Die Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion der Entwicklung Blastulae

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, parabiotische Zebrafischembryonen zu erzeugen, die zur Untersuchung der zellintrinsischen und zellextrinsischen Funktionen für Kandidatengene von Interesse verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Zellautonomie zu beantworten. Im hämatopoetischen System sind beispielsweise vitale Defekte bei der HSZ-Migration für die HSCs oder die Nischenmikroumgebung inhärent.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die verbesserte Fähigkeit, erfolgreich parabiotische Zebrafischembryonen zu erzeugen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die sich entwickelnden Embryonen extrem zerbrechlich und leicht beschädigt sind. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die chirurgischen Nahtschritte schwer zu erlernen sein können, da sie ein hohes Maß an Genauigkeit und Präzision erfordern.

Hier finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Erzeugung parabiotischer Zebrafischembryonen durch chirurgische Fusion der sich entwickelnden Blastula. Diese Methode zeigt, wie die Effizienz von parabiotischen Fusionen gesteigert und das Überleben von verbundenen Embryonen verbessert werden kann. Nach der Aufbereitung von Reagenzien und Werkzeugen gemäß Textprotokoll werden zwei bis drei modifizierte Pasteur-Pipetten hergestellt, indem das Ende der Pipette über einem Bunsenbrenner kurz erhitzt wird.

Biegen Sie dann mit einer großen Pinzette, solange es noch heiß ist, das Ende der Pipette um etwa 45 Grad. Um sicherzustellen, dass keine scharfen Kanten vorhanden sind, die die Embryonen beschädigen könnten, halten Sie das Ende der Pipette für ein bis zwei Sekunden über einen Bunsenbrenner. Unter Verwendung von Plasma-DNA, mRNA oder Morpholino werden die Embryonen innerhalb einer Stunde nach der Entnahme mikroinjiziert und sie können sich bis zum Stadium von 256 Zellen entwickeln.

Wenn sich die Embryonen dem 256-Zellstadium nähern, übertragen Sie jeden genetischen Hintergrund in separate mit Agarose beschichtete Schalen, kratzfreie Glasbecher oder Petrischale. Nach der Dechorionierung der Embryonen gemäß dem Textprotokoll die zuvor vorbereitete Methylcellulose auftauen und mit einer Tischzentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit ungelöste Kristalle pelletieren, die die Embryonen beschädigen oder das Eigelb aufbrechen. In der Zwischenzeit markieren Sie mit einem Marker 12 bis 15 vorher festgelegte Stellen auf der Unterseite einer 100 Milliliter Agarose-beschichteten Petrischale.

Nach der Zentrifugation wird dann mit der klaren oberen Fraktion der Methylcellulose ein bis 1,5 Zentimeter großer Tropfen in die markierten Stellen in der Petrischale überführt. Bereiten Sie als Nächstes ein 40-Milliliter-Aliquot eines kalziumreichen Ringers oder einer HCR-Lösung pro mit Agarose überzogenen Gericht zu, das gerade zubereitet wurde. Fügen Sie zu jedem Aliquot Antibiotika hinzu, wie hier aufgeführt.

Wenn Sie bereit sind, Blastula-Fusionen durchzuführen, verwenden Sie die Aliquots von HCR mit Antibiotika, um jede Schale, die die Methylcellulose-Tröpfchen enthält, sorgfältig zu füllen, wobei darauf zu achten ist, dass die Tröpfchen nicht gestört werden. Befestigen Sie eine modifizierte Pasteur-Pipette aus Glas, die Sie zuvor vorbereitet haben, an einer 10-Milliliter-Pipettenpumpe. Sammeln Sie dann unter einem Stereoskop einen dechorionierten Embryo von jedem Hintergrund.

Bevor Sie die beiden Embryonen abgeben, verwenden Sie die Pasteur-Pipette, um eine kleine Vertiefung in der Mitte des Methylcellulosetropfens zu machen. Legen Sie dann die beiden Embryonen in die Vertiefung ab. Verwenden Sie nun eine Nadel mit einer Gelladespitze am Ende und führen Sie sanfte Schwungbewegungen aus, ohne die Embryonen direkt zu berühren, um die Embryonen vorsichtig innerhalb der Methylcellulose neu zu positionieren, so dass sich ihre tierischen Pole direkt berühren.

Die richtige Ausrichtung der sich entwickelnden Embryonen bestimmt, wie die Embryonen verschmelzen und sich entwickeln. Stellen Sie bei Kopf-an-Kopf-Fusionen sicher, dass jede Fusion an ihren Tierpolen ausgerichtet ist. Lassen Sie die Embryonen fünf Minuten lang ruhen, damit sich die Methylcellulose um sie herum absetzen kann.

Laden Sie während dieser Zeit das nächste Paar in einen anderen Drop. Um die Operation durchzuführen, wickeln Sie jeden Embryo vorsichtig mit dem Glasnadelwerkzeug an seiner Kontaktstelle auf. Ziehen Sie dann mit einer sanften Nähbewegung die Zellen vom ersten Embryo in den zweiten Embryo und wieder zurück.

Halten Sie die Nadel am Ende der Bewegung zwei bis drei Sekunden lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie ganz langsam wegziehen. Präzision mit der Glasnadel ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Embryonen richtig zusammengenäht werden. Es muss darauf geachtet werden, dass die Dottersäcke nicht beschädigt werden, während eine ausreichende Verbindung für eine erfolgreiche Fusion erhalten bleibt.

Lassen Sie die Embryonen 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Nähen Sie in der Zwischenzeit weitere Paare von Embryonen. Beurteilen Sie nach der Inkubation, ob die Embryonen anhaftend geblieben sind, und wiederholen Sie den Verwundungsschritt, falls erforderlich.

Inkubieren Sie die Embryonen über Nacht in der gleichen Schale und im gleichen Medium bei 28,5 Grad Celsius. Bis zum nächsten Morgen haben sich die Embryonen aus der meist gelösten Methylcellulose entfernt. Entferne alle Embryonen, die nicht erfolgreich verschmolzen sind.

Dekantieren Sie dann das Medium und verwenden Sie 25 Milliliter E3, um es zu ersetzen. Um Bilder der fusionierten Embryonen zu erhalten, bereiten Sie Agarose mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 0,8 % vor. Noch heiß aliquotieren Sie 1 Milliliter der Agarose in 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen, die in einen 37 Grad Celsius heißen Heizblock gesetzt werden.

Betäuben Sie die parabiotischen Embryonen, indem Sie den 25 Millilitern E3-Medium, das die Embryonen enthält, einen Milliliter von vier Milligramm pro Milliliter pH 7,0 Tricain hinzufügen. Schwenken Sie die Schale vorsichtig, so dass sich die Embryonen in der Mitte sammeln. Ziehen Sie dann mit einer Kunststoff-Transferpipette mit breiter Spitze die Embryonen in so wenig Flüssigkeit wie möglich auf.

Drehen Sie dann die Pipette aufrecht und lassen Sie die Embryonen vorsichtig hüpfen, so dass sie sich ganz unten in der Pipette absetzen. Übertragen Sie dann die Embryonen auf ein 1-Milliliter-Aliquot mit niedrigem Schmelzpunkt von Agarose, indem Sie die Pipettenspitze leicht auf der Oberfläche der Agarose berühren. Entsorgen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Pipette und mischen Sie die Embryonen vorsichtig mit der Pipette in die Agarose.

Übertragen Sie dann mit der Pipette die Agarose und die Embryonen in die Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit Glasboden. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop eine Gelladespitze, die am Ende einer Nadel befestigt ist, um die Embryonen nahe am Deckglas und in der gewünschten Ausrichtung für die Bildgebung zu positionieren. Nachdem die Agarose ausgehärtet ist und Medium mit Tricain in die Vertiefungen gegeben wurde, verwenden Sie ein konfokales Konfokalmikroskop mit invertiertem Weitfeld-Epifluoreszenz-Laserscanning oder ein konfokales Spinning-Disk-Mikroskop, um Bilder aufzunehmen.

Verwenden Sie für ein Sichtfeld des gesamten Embryos ein 4X-Objektiv. Verwenden Sie ein 20-faches Objektiv, um ein bestimmtes Gewebe abzubilden. Verarbeiten Sie die Bilder gemäß dem Textprotokoll.

Wie hier gezeigt, wurden die Embryonen nach dem Ausrichten zweier Blastula, deren tierische Pole einander zugewandt waren, an ihrem Kontaktpunkt vorsichtig verwundet. Ein höherer Grad an Verwundung erhöhte die Wahrscheinlichkeit, dass die Embryonen eine Verbindung aufrechterhielten, die zu einer erfolgreichen Fusion ohne zusätzliche morphologische Defekte oder verzögerte Entwicklung führte. Wie in dieser Abbildung gezeigt, wurden durch die Ausrichtung der beiden Blastula mit ihren direkt ausgerichteten Tierpolen zuverlässige Kopf-an-Kopf- oder Dottersack-zu-Dottersack-Fusionen mit gemeinsamer Zirkulation erzeugt.

In den meisten Fällen hatten die Embryonen zwei Herzen, die einen gemeinsamen Kreislauf pumpten. Um zu bestätigen, dass die Embryonen tatsächlich ihren Kreislauf teilen, wurden fusionierte transgene Embryonen mit GFP-positiven Erythrozyten mit Embryonen fusioniert, die mCherry-positive vaskuläre Endothelzellen aufwiesen. Wie in diesem Film zu sehen ist, wurden 48 Stunden nach der Befruchtung GFP-positive Erythrozyten beobachtet, die durch den Flik 1 HRAS mCherry-Partnerembryo zirkulierten.

Um die zeitliche Kontrolle der Genexpression zu untersuchen, wurde schließlich einem der beiden Embryonen ein hsp70 EGFP-DNA-Konstrukt injiziert. Nach einem kurzen 30-minütigen Hitzeschock bei 37 Grad Celsius wurde in einem der Embryonen ein klares GFP-Signal festgestellt, und in einigen Fällen wurden GFP-positive Zellen im nicht injizierten Partnerembryo zirkulieren gesehen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, vorsichtig zu sein, wenn Sie die beiden Blastula zusammennähen, und Fusionen erneut durchzuführen, wenn die Operation beim ersten Versuch nicht erfolgreich war. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden wie die Bildgebung von lebenden Zellen verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob Wildtyp-HSCs in einer mutierten Nische normal funktionieren können oder umgekehrt, ob mutierte HSCs in einer Wildtyp-Nische funktionieren können. Diese Technik stellt Forschern auf dem Gebiet der Hämatologie eine leistungsfähige Methode dar, um die Regulation der Blutentwicklung im Zebrafisch zu untersuchen.

Vergessen Sie nicht, dass Tricaince gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter Sicherheitskleidung bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen und unsere empfohlenen Techniken befolgt haben, hoffen wir, dass Sie in der Lage sein werden, bessere biotische Zebrafischembryonen mit größerem Erfolg zu erzeugen.