Die Fibula Nervenverletzung Methode: Ein zuverlässiger Test zur Identifizierung und Test Faktoren, die Reparatur neuromuskulären Synapsen

Wir haben eine Methode zur Nervenverletzung entwickelt, um die Muskelreinnervation und damit die Regeneration neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen zuverlässig zu untersuchen. Bei dieser Technik wird der Nervus fibularis communis durch eine einfache und hochgradig reproduzierbare Operation verletzt. Die Muskelreinnervation wird dann durch Ganzmontage des Musculus extensor digitorum longus beurteilt.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode zur Schädigung peripherer Nerven ist es, regenerierende neuromuskuläre Verbindungen bei Mäusen zuverlässig zu untersuchen. Diese Methode wird uns helfen, die molekularen, zellulären und funktionellen Veränderungen zu identifizieren, die mit der Regeneration neuromuskulärer Verbindungen verbunden sind. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass die Regenerationsrate der neuromuskulären Verbindungen zwischen den Versuchsgruppen zuverlässig verglichen werden kann, weitgehend ohne myogene Veränderungen.

Das Verfahren wird von William Dalkin, einem Medizinstudenten in meinem Labor, vorgeführt. Verwenden Sie vor Beginn des Eingriffs 80%iges Ethanol, um die Operationsstelle, das Brett und die Instrumente zu reinigen, gefolgt von einer Desinfektion mit Povidon-Jod. Legen Sie als Nächstes die Maus auf die Operationsplatte und bestätigen Sie, dass es keine Reaktion auf das Einklemmen der Zehen gibt.

Richten Sie die Gliedmaßen innerhalb der Fesseln mit der Zielgliedmaße in einer anatomisch natürlichen Position aus und strecken Sie die Kniegelenke leicht nach innen oder außen. Dann wird das Tier unter ein Operationsmikroskop gebracht und das Brett so eingestellt, dass das knöcherne Kniegelenk und der Kamm zwischen dem Musculus tibialis anterior und dem Musculus gastrocnemius durch das Objektiv sichtbar sind. Machen Sie mit einem Skalpell und einer Pinzette einen etwa drei Zentimeter großen Schnitt durch die Haut, senkrecht zum darunter liegenden Verlauf des Nervus fibularis.

Setzen Sie den Schnitt durch die oberflächliche Faszie fort, wodurch der Bizeps femoris und der Musculus vastus lateralis freigelegt werden, gefolgt von einem ein bis zwei Zentimeter langen Schnitt durch die verbindende tiefe Faszie, um die Muskeln zu trennen. Als nächstes verwenden Sie mechanische Retraktoren, um den Musculus biceps femoris kaudal zurückzubilden, um den Nervus fibularis communis freizulegen. Verfolgen Sie den Nerv proximal, bis sich sein Schnittpunkt mit der Sehne des lateralen Kopfes des Musculus gastrocnemius befindet.

Fassen Sie dann mit einer feinen Zange den Nerv an, richten Sie die Spitzen parallel zum lateralen Rand der Gastrocnemiussehne aus und üben Sie fünf Sekunden lang gleichmäßigen, konzentrierten Druck aus, um den Nervus fibularis communis zu zerquetschen. Halten Sie die Pinzette senkrecht zur Faser, fassen Sie das Gewebe mit dem Bereich direkt hinter der Spitze der Pinzette und üben Sie festen, aber sanften Druck aus, um einen sauberen, linearen Druck des Nervs entlang der Sehnengrenze zu erzielen. Untersuchen Sie den Nerv visuell durch das Operationsmikroskop, um eine vollständige Quetschung des Gewebes zu bestätigen.

Der Nerv erscheint an der Verletzungsstelle durchscheinend. Wenn Mäuse verwendet werden, die Fluoreszenzproteine in den peripheren Axonen exprimieren, verschwindet die Fluoreszenz von der Verletzungsstelle. Wenn der Nerv ausreichend geschädigt ist, entfernen Sie die Retraktoren und richten Sie die Muskeln wieder in ihrer anatomischen Position aus.

Verwenden Sie dann 6-0-Seidennähte, um die Inzisionsstelle mit ein bis drei einfachen unterbrochenen Nähten zu schließen, und legen Sie die Maus auf ein Heizkissen in einem sauberen Käfig mit Überwachung, bis sie vollständig wiederhergestellt ist. Das Zusammendrücken des Nervs für fünf Sekunden mit einer feinen Pinzette führt zum Verschwinden des YFP von der Verletzungsstelle. Das Epineurium bleibt zusammenhängend und dient als Kanal für die präzise Regeneration der Axone zu ihren ursprünglichen Zielen.

Bei 70 Tage alten weiblichen Mäusen reicht die Nervenverletzung aus, um vier Tage nach der Quetschung eine Degeneration aller axonalen Segmente distal des neuronalen Somas zu verursachen. Sieben Tage nach dem Crush besetzen die Nervenenden die frei gewordenen postsynaptischen Stellen aktiv wieder. Am Tag 12 differenzieren sich die Nervenenden weiter in präsynaptische Stellen und die neuromuskulären Verbindungen sind vollständig reinnerviert.

Es gibt nur eine geringe Variabilität bei Mäusen, die für die gleiche Zeit denerviert wurden, was zeigt, dass die Quetschung des Nervus fibularis als Assay verwendet werden kann, um die Reinnervation der Muskeln zwischen Tieren gleichen Alters und Geschlechts zu vergleichen. Wie erwartet kommt es zu einer Reihe von Veränderungen in den alphamotorischen Axonen, wenn sie die Muskelfasern reinervatieren. Die axonalen Wachstumskegel dehnen sich aus und verzweigen sich, wenn sie mit postsynaptischen Stellen in Kontakt kommen, wachsen über spezifische Regionen der postsynapsen und gipfeln in der nahezu vollständigen Gegenüberstellung der axonalen Enden mit den postsynaptischen Stellen.

Wie durch quantitative PCR gezeigt wurde, nehmen die mit neuromuskulären Verbindungen assoziierten Gene nach der Denervierung zu und nehmen ab, wenn die neuromuskulären Verbindungen reinerviert werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 15 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen, alle Strukturen zu visualisieren und zu überprüfen, ob eine vollständige Quetschung erreicht wurde.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie QPCR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, welche Gene hoch- oder herunterreguliert werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg, um synaptische Regenerationen bei Mäusen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Fibulanervenquetschung durchführen, um die Raten der Reinervation der neuromuskulären Verbindung bei Mäusen zu untersuchen.