Name: Die Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion der Entwicklung Blastulae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Lernen Sie die chirurgische Fusion von Zebrabärbling-Blastulen zur Erzeugung parabiotischer Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellautonomer und nicht-zellautonomer Genfunktionen in vivo.

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Wir danken Julie R. Perlin für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. D.I.S. wird durch Zuschüsse der American Society of Hematology, der Cooley's Anemia Foundation und der NIH (K01DK085217 und R03DK100672) unterstützt. E.J.H. ist ein Howard Hughes Medical Institute Fellow der Helen Hay Whitney Foundation. B.L. ist ein Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. wird durch ein Irvington Fellowship des Cancer Research Institute und einen Young Investigator unterstützt Auszeichnung der Conquer Cancer Foundation der ASCO. Das L.I.Z. wird durch Zuschüsse des NIH (R01CA103846, P01HL032262 und R01HL04880), der Taub Foundation for MDS Research, des Harvard Stem Cell Institute unterstützt und ist Forscher des Howard Hughes Medical Institute.

Dieses Protokoll wurde von Boston Kinderkrankenhaus Animal Care und Use Committee genehmigt. Dieses Protokoll wird von einem zuvor veröffentlichten Verfahren 15 modifiziert. 1. Vorbereitung der Reagenzien (Tage oder Wochen im Voraus) <ol><li> Bereiten Sie 1,5% Agarose-beschichteten Schalen. In 1,5 g Agarose zu 100 ml Zebrabärbling E3 Medium in einem Erlenmeyerkolben. Wärme, lösen sich die Agarose und dann etwa 5 ml in 100 mm Durchmesser x 20 mm tief Petrischalen gießen. Anmerkung: Diese werden verwendet für dechorionation von Embryonen (Schritt 3.1) und für die parabiotic Operation (Schritt 3.3). Bewahren Sie Agarose-beschichteten Schalen bei 4 ° C für ein paar Wochen; nehmen sie aus dem Kühlschrank und warm am Morgen des Tages der parabiotic Operation auf RT. </li><li> Herstellung von 4% Methylcellulose. Man löst 4 g Methylcellulose-Pulver in 100 ml E3 in einem Erlenmeyerkolben mit einem Rührstab. Der Kolben wird auf einer Rührplatte bei 4 ° C, auf die niedrigste Geschwindigkeit, und lassen Sie es mischenfür bis zu 2 Tage. <ol><li> verwenden Intermittently einem Spatel weißen Klumpen von Methylcellulose aufzubrechen. Die Methylcellulose Kristalle lösen sich nicht vollständig in dieser Konzentration. Wenn wird die Lösung klar und homogen erscheint mit keine weißen Klumpen verbleibenden aliquote die Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und gefrier bei -20 ° C für die Langzeitlagerung. Hinweis: Geringere Konzentrationen von Methylcellulose können verwendet werden; aber diese höheren Prozentsatz, zähflüssiger Methylcellulose hat die besten Ergebnisse erzielt. </li></ol></li><li> Bereiten High Calcium Ringer (HCR) Lösung. Zu 400 ml der HCR - Lösung herzustellen, 8 ml 5M NaCl mischen (116 mM Endkonzentration), 400 &amp; mgr; l 3 M KCl (2,9 mM Endkonzentration), 800 &amp; mgr; l 5 M CaCl 2 (10 mM Endkonzentration) und 2 ml 1M HEPES (5 mM final) mit 390 ml E3 Medien. Hinweis: Bewahren HCR Lösung bei 4 ° C für ein paar Wochen; warme am Morgen des Tages der parabiotic Operation auf RT. </li><li> Bereiten Sie 5 - 6 modifizierte Pasteurpipetten für den TransferRing blastula Paare. kurz erhitzen das Ende der Pipette über einem Bunsenbrenner. Dann großen Pinzette, biegen Sie das Ende der Pipette auf etwa 45 ° C, während es noch heiß ist. <ol><li> Um sicherzustellen, dass keine scharfen Kanten, die Embryonen schädigen könnten, halten Sie die Spitze der Pipette kurz in der Flamme für etwa 3 Sekunden. Dies wird glätten / polieren das Ende der Pipette. Diese modifizierte Glaspasteurpipette wird in Verbindung mit einer 10 ml Pipette Pumpe (1) in Schritt 3.5 unten verwendet. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Glasnadel Werkzeuge für chirurgische Nähte von blastula Paare. Ziehen Sie 2 - 3 Glasnadeln wie für die Mikroinjektion von Zebrafischembryonen durchgeführt. Verwenden Sie Lab-Film jedes Glas Nadel bis zum Ende eines holz- oder kunststoff behandelt teasing Nadel (Abbildung 1A) zu beheben. Mit einer Pinzette, brechen das Ende der Nadel bei einem Durchmesser von ca. 20 aus - 30 um. Verwenden Sie einen Stufenmikrometer diesen Schritt (1B) zu führen. Hinweis: Die Größe des needle Spitze ist wichtig. Wenn die Spitze zu groß ist, wird es schwierig, genau zu steuern und zu übermäßigen Schaden verursachen können. Wenn die Spitze zu klein ist, ist es schwierig, ausreichend die Embryonen aufgewickelt. </li></ol> 2. Einrichten Brutpaare von Zebrabärbling und Sammlung von Embryonen (Tag -1 bis Tag 0) <ol><li> Richten Sie Brutpaare von erwachsenen Zebrafisch. Richten Sie Fisch in der Nacht vor der Parabiose Operation durchgeführt werden soll. Verwenden Sie Teiler Männchen und Weibchen zu trennen. Um die Chancen zu erhöhen, dass die gewünschten Embryonen werden mehrere Paare von jeder Zeile erhalten, eingerichtet. Wir finden, dass typischerweise 20 - 50% der Paare laichen. </li><li> Am nächsten Morgen ziehen die Teiler und Paarung zu ermöglichen. Sammeln Sie alle Embryonen einen feinmaschigen Teesieb verwendet, übertragen sie dann auf eine Petrischale mit E3 Embryo Medium 18. </li><li> Micro-injizieren Embryonen nach Wunsch (zB mit 25 pg Plasmid - DNA, 200 pg mRNA oder mit 1 bis 6 ng Morpholin) innerhalb 1 Stunde der Sammlung. Lassen Sie sie aufbis 256-Zellen-Stadium wachsen. Wenn das DNA - Expressionskonstrukt unter der Kontrolle eines Hitzeschock - Promotors gestellt wird (zB hsp70, 4B), steuern die Zeitsteuerung der Genexpression durch Wärme schocken die parabionts bei 37 ° C zu einem späteren Zeitpunkt (z. B. bei 36 hpf ). Anmerkung: Als Alternative zu einem fluoreszierenden Transgen können fluoreszierende Dextran an die DNA, RNA zugesetzt werden oder Morpholino Injektionsmischung (beispielsweise Dextran, Cascade blue bei 2 mg / ml). Das Dextran Farbstoff wird nicht mit der normalen Entwicklung stören und können für die injizierten Embryo unter der entsprechenden Leuchtstofflampe nach parabiotic Fusion identifiziert werden. Alternativ kann die Parabiose eines pigmentierten Stamm (zB AB) mit einem nicht-pigmentierten Stamm (zB Casper) verwendet werden, um die injizierten Embryonen in späteren Stadien zu identifizieren. </li><li> Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 ° C liegt.Verwendung einer Stereoskop ihre Entwicklung in regelmäßigen Abständen, wie sie in der Nähe der 256-Zellen-Entwickler zu überwachenelopmental Stufe (ca. 2,5 HPF). Hinweis: Bei Bedarf verschieben Embryonen auf unterschiedliche Temperaturen Stufe Anpassung zwischen parabiotic Partnern zu gewährleisten (zB Morpholino-injizierten Embryonen entwickeln sich oft langsamer als ihre nicht-injizierten Pendants Verschiebung der un-injizierten Embryonen auf RT während die Morpholino-injizierten Embryonen platziert werden. bei 28,5 ° C in ihren Stufen führen nach ein paar Stunden der Entwicklung auszurichten). </li></ol> 3. Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion von Blastulae Entwicklung <ol><li> Da die Embryonen , die 256-Zellen - Stadium (etwa 2,5 HPF), übertragen Sie die Embryonen von jedem genetischen Hintergrund (dh genetische Mutante, transgenen Linien und / oder genetische Manipulation) in separate Agarose-beschichteten Schalen (zB ein Gericht für Morpholino- nähern injizierten Embryonen und eine zweite Schale für die Kontrolle Embryonen). Alternativ übertragen die Embryonen zu reinigen, kratzfreie Glasbecher oder Petrischalen aus Glas. Hinweis: Vermeiden Sie unbeschichteten Plastikschalen mit, da die Embryonen in die Kunststoff haften und einmal aus ihrem Chorion beschädigt werden. </li><li> Dekantiert die E3 Medien bis gerade genug Flüssigkeit bleibt die Embryonen zu decken (etwa 7 bis 10 ml). Zugabe von 200 ul 50 mg / ml Gemisch aus der extrazellulären Flüssigkeit von Streptomyces griseus isoliert Proteasen (Proteasen). Schwenken Sie die Embryonen vorsichtig alle paar Minuten. <ol><li> Wenn 50% der Embryonen aus ihrem Chorion gekommen sind, die in der Regel 5 nimmt - 10 min, spülen Sie sie dreimal mit einem großzügigen Volumen (ca. 15 - 20 ml) von frischen E3 Embryo Medium. <ol><li> Dechorionate alle Embryonen in ihren Chorion verbleibenden, indem sie sanft Ausarbeitung in die modifizierte Glas Pasteur Pipette und dann sanft zu zerstreuen. Sobald die Embryonen dechorionated und gewaschen worden ist, ersetzen Sie die E3 Medien mit HCR-Lösung. Als Alternative zu Proteasen, entfernen Sie die Chorion manuell einer feinen Pinzette verwenden. Ziel 60 zu haben - 100 dechorionated Embryonen für jede Versuchsbedingung zur Verfügung. Anmerkung: Dies ist ein Vielfaches mehr als letztendlich verwendet werden, aber viele Embryonen werden wahrscheinlich während der Handhabung oder der Chirurgie für Parabiose beschädigt werden. Sobald die Embryonen dechorionated sind, halten sie untergetaucht und nicht zulassen, dass sie die Oberfläche des Wassers zu berühren, da die Oberflächenspannung bewirkt, dass sie vernichtet werden. Beachten Sie, dass eine höhere Dosis von Proteasen, die Embryonen erlaubt aus ihrem Chorion früher und in einer synchronisierten Art und Weise zu kommen. Wenn eine niedrigere Dosis von Proteasen, bringen Sie die Embryonen länger von ihrem Chorion entstehen und tun dies in einer weniger synchronen Art und Weise, die in einem Teil der Embryonen beschädigt längerer Exposition durch Proteasen führen kann. </li></ol></li></ol></li><li> Auftauen Methyl (hergestellt in Schritt 1.2 oben) und Zentrifuge in einer Tischzentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 10 min ungelöste Kristalle zu pelletieren, die die Embryonen schädigen oder reißen ihren Dotters. <ol><li> Nach dem Zentrifugieren, verwenden Sie die klare obere Fraktion (etwa 75% des Volumens). Transfer 1-1,5 cm Durchmesser Tropfen Methylcellulose in einem 1,5% Agarose-beschichteten Petrischale. Achten Sie darauf, von der Unterseite des Rohres eine der pelletierten Kristalle zeichnen zu vermeiden. </li><li> Verwenden, um eine Markierung, um die Position jedes Tröpfchens an der Unterseite des Tellers vorzubestimmen. Legen Sie 12 bis 15 Tropfen (2 - 3 Teilmengen im Wert) von Methylcellulose pro 100 mm Durchmesser Petrischale. Bereiten Sie so viele Platten wie pro Experiment benötigt. Hinweis: Verwenden Sie jedes Tröpfchen für die Fusion eines einzelnen blastula Paar. Die Markierung wird die Position jedes Tröpfchen bezeichnen, sobald das Medium Mehr, an welchem ​​Punkt die Tropfen werden fast unsichtbar. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine 40 ml aliquote Menge von Antibiotika ergänzt HCR Lösung pro Agarose-beschichtete Schale oben hergestellt in Schritt 3.3. Zu jeder 40 ml Aliquot von HCR hinzufügen Penicillin-Streptomycin bei 50 U / ml, Ampicillin, bei 50 U / ml und Kanamycin mit 0,5 &amp; mgr; g/ Ml. <ol><li> Wenn Sie bereit sind blastula Fusionen durchzuführen, füllen Sie sorgfältig jedes der Gerichte mit 40 ml des Antibiotikums ergänzten HCR Lösung Methylcellulose Tröpfchen enthält. Wenn der HCR-Lösung zu schnell hinzugefügt wird, kann es um die Tröpfchen zu stören. </li></ol></li><li> Bringen Sie die modifizierte Glaspasteurpipette (hergestellt in Schritt 1.4 oben) zu einer 10 ml Pipette Pumpe. Unter einem Stereoskop sammeln ein dechorionated Embryo aus jedem Hintergrund (zB ein Morpholino-injizierten Embryo und ein Embryo Wildtyp). <ol><li> Bevor die beiden Embryonen Abgabe, verwenden Sie die Pasteur-Pipette eine kleine Vertiefung in der Mitte der Methylcellulose Tropfen zu machen, dann deponieren sanft beide Embryonen in die Depression. Hinweis: Während des Transferprozesses, drehen Sie das Pasteur-Pipette leicht nach oben, so dass die Embryonen in die Biegung des Pasteur-Pipette absetzen, um ihre Herstellung Kontakt mit der Oberfläche der Flüssigkeit am oberen oder unteren Ende der Pipette zu vermeiden (was führen kann zu their Bruch). </li></ol></li><li> Unmittelbar nach der Embryos in die Methylcellulose Ablagern, mit einem Holz- oder Kunststoffgriff Necken Nadel mit einem Gel-Ladepipettenspitze auf dem Ende (1A) , um sorgfältig die Embryonen in der Methylcellulose repositionieren , so dass ihre Tier Pole direkt berühren einander. <ol><li> Nutzen Sie sanft geschwungenen Bewegungen durch die Methylcellulose nahe an den Embryonen sie neu zu positionieren, ohne sie direkt zu berühren. Lassen Sie die Embryonen für 5 Minuten sitzen, so dass die Methylcellulose um sie herum siedeln in wird. Während dieser Zeit, laden Sie das nächste Paar in einen anderen Tropfen. Hinweis: Vermeiden Sie direkten Kontakt mit den Embryonen zu machen und besondere Sorgfalt walten lassen keinen Teil des Dottersacks zu berühren, die leicht platzen wird. </li></ol></li><li> Mit der Glasnadel Werkzeug, Wunde sorgfältig jeden Embryo in ihrem Kontaktpunkt. Mit einer sanften Bewegung Nähen, Zellen aus dem ersten Embryo in den zweiten Embryo herausgezogen werden und dann wieder zurück.Am Ende dieser Bewegung, halten Sie die Nadel an Ort und Stelle für 2 - 3 Sekunden und dann sehr langsam ziehen weg. Hinweis: Es gibt einen Zeitraum von etwa 2 bis 3 sec, nachdem die Embryonen verwundet werden, wo die beiden Geweben zu sein scheinen mehr Klebstoff und eher aneinander zu befestigen. Daher glauben wir, dass die Nadel an Ort und Stelle hält kurz nach der Verwundung die verwundeten Gewebe jedes Embryos in Kontakt für die Anfangszeit der Zeit unmittelbar nach der Verwundung zu halten hilft. </li><li> Lassen Sie diese Embryonen für 10 sitzen - 15 min bei RT. In der Zwischenzeit weiterhin neue Paare in anderen Tropfen Methylcellulose zu nähen. Nach 10 bis 15 min, zu beurteilen , ob das erste Paar befestigt ist geblieben (2A). Hinweis: Wenn die Embryonen länger angebracht, wiederholen Sie den Nähvorgang solange die Embryonen jünger sind als etwa 30% epiboly Bühne. Typischerweise kann dies bis zu drei Versuche, die Embryonen zusammenheften. Wenn erscheinen die Embryonen eine Anlage gehalten zu haben, aber die cSteckerspleiss ist nicht erheblich, führen zusätzliche Nähte am Rand der Verbindung es zu verstärken. Vermeiden Sie Schütteln oder Gerichte während der parabiotic Chirurgie und Inkubationszeiten bewegen. Hinweis: Trotz ihres frühen Entwicklungsstadium und wahrgenommen Zerbrechlichkeit, die Zellmassen der Embryonen eine erhebliche Menge an Manipulation tolerieren kann (dh, Verwundung und Nähen), und noch normal entwickeln. Das Eigelb kann jedoch Bruch mit nur der geringsten Berührung, den Embryo zu töten. Wenn die beiden Blastulae mit der Glasnaht, nicht den Kontakt mit der Schnittstelle zwischen der Zellmasse und Eigelb von jedem Embryo zu machen. </li><li> Inkubieren Sie die Embryonen O / N bei 28,5 ° C in der gleichen Gericht und Medien (nicht über die Medien ändern). Mit dem folgenden Morgen werden sich die Embryonen der meist gelösten Methylcellulose Tröpfchen ausgezogen. Entfernen Sie alle Embryonen, die nicht erfolgreich verschmolzen waren. Dekantiert die Medien und ersetzen mit einem frischen 25 ml E3. Hinweis: Wenn bei einem Arbeitspigmentierte Stamm, 500 &amp; mgr; l 0,15% (50x) Phenylthioharnstoff (PTU) bis zu einer Endkonzentration von 0,003% Pigmentierung zu blockieren. Die Embryonen müssen kontinuierlich in PTU bleiben Unterdrückung der Pigmentierung zu halten. </li></ol> 4. Mikroskopaufbau, Bildaufnahme, Verarbeitung und Analyse <ol><li> Bereiten Sie 0,8% mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarose: In 0,8 g LMP-Agarose zu 100 ml E3 und Hitze, bis sie vollständig gelöst. Während heiß, aliquoten 1 ml LMP-Agarose in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem 37 ° C Heizblock. Die LMP-Agarose bleiben wird geschmolzen bei 37 ° C. Werden 40 &amp; mgr; l 4 mg / ml (25x), pH 7,0 Tricaine zu je 1 ml Aliquot von LMP-Agarose bei 37 ° C. Hinweis: Wenn mit einer pigmentierten Stamm arbeiten, fügen Sie 20 ul 0,15% (50x) PTU zu jedem 1 ml aliquoten. <ol><li> Bewahren Sie die restlichen LMP-Agarose für mehrere Monate in verschlossenen 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Anästhesieren parabiotic Embryonen abzubildenden durch Zugabe von 1 ml von 4 mg / ml (25x), pH 7,0 Tricainezu den 25 ml der E3, dass die Embryonen bereits in. </li><li> Vorsichtig schwenken die Schale, so dass die Embryonen in der Mitte gebündelt werden. Dann eine breite bestückte Plastiktransferpipette die Embryonen in so wenig Flüssigkeit wie möglich aufzustellen verwenden. Drehen Sie die Pipette aufrecht und prallen sanft die Embryonen, so dass sie bis auf den Grund der Pipette zu begleichen. <ol><li> Mit den Embryonen am Boden der Pipette, übertragen sie zu einem 1 ml Aliquot der Agarose LMP durch leichtes die Pipettenspitze auf die Oberfläche der Agarose berühren. Vermeiden Sie überschüssige Flüssigkeit, da diese Übertragung wird die Agarose verdünnen. </li></ol></li><li> Nachdem die überschüssige Flüssigkeit aus der Pipette ausgestoßen, verwenden Sie die Pipette die Embryonen vorsichtig innerhalb der Agarose mischen, dann die Pipette verwenden, um alle der Agarose und Embryonen in die Vertiefung einer Glasboden (Nr 1.5 Deckglas) zu übertragen, 6- Well-Platte. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Pipette zu verwerfen, nachdem die Embryonen auf die Bildplatte zu übertragen. Rest Agarose wird im Inneren der Pipette eingestellt, rendering unwirksam für die weitere Verwendung. Vielmehr ist eine neue Pipette jedes Mal verwenden. </li><li> Unter einem Stereoskop, verwenden Sie ein Necken am Ende eines Holz behandelt Nadel fixiert Pipettenspitze Gel-Laden um die Embryonen nach unten in Richtung des Deckglases zu positionieren (sicherzustellen, dass sie innerhalb der Arbeitsabstand des Mikroskopobjektivs sind) und in der gewünschten Ausrichtung für die Bildgebung. Hinweis: Positionieren Sie kontinuierlich, bis die Agarose vollständig gesetzt hat. Achten Sie darauf, die parabiotic Embryonen nach der Embryo des Paares zu montieren abgebildet werden soll. In Anbetracht der zufällige Orientierung der verbundenen Embryonen für einige Paare können es beide Embryonen Bild schwierig sein. In diesem Szenario zu erholen, die Embryonen aus der Agarose eine Zange und eine breite bestückte Plastiktransferpipette und dann wieder montieren für die Bildgebung aus einer anderen Perspektive. </li><li> Nachdem die Agarose gesetzt hat, Deckel mit 2 - 3 ml E3 mit Tricaine ergänzt (und PTU falls erforderlich). </li><li> Bild die Embryonen eines invertierten Weitfeld-Epi-Fluoreszenz unter Verwendung, laser-konfokalen oder konfokalen Mikroskop drehende Scheibe. Wählen Sie das Ziel am besten geeignet für die gewünschte Bildgebung. Für einen ganzen Embryo Sichtfeld, mit einem 4-fach Objektiv. Wählen Sie eine höhere Vergrßerung, wie beispielsweise ein 20x - Objektiv, dem Bild mit einem spezifischen Gewebe 16, 19. Hinweis: Wenn ein aufrechtes Mikroskop, montieren in LMP-Agarose (ähnlich oben) auf einem Deckglas. Kehren Sie die Deckglas auf einem Glasobjektträger , die einen Ring von Vakuumfett mit dem gleichen E3-Tricaine-PTU 16, 19 gefüllt hat. </li><li> Prozess erfassten Bilder frei Bildanalyse - Software - Pakete wie NIH Bild J / FIJI 16, 19 verwendet wird . Hinweis: Count - Zellzahlen und zu quantifizieren Dynamik wie Zellmigration und die Zellteilung Segmentierung und Tracking 16 Algorithmen, 19. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Parabiotic Fusion ist ein leistungsfähiges Werkzeug gewesen , um zelluläre Funktionen von Kandidatengenen bei erwachsenen Mausmodellen und Hühnerembryonen 14.10 untersuchen. In jüngerer Zeit wurde zur Erzeugung verbunden Zebrabärbling - Embryonen 15 a blastula Fusionsverfahren beschrieben. Im vorliegenden Protokoll, Video-basierte Tutorials werden verwendet, um die Methodik zu demonstrieren und besser zu beschreiben für die Erstellung von parabiotic Genaktivität von verschiedenen genetischen Hinter...

Erstellung von genetischen Mosaiken (Chimären) zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderten Tieren ist eine gut etablierte und klassische Strategie zur Untersuchung von Zell-Eigengegenüber zell extrinsische Funktionen von Kandidatengenen 1-6. Blastula Transplantation in Zebrabärbling wurde in großem Umfang Chimären - Embryonen für die Untersuchung der Zell Autonomie 7-9 zu erzeugen , verwendet werden . In Abhängigkeit von dem Gewebe von Interesse kann es jedoch schwierig sein , vorhersagbar 7-9 Donorzellen zu dem gewünschten Gewebe (zB Blut) 1-3, abzuzielen. Maus - Genetiker haben lange parabiotic chirurgische Methoden verwendet , um verbundene Organismen mit einem gemeinsamen Kreislauf 10-14 erzeugen. Da die Tiere parabiotic eine gemeinsame Blutstrom, Wechselwirkungen zwischen Zellen teilen , die von einem Tier mit Zellen des anderen Tieres von einem anderen genetischen Hintergrund hat , kann 10-16 untersucht werden. Vor kurzem elegant Karima Kissa Gruppe demonstriert die Fähigkeit, creaß verbunden Genaktivität und dann dieses System verwenden , um 15 hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzelle (HSPC) Migration studieren. Darüber hinaus wurde kürzlich Zebrabärbling Parabiose während Zebrabärblingentwicklung 17 zur Untersuchung der Rolle der endothelialen cadherin 5 in hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Emergenz und Migration, 16 und zur Untersuchung der Rolle von Stromazellen in der HSPC Nische eingesetzt. Im Gegensatz zu Mäusen sind Genaktivität transparent und ermöglichen eine direkte Visualisierung von Zellen während der parabiotic Entwicklung, so dass das System einzigartig leistungsfähige. Die Nützlichkeit von Parabiose in Zebrabärbling, wird jedoch durch eine steile Lernkurve begrenzt und parabiotic Operation an den empfindlichen Embryonen ohne detaillierte Anleitung und visuelle Demonstration technisch anspruchsvoll sein. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Reihe von klaren, Schritt-für-Schritt-Anleitungen Videoschulungen auf zu begleiten, wie parabiotic Zebrabärblingembryonen erzeugen für das Studiumtemporal, zell intrinsische oder extrinsische zell Funktionen eines Kandidatengens (e) durch chirurgische Fusion von Blastulae entwickeln. Key Modifikationen und zusätzliche Empfehlungen zur Erhöhung parabiont Überleben und neue experimentelle Anwendungen sind im Lieferumfang enthalten.

<table><tbody><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Einzelkomponenten für E3/HCR:</td><td></td><td>Für 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Natriumchlorid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Kaliumchlorid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Calciumchlorid-Dihydrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (Magnessiumsulfat-Heptahydrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1M ) Pufferlösung</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Katalog Anzahl</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotika:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>gibco von Life technologies</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin Natriumsalz</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat von Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/ml Pronase aus Streptomyces griseus</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarglas für Nadeln (Kapillarglas & Filamente)</td><td>Sutter Instrument</td><td>ITEM#: BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Necknadeln mit Holzgriffen</td><td>Fisher</td><td>Scientific S07894</td><td></td></tr><tr><td>Glaspasteur-Pipetten</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipettenpumpe (grün) (Pipettenpumpe Pipettor)</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Durchmesser/ 20 mm tiefe Petrischalen aus Kunststoff (PETRISCHALE, 100/20 MM, PS, KLAR, MIT ENTLÜFTUNGEN, SCHWERE AUSFÜHRUNG, 15 STK./BEUTEL )</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10.000 MW, anionisch, Lysin fixierbar</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU. Der Arbeitsbestand beträgt 0,003 % (50x ist 0,15 %). für 500 ml, 0,75 g N-Phenylthioharnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Tricain (Pulver) (Tricain, Methansulfonato, Tricain-S)</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>LMP Agarose (Ultrareine LMP Agarose)</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Transferpipette (nur die mit breitem Ende, glaube ich)</td><td>Fisherbrand</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten mit Glasboden für die Bildgebung</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Western-Gel-Ladespitze aus Kunststoff, die am Ende einer Präpariernadel mit Holzgriff befestigt ist (GELoader-Spitzen)</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>Glasabdeckfolien, Objektträger und Vakuumfett bei Montage für ein aufrechtes Mikroskop:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfett ( Dow Corning&reg; Hochvakuum-Silikonfett farblos, Gewicht 5,3 oz (Tube) )</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Glasabdeckfolien</td><td>Corning Biowissenschaften</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

die erzeugung von parabiotic zebrabärbling embryonen, die durch chirurgische fusion der entwicklung blastulae

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Chirurgische Parabiose von zwei Tiere von verschiedenen genetischen Hintergründe schafft ein einzigartiges Szenario Zell-Eigengegenüber zell extrinsische Rollen für Kandidatengene von Interesse, Migrationsverhalten von Zellen zu untersuchen, und sekretiertes Signale in unterschiedlichen genetischen Einstellungen. Da parabiotic Tiere eine gemeinsame Kreislauf, jede Blut oder durch Blut übertragbaren Faktor von einem Tier gemeinsam mit dem Partner ausgetauscht werden und umgekehrt. So ist aus einem genetischen Hintergrund abgeleiteten Zellen und molekularen Faktoren kann im Kontext eines zweiten genetischen Hintergrund studiert werden. Parabiose von erwachsenen Mäusen wurde intensiv für die Forschung Alterung, Krebs, Diabetes, Fettleibigkeit, und die Entwicklung des Gehirns eingesetzt. In jüngerer Zeit hat Parabiose von Genaktivität verwendet worden, um die Entwicklungsbiologie der Hämatopoese zu studieren. Im Gegensatz zu Mäusen erlaubt die transparente Natur der Genaktivität die direkte Visualisierung von Zellen im parabiotic Zusammenhang ist ein einmalig leistungsfähiges Verfahren zur Untersuchung von f machenundamental zellulären und molekularen Mechanismen. Die Nützlichkeit dieser Technik wird jedoch durch eine steile Lernkurve begrenzt für die parabiotic Genaktivität zu erzeugen. Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Methode, wie die Blastulae von zwei Genaktivität von verschiedenen genetischen Hintergründen chirurgisch verschmelzen die Rolle der Kandidaten-Gene von Interesse zu untersuchen. Darüber hinaus sind die parabiotic Zebrabärblingembryonen Hitzeschock-tolerant, mögliche zeitliche Kontrolle der Genexpression zu machen. Diese Methode ist nicht ein ausgeklügeltes Set-up erfordert und hat breite Anwendungen für das Studium der Zellmigration, das Schicksal der Beschreibung und Differenzierung in vivo während der embryonalen Entwicklung.

In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Studien 15, erfolgreiche parabiotic Fusion von Zebrabärbling - Embryonen , hängt von der Bereitstellung und Ausrichtung der beiden Embryonen und die Konzentration von Methylcellulose. Mit nur ein paar einfache, kostengünstige Tools, operativ fusioniert Entwicklung Blastulae wurden erzeugt, die in parabiotic Embryonen mit gemeinsamen Umlauf wuchs. Diese Werkzeuge enthalten eine modifizierte Pasteurpipette, eine 10 ml - Pipette Pumpe...

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie man parabiotische Zebrafischembryonen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund erzeugt. In Kombination mit den beispiellosen Bildgebungsmöglichkeiten des Zebrafischembryos bietet diese Methode ein einzigartig leistungsfähiges Mittel, um zellautonome und nicht-zellautonome Funktionen für Kandidatengene von Interesse zu untersuchen.

Die Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion der Entwicklung Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, parabiotische Zebrafischembryonen zu erzeugen, die zur Untersuchung zelleigener versus zelläußerer Funktionen von interessierenden Kandidatengenen verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Zellautonomie zu beantworten. Beispielsweise lässt sich im hämatopoetischen System klären, ob gravierende Defekte in der HSC-Migration auf die HSCs selbst oder auf die Nischenmikroumgebung zurückzuführen sind.Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt in der verbesserten Fähigkeit, parabiotische Zebrafischembryonen erfolgreich zu erzeugen. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die sich entwickelnden Embryonen äußerst empfindlich und leicht beschädigt werden können. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die chirurgischen Nähschritte schwer zu erlernen sind, weil sie ein hohes Maß an Genauigkeit und Präzision erfordern.Hier stellen wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen bereit, um parabiotische Zebrafischembryonen durch chirurgische Fusion sich entwickelnder Blastulae zu erzeugen. Diese Methode zeigt, wie die Effizienz parabiotischer Fusionen erhöht und das Überleben verbundener Embryonen verbessert werden kann. Nachdem die Reagenzien und Werkzeuge gemäß dem schriftlichen Protokoll vorbereitet wurden, bereiten Sie zwei bis drei modifizierte Pasteurpipetten vor, indem Sie das Ende der Pipette kurz über einem Bunsenbrenner erhitzen.Dann biegen Sie mit einer großen Pinzette, während sie noch heiß ist, das Ende der Pipette um etwa 45 Grad. Um sicherzustellen, dass keine scharfen Kanten vorhanden sind, die die Embryonen beschädigen könnten, halten Sie das Ende der Pipette für ein bis zwei Sekunden über einen Bunsenbrenner. Injizieren Sie die Embryonen innerhalb einer Stunde nach der Sammlung mittels Mikroinjektion mit Plasmadna, mrna oder Morpholino und lassen Sie sie bis zum 256-Zell-Stadium entwickeln.Wenn sich die Embryonen dem 256-Zell-Stadium nähern, überführen Sie jeden genetischen Hintergrund in separate mit Agarose beschichtete Schalen, kratzfreie Glasbecher oder Petrischalen. Nachdem die Embryonen gemäß dem Textprotokoll dechorioniert wurden, tauen Sie zuvor vorbereitete Methylcellulose auf und verwenden eine Tischzentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit, um ungelöste Kristalle zu pelletieren, die die Embryonen beschädigen oder die Eigelbe zerreißen könnten. Markieren Sie derweil mit einem Stift 12 bis 15 vorbestimmte Stellen auf der Unterseite einer mit Agarose beschichteten 100-Milliliter-Petrischale.Danach nach der Zentrifugation mithilfe der klaren oberen Fraktion der Methylcellulose jeweils ein bis 1,5 Zentimeter große Tropfen auf die markierten Stellen in der Petrischale übertragen. Als Nächstes pro frisch beschichteter Agarose-Schale eine 40-Milliliter-Aliquot von Ringer-Lösung mit hohem Calciumgehalt oder HCR-Lösung vorbereiten. Zu jedem Aliquot die hier aufgeführten Antibiotika hinzufügen.Wenn die Blastulafusionen durchgeführt werden sollen, verwenden Sie die Aliquots von HCR mit Antibiotika, um vorsichtig jede Schale mit den Methylcellulose-Tropfen zu füllen, wobei darauf geachtet werden muss, die Tropfen nicht zu stören. Befestigen Sie eine zuvor vorbereitete modifizierte Glas-Pasteurpipette an einer 10-Milliliter-Pipettenpumpe. Sammeln Sie dann unter einem Stereomikroskop jeweils ein dechorioniertes Embryo aus jedem Hintergrund.Bevor Sie die beiden Embryonen ausgeben, verwenden Sie die Pasteurpipette, um eine kleine Vertiefung in der Mitte des Methylcellulose-Tropfens anzulegen. Anschließend bringen Sie die beiden Embryonen in die Vertiefung ein. Verwenden Sie nun eine feine Nadel mit einer Gel-Ladespitze am Ende, um mit sanften Wischbewegungen – ohne die Embryonen direkt zu berühren – die Embryonen innerhalb der Methylcellulose vorsichtig neu zu positionieren, sodass ihre Animalpole direkt aneinander liegen.Die korrekte Ausrichtung der sich entwickelnden Embryonen bestimmt, wie diese verschmelzen und sich weiterentwickeln werden. Für Kopf-an-Kopf-Verschmelzungen sicherstellen, dass jede Verschmelzung an den Animalpolen ausgerichtet ist. Die Embryonen fünf Minuten lang ruhen lassen, damit sich das Methylcellulose um sie herum absetzen kann.In dieser Zeit die nächste Zellpaarung in einen weiteren Tropfen geben. Um die Operation durchzuführen, mit dem Glasnadelwerkzeug vorsichtig jeden Embryo an der Kontaktstelle verletzen. Dann mit einer sanften Nähbewegung die Zellen vom ersten Embryo in den zweiten Embryo und anschließend wieder zurückziehen.Am Ende der Bewegung die Nadel zwei bis drei Sekunden lang an Ort und Stelle halten, bevor sie sehr langsam zurückgezogen wird. Die Präzision mit der Glasnadel ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Embryonen korrekt miteinander vernäht werden. Es ist darauf zu achten, die Dottersäcke nicht zu beschädigen, während gleichzeitig eine ausreichende Verbindung für eine erfolgreiche Fusion aufrechterhalten wird.Lassen Sie die Embryonen 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. In der Zwischenzeit nähen Sie zusätzliche Embryopaare. Nach der Inkubation prüfen Sie, ob die Embryonen weiterhin verbunden sind, und wiederholen Sie den Verletzungsschritt gegebenenfalls.Die Embryonen über Nacht in derselben Schale und demselben Medium bei 28,5 Grad Celsius inkubieren. Am folgenden Morgen haben sich die Embryonen aus der weitgehend aufgelösten Methylcellulose bewegt. Entfernen Sie alle Embryonen, die nicht erfolgreich fusioniert haben.Dann dekantieren Sie das Medium und ersetzen Sie es durch 25 Milliliter E3. Um Bilder der fusionierten Embryonen zu erhalten, bereiten Sie 0,8 % Niedrigschmelzpunkt-Agarose vor. Während die Agarose noch heiß ist, portionieren Sie 1 Milliliter der Agarose in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, die in einem Heizblock mit 37 Grad Celsius stehen.Betäuben Sie die parabiotischen Embryonen, indem Sie ein Milliliter einer vier Milligramm pro Milliliter pH 7,0 Tricain-Lösung zum 25 Milliliter E3-Medium mit den Embryonen hinzufügen. Schwenken Sie die Petrischale vorsichtig, damit sich die Embryonen in der Mitte sammeln. Saugen Sie anschließend mit einer Pipette mit breiter Spitze aus Plastik die Embryonen mit möglichst wenig Flüssigkeit auf.Danach das Pipettiergerät aufrecht halten und die Embryonen vorsichtig abstossen, damit sie sich ganz nach unten in die Pipettenspitze absetzen. Anschließend die Embryonen durch leichtes Berühren der Pipettenspitze mit der Oberfläche des Agarosegels in ein 1-Milliliter-Aliquot aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt überführen. Überschüssige Flüssigkeit aus der Pipettenspitze entsorgen und die Embryonen vorsichtig mit der Pipette in der Agarose vermischen.Überführen Sie dann mit der Pipette die Agarose und die Embryonen in eine Vertiefung einer sechswelligen Glasbodenplatte. Positionieren Sie unter einem Stereomikroskop die Embryonen mithilfe einer an das Ende einer feinen Nadel angebrachten Gelauftragsspitze nahe am Deckglas und in der gewünschten Orientierung für die Bildaufnahme. Nachdem die Agarose erstarrt ist und Medium mit Tricain zu den Vertiefungen hinzugefügt wurde, nehmen Sie die Bilder mit einem invertierten Weitfeld-Epifluoreszenz-Laserscanning-Konfokalmikroskop oder einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop auf.Verwenden Sie ein 4X-Objektiv für ein Ganzembryo-Sichtfeld. Verwenden Sie ein 20X-Objektiv, um ein spezifisches Gewebe abzubilden. Bearbeiten Sie die Bilder gemäß dem schriftlichen Protokoll.Wie hier gezeigt, wurden zwei Blastula nach Ausrichtung ihrer animalen Pole zueinander vorsichtig an ihrer Kontaktstelle verletzt. Ein stärkerer Verletzungsgrad erhöhte die Wahrscheinlichkeit, dass die Embryonen eine Verbindung beibehielten, die zu einer erfolgreichen Fusion führte, ohne zusätzliche morphologische Defekte oder verzögerte Entwicklung. Wie in dieser Abbildung dargestellt, wurden durch die Ausrichtung der beiden Blastula mit direkt übereinanderliegenden animalen Polen zuverlässig Kopf-an-Kopf- oder Dottersack-an-Dottersack-Fusionen mit geteiltem Kreislaufsystem erzeugt.In den meisten Fällen besaßen die Embryonen zwei Herzen, die eine gemeinsame Durchblutung aufrechterhielten. Um zu bestätigen, dass die Embryonen tatsächlich ihre Durchblutung teilten, wurden transgene Embryonen mit GFP-positiven Erythrozyten mit Embryonen fusioniert, die mCherry-positive vaskuläre endotheliale Zellen aufwiesen. Wie in diesem Film zu sehen ist, zirkulierten GFP-positive Erythrozyten 48 Stunden nach der Befruchtung durch den Flik 1 HRAS mCherry-PartnereMBRYO. Schließlich wurde zur Untersuchung der zeitlichen Kontrolle der Genexpression eines der beiden Embryonen mit einem hsp70-EGFP-DNA-Konstrukt injiziert. Nach einem kurzen Hitzeschock von 30 Minuten bei 37 Grad Celsius zeigte sich ein deutliches GFP-Signal in einem der Embryonen, und in einigen Fällen waren GFP-positive Zellen im nicht injizierten Partnerembryo im Umlauf zu beobachten. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von fünf Stunden durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist darauf zu achten, die beiden Blastulas vorsichtig zusammenzunähen, und Fusionsversuche sollten wiederholt werden, falls die Operation beim ersten Versuch nicht erfolgreich war. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden wie die Live-Zell-Bildgebung angewendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob wildtypische HSCs in einer mutierten Nische normal funktionieren können oder umgekehrt, ob mutierte HSCs in einer wildtypischen Nische funktionstüchtig sind. Diese Technik stellt eine leistungsstarke Methode für Forscher im Bereich der Hämatologie dar, um die Regulation der Blutentwicklung beim Zebrafisch zu untersuchen.Beachten Sie, dass Tricain gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter Schutzkleidung, während Sie dieses Verfahren durchführen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen und unsere empfohlenen Techniken befolgt haben, hoffen wir, dass Sie mit größerem Erfolg bessere lebende Zebrafischembryonen erzeugen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

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