkte Umdifferenzierung von menschlichen Zellen in vitro durchgeführt werden, um die Konvergenz menschlicher Zellen mit unserem derzeitigen Modell zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Hepatologie den Weg, um menschlichen Arzneistoffwechsel, Arzneimittel-Wechselwirkungen, hepatische Toxizität und Hepatitisviren in einem humanisierten Lebermodell zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hepatische Stammzellen isoliert und vergrößert, eine Leberschädigung induziert und Zellen über die Milz transplantiert, um ein chimäres Mausmodell mit menschlicher Leberfunktion zu erzeugen.Vergessen Sie nicht, dass Diphtherietoxin kontrolliert werden kann, und wichtige Vorsichtsmaßnahmen wie die Vermeidung einer Nekrose von Herz und Leber stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Die Generierung und Charakterisierung von Tumor-spezifischen T-Zellen mit humanisierten Mäusen wird hier beschrieben. Menschliche Thymus-Gewebe und gentechnisch veränderten humanen hämatopoetischen Stammzellen in immungeschwächten Mäusen transplantiert. Hierdurch ergibt sich der Rekonstitution eines konstruierten menschliche Immunsystem so zur in vivo-Untersuchung von Anti-Tumor-Immunantwort.

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Dieses Video demonstriert eine Methode zur Generierung eines dualen humanisierten Mausmodells mit einem menschlichen Immunsystem und Leberzellen. Dabei werden menschliche Leberzellen und hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen durch intrasplenische Injektion in eine transgene immundefiziente Maus transplantiert, was zur Transplantation von Leberzellen und zur Entwicklung menschlicher Immunzellen führt.

Entwicklung eines humanisierten Mausmodells mit menschlichen Leberzellen und Immunzellen

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Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Konstruktion eines humanisierten Knochenmark-/Leber-/Thymus-Mausmodells mit stammzellbasierter künstlicher Immunität gegen HIV-Infektionen.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine menschliche Leber chimärer Maus-Modell der Familiäre Hypercholesterinämie mit menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten zu generieren. Dies ist ein wertvolles Modell zum Testen neuer Therapien für Hypercholesterinämie.

Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten

Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Ansatz um Hepatozyten-wie Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem 96-well-Plattenformat zu produzieren. Dieser Prozess ist schnell und kostengünstig, so dass die Herstellung von hochwertigen Chargen von Hepatozyten-ähnliche Zellen für Grundlagen- und angewandte Forschung am Menschen versichert.

Halbautomatische Herstellung von Hepatozyten wie Zellen aus pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode, um humanisierte Mäuse mit menschlichem Immunsystem und Leberzellen zu etablieren. Dual rekonstituierte immundefizienten Mäuse, die durch intrasplenische Injektion von humanen Hepatozyten und CD34+ hämatopoetischen Stammzellen erreicht werden, sind anfällig für eine Infektion mit dem Humanimmundefizienzvirus-1 und rekapitulieren Leberschäden, wie in HIV-infizierte Patienten.

Etablierung des dualen humanisierten TK-NOG-Mausmodells für HIV-assoziierte Leberpathogenese

Orthotopische humane Leber metastasierenuvealmelanom xenograft MausModelle wurden mit chirurgischen orthotopischen Implantationstechniken mit Patienten-abgeleiteten Tumorstück und Nadelinjektionstechniken mit kultivierten menschlichen uvealen Melanom-Zelllinien erstellt.

Generierung einer Leber orthotopischen Human Enuveal Melanom Xenograft Plattform bei immundefizienten Mäusen

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Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Erfahren Sie die Erzeugung eines humanisierten Maus-Lebermodells mittels Transplantation menschlicher Leberstammzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung menschlicher Leberfunktion und Arzneimittelstoffwechsels in vivo.

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

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