Name: Die Fibula Nervenverletzung Methode: Ein zuverlässiger Test zur Identifizierung und Test Faktoren, die Reparatur neuromuskulären Synapsen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Lernen Sie die Fibula-Nervenverletzungsmethode zur Untersuchung regenerierender neuromuskulärer Synapsen bei Mäusen. Diese Technik ermöglicht einen zuverlässigen Vergleich der Reinnervationsraten zwischen Versuchsgruppen.

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Valdez-Labors für ihren intellektuellen Input zu Experimenten und Kommentaren zum Manuskript.

Alle Experimente wurden unter NIH-Richtlinien und Tier Protokolle, die von der Virginia Tech Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt. 1. Vorbereiten Tiere für Chirurgie <ol><li> Anästhesieren Mäuse mit einem Gemisch aus Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) über eine subkutane Injektion inguinal mit einer sterilen 1 ml Insulinspritze. Trägerlösung enthält eine Mischung aus 0,9% Kochsalzlösung, 17,4 mg / ml Ketamin und 2,6 mg / ml Xylazin. Legen Sie Tiere zurück in Käfigen, während für Medikamente warten zu übernehmen. HINWEIS: Wenn die Ladungsdosis nicht ausreichend Anästhesie für die Dauer des Verfahrens vorsieht, eine zusätzliche 25% der Initialdosis injiziert werden kann. </li><li> Monitor-Tiere der Injektion für den stationären Atemfrequenz und entsprechende Depression von Erregungsniveau zu überprüfen. Überprüfen Sie Erregungsniveau mit einem Hinterfuß Prise, die keine Antwort auslösen sollte, wenn ausreichend narkotisiert. HINWEIS: Dies dauert in der Regel 3-5min für einen jungen Erwachsenen Maus 25 bis 30 g im Durchschnitt. Wenn das Tier immer noch anspricht nach 10 min nach der Injektion ist eine zusätzliche 25% des Anästhetikums Dosis kann injiziert werden. </li><li> Bewerben Petrolatum und leichtes Mineralöl Augensalbe auf die Augen des Tieres Trockenheit zu verhindern. Entfernen Sie Tiere aus dem Käfig nehmen und auf eine saubere, ebene Fläche. Shave die gewünschte Hinterbein vom Fuß bis zum Becken einen elektrischen Haarschneider verwenden, werden nur die lateralen Seite des Gliedes auszusetzen. </li><li> Tragen Sie einen chemischen Haarentferner auf die rasierte Stelle für 1 min. Entfernen Sie manuell die Haare Labortücher verwenden. Reinigen Sie die enthaarte Bereich mit Labor wipe in Ethanol getränkt. </li></ol> 2. Chirurgisches Verfahren <ol><li> Sterilisieren von chirurgischen Instrumenten über Autoklaven oder andere geeignete Verfahren. Reinigen Sie die Operationsstelle und chirurgische Board mit 80% Ethanol / H 2 0. Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit proviodine. Platzieren Sie die Maus auf chirurgische Bord und richten mit Gliedmaßen Stützen. Behaltendas Ziel der hinteren Gliedmaßen in einer anatomisch natürlichen Position mit dem Kniegelenk verlängert leicht ohne interne oder externe Rotation. </li><li> Platzieren Sie Tier- und Brett unter dem Operationsmikroskop. Orient auf den richtigen Einschnittstelle über die Palpation von oberflächlichen Sehenswürdigkeiten, speziell der knöchernen Kniegelenk und dem Grat zwischen der tibialis anterior und gastrocnemius Muskeln. </li><li> Machen Sie einen ca. 3 cm Schnitt durch die Haut mit einem Skalpell oder Feder Schere, während allgemeine Pinzette zum Greifen. Machen Sie den Einschnitt senkrecht zur zugrunde liegenden Verlauf des N. fibularis communis. </li><li> Fortsetzung der Einschnitt durch die oberflächliche Faszie, Freilegung der Bizeps femoris und vastus lateralis Muskeln. Trennen Sie diese Muskeln, indem sie durch die Verbindungs ​​tiefe Faszie zu schneiden. Ein 1-2 cm geschnitten, sollte ausreichend sein. </li><li> Fahren Sie die Bizeps femoris kaudal mechanischen Retraktoren mit der N. fibularis communis enthüllt. </li><li> Verfolgen Sie die Nerven proximal, bis seine interAbschnitt mit der Sehne des lateralen Kopf des M. gastrocnemius gefunden wird. Hinweis: Die Belichtung kann zusätzliche Manipulation der eingezogenen Haut und Muskeln. Dieser Schnittpunkt wird als stabil Meilenstein für die Nervenverletzung verwendet. </li><li> Fassen Sie den Nerv mit einer feinen Pinzette, die Spitzen in einer parallelen Weise an den seitlichen Rand der gastrocnemius Sehne ausrichten. Crush the N. fibularis communis durch die Anwendung stabil, harten Druck für 5 Sek. </li><li> Corroborate voll verknallt des Nerven durch visuelle Inspektion durch den chirurgischen Umfang. Es wird transluzente an der Stelle der Verletzung auftreten. Wenn Mäuse, die Fluoreszenzproteine ​​in peripheren Axonen verwenden, wird die Fluoreszenz von der Stelle der Verletzung verschwinden. </li><li> Entfernen Sie Retraktoren und neu auszurichten Muskeln in ihren anatomischen Positionen. Schließen Sie die Inzisionsstelle mit 6-0 Seidennähten. 1-3 einfache Nähten ist ausreichend. Platzieren Maus recuperating auf einem Heizkissen in einen sauberen Käfig. </li><li> Überwachen Sie alle Tiere für 2 Stunden nach der Opertion für die Atmung und keine negativen Reaktionen auf die Anästhesie zu überprüfen. Verwalten Sie eine anfängliche Dosis von Buprenorphin 0,05-0,10 mg / kg über eine subkutane Injektion Leisten- sofort von der Operation folgenden Erholung. Geben Sie 3 zusätzliche Dosen alle 12 Stunden über die nächsten 48 Stunden. Nach der vollständigen Genesung, Rückkehr Mäuse auf die Tierstation. </li></ol> 3. Isolierung und Färbung der Extensor communis digitorum (EDL) Muskeln <ol><li> Sacrifice Tiere mit Isofluran. Dispense 0,5 ml Flüssigkeit Isofluran in einen 50-ml-Röhrchen mit einem saugfähigen labwipes verpackt. Setzen Sie den unverschlossenen Röhrchen mit dem Tier in einem verschlossenen 2.500 cm 3 Kammer. Mindestens 4 min Expositions ausreichend. Test für den Verlust von bilateralen palpebral, toe-Pinch und Schwanz-Pinch Reflexe, um sicherzustellen, dass jedes Tier, bevor Sie mit Perfusion bewusstlos ist. </li><li> Transkardial perfundiert 16 Tiere zuerst mit 10 ml 0,1 M PBS, dann wurden 25 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (pH 7,4). Heparin (30 Einheiten / 20g Tiergewicht) mit dem PBS (10 Einheiten / ml) zu verhindern Blutgerinnung in kleinen kapillaren Betten, die Verbesserung der Perfusionsergebnisse hinzugefügt werden. </li><li> Entfernen Sie die Haut bedeckt Hinterbeine durch Schere quer durch die Haut um den Umfang des Bauches zu schneiden. Ziehen Sie die Haut nach unten vorbei an den hinteren Gliedmaßen und Füße einer Pinzette. </li><li> Entfernen Sie Oberflächenfaszie von Hintergliedmaßen durch Greifen und Peeling mit einer Pinzette. Wenn Mäuse, die Fluoreszenz-Proteine ​​in peripheren Axonen mit, post-fix ganze Mäuse über Nacht in 4% PFA in 50-ml-Röhrchen. Spülen dreimal mit PBS. HINWEIS: Fest Mäuse können in PBS bei 4 ° C gelagert werden. Wenn nicht, überspringen Sie diesen Schritt und fahren 3.6 ohne Post-fixierenden Tiere zu treten. </li><li> Präparieren aus EDL Muskeln 18 aus Maus Hinterextremitäten, sicher zu sein , proximale und distale Sehnen zu halten so intakt wie möglich. </li><li> Inkubieren EDL Muskeln in Blocking-Puffer für mindestens 1 Stunde (1x PBS 0,5% Triton X-100, 3% BSA und 5% Ziegenserum enthielt). </li><liund synaptotagmin-2 (1: 250) Antikörper verdünnt in Blockierungspuffer für 3 Tage:&gt; Um Motoraxonen und ihre Nervenenden, statt Muskeln in Röhrchen, die Neurofilament (1000 1) zu visualisieren. Waschen Sie Muskeln dreimal mit 1x PBS und je 10 min. Hinweis: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn Mäuse, die Fluoreszenzproteine ​​(XFP) in peripheren Axonen verwenden. </li><li> Stain die kontralaterale heil EDL als positive Kontrolle für die komplette NMJ Innervation. Negative Kontrollen sollten eine EDL erhalten bei 4 Tage nach der Verletzung, ein Zeitpunkt enthalten, in dem die NMJ vollständig denervierten ist, sowie eine EDL mit sekundären Antikörper gefärbt nur. </li><li> Inkubieren Muskeln mit entsprechenden fluoreszierend markierten Sekundärantikörper Neurofilament und synaptotagmin-2 für 1 Tag zu erfassen. Waschen Sie Muskeln dreimal mit 1x PBS und je 10 min. Hinweis: Dieser Schritt kann durchgeführt werden, zusammen mit Schritt 3.10. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn Mäuse, die Fluoreszenz-Proteine ​​in peripheren Axonen verwenden. </li><li> Zur Visualisierung der postsynaptic Bereich des NMJ inkubieren Muskeln mit 5 ug / ml Alexa 555-konjugierten alpha-Bungarotoxin verdünnten Puffer für mindestens 2 h in blockieren. Waschen Sie Muskeln dreimal mit 1x PBS und je 10 min. </li><li> So montieren ganze Muskeln auf positiv geladene Objektträger aus Glas, legen Sie den Muskel direkt auf der Folie, ein paar Tropfen Glycerin hinzufügen basierten Montagemedium auf dem Objektträger geben und mit einem Deckglas. Drücken Sie die Deck gegen die Folie, um die Muskeln zu glätten. Tränken weg Eindeckmedien vom Umfang der Rutsche und Deckglas mit Labor wischt. Bewerben Nagellack die Kanten zwischen dem Deckglas und Folie zu versiegeln. </li></ol> 4. Imaging und Datenanalyse <ol><li> Zur Analyse der Struktur von NMJs, Bild der EDL Muskel eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ausgerüstet 488, 555 und 633 nm Licht zur Anregung und Erfassung des emittierten Lichts mit 20X und 40X Ziele. </li><li> Um ganze NMJs sichtbar zu machen, schaffen Maximum Intensity Projection Bilder von optischen secnen Abstand von 1 bis 2 um abgesehen von der niedrigsten zur höchsten erstreckt sichtbaren Bereich des NMJ. Erstellen Sie maximale Intensität Projektionen mit handelsüblichen Bildbearbeitungssoftware. </li><li> Um die Preise von reinnervation bestimmen, zu kategorisieren NMJs als: 1) vollständig denervierten = postsynaptischen Seite völlig frei von Kontakt mit Axon ist, weniger als 5% Kolokalisation zwischen dem Axon und AChRs. 2) Teilweise innervated = das Axon teilweise überlappt die Postsynapse, 5-95% Kolokalisation zwischen dem Axon und AChRs. 3) Voll Innervation = nahezu perfekt Apposition zwischen Pre- und Post-Synapse, mehr als 95% Kolokalisation zwischen dem Axon und AChRs. Ausschließen NMJs, die senkrecht zu der Abbildungsebene liegen oder nicht vollständig in dem Bild sichtbar gemacht. Anmerkung: In all diesen Versuchen mindestens 3 Tieren und 50 NMJs pro Tier untersucht. Die Ergebnisse wurden mit einem P-Wert von weniger als 0,05 signifikant unter Verwendung eines Student-t-Test angesehen. </li><li> Um blenden den Bediener können separate Individuen durchführendie Operation und Bildanalyse. Ohne Kenntnis der Behandlungsgruppen kann der Analysator mit NMJ scoring Ziel sein. Alternativ können Bilder randomisiert und den Operator für die Analyse ohne Kenntnis der Quelle Tier präsentiert. </li></ol> 5. Quantitative PCR <ol><li> Sacrifice Tiere mit Isofluran und Genickbruch. Entfernen Sie die Haut und oberflächliche Faszie bedeckt Beinmuskulatur nach 3.3 zu treten. Präparieren tibialis anterior und EDL Muskeln nach 3.4 zu treten. </li><li> Blitzeis die gesamte tibialis anterior und EDL Muskeln in einem 1,5-ml-Röhrchen über flüssigem Stickstoff. Entfernen Sie Gewebe aus Rohr und in einem vorgekühlten Mörser teilweise in flüssigem Stickstoff eingetaucht. Grind gefrorenen Muskel in ein feines Pulver mit einem Mörser und Stößel. </li><li> Man löst gefrorene Muskel Pulver in einen kommerziell erhältlichen RNA-Extraktion Reagenz und führen die RNA-Extraktion und genomische DNA Entfernung mit einem im Handel erhältlichen Kits des Herstellers i nachnweise. </li><li> Führen der reversen Transkription mit einer im Handel erhältlichen reversen Transkriptase Mischung gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Führen Sie qPCR eines kommerziell erhältlichen Kits mit geeigneten Housekeeping-Gene (siehe Tabelle von Materialien). Verwenden Sie eine im Handel erhältliche quantitative PCR-Thermocycler zur Durchführung von PCR (siehe Tabelle der Materialien). </li><li> Eingestellt Annealingtemperatur auf 58 ° C. Passen Sie zusätzliche Zyklierungsparameter den Spezifikationen des Herstellers von Taq-Polymerase / SYBR grün-Mix. Umfassen eine endgültige Schmelzkurve Schritt in der Programm Thermocycler bestehend aus 0,5 ° C inkremental erhöht sich von 65 ° C bis 95 ° C für die Primer-Spezifität zu testen und Dimerbildung Primers. </li><li> Bestimmen Sie relativen mRNA - Expressionsniveaus durch die 2 - ΔΔCT Methode 21 unter Verwendung von 18S RNA als Kontroll - Gen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Verfahren in diesem Manuskript präsentiert bietet einzigartige Möglichkeiten Mechanismen bei der Reparatur von neuromuskulären Verbindungen (NMJ) beteiligt zu identifizieren. Dieses Verfahren beinhaltet das Brechen des N. fibularis communis, wie es gastrocnemius Sehne in der Nähe des Knies verläuft. Wir zeigen, dass nach nur 5 Sekunden von Nervenkompression mit einer Zange, vollständige Degeneration um 4 Tage nach der Verletzung festgestellt wird. Bei jungen erwachsenen Mäusen, beginnen alpha-Motoraxonen vorherigen ...

Bei jungen erwachsenen und gesunden Tieren ist die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) eine sehr stabile Verbindung zwischen der Präsynapse, der Nervenendigung eines α-motorischen Axons, und der Postsynapse, der spezialisierten Region einer extrafusalen Muskelfaser, in der nikotinische Acetylcholinrezeptoren (AChRs) selektiv aggregieren1. Die nahezu perfekte Apposition der prä- und postsynaptischen Apparate ist notwendig für die korrekte Neurotransmission, das Überleben der α-motorischen Neuronen und Muskelfasern sowie die motorische Funktion. Leider wird die Funktion des NMJ durch das Altern, Krankheiten wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Autoimmunerkrankungen und Verletzungen von Muskeln und peripheren Nervenbeeinträchtigt 2-5. Diese Beleidigungen führen oft zu einer Degeneration der präsynaptischen Nervenenden, wodurch die Muskeln ennerviert werden und die motorischen Fähigkeiten erheblich verändert werden. Aus diesem Grund ist die Identifizierung von Molekülen, die zur Aufrechterhaltung und Reparatur des NMJ beitragen, zu einer Priorität geworden. Da periphere Nerven Ziele regenerieren und reinnervieren, wurden Modelle für periphere Nervenverletzungen verwendet, um molekulare Veränderungen zu identifizieren, die mit der Regeneration von NMJs verbunden sind. 
Periphere Nervenverletzungsmodelle beinhalten oft das vollständige Durchtrennen oder Zerquetschen bestimmter Nervenäste6. Nach einem Schnitt muss der endoneuriale Tubus reformiert werden, wodurch die axonale Regeneration und die Reinnervation der Zielzellen und -gewebe verzögert werden. Die Schwere dieser Art von Verletzung führt auch dazu, dass sich die Axone von ihrem ursprünglichen Weg entfernen, was dazu führt, dass sie ihre ursprünglichen Ziele nicht erreichen. Dies steht im Gegensatz zu Nerven, die durch Quetschung verletzt werden, bei denen das Endonaur zusammenhängend bleibt und einen Weg für ein effizientes und ordnungsgemäßes Nachwachsen der regenerierenden Axone bietet. Es ermöglicht Axonen auch, ihre ursprünglichen Muskelfaserpartner zu finden und zu innervieren. Unabhängig vom Verletzungsmodell gibt es eine Reihe von zellulären und molekularen Veränderungen, die auftreten müssen, damit Axone sich regenerieren und Ziele reinnervieren können. Nach einer Verletzung wird das Nervensegment proximal des Ziels abgebaut und über einen Prozess entfernt, der als Wallersche Degenerationbezeichnet wird 7. Dieser Prozess beinhaltet die Reprogrammierung und Dedifferenzierung von Schwann-Zellen in nicht-myelinisierende Zellen, die regenerative Faktoren sezernieren, Myelin beseitigen und Makrophagen an den Ort der Verletzung rekrutieren8. Makrophagen wiederum vervollständigen die Beseitigung von Myelin und axonalen Trümmern, die sonst das Wachstum des regenerierenden Axonsbehindern würden 9. Parallel dazu aktivieren motorische und sensorische Neuronen Mechanismen, die zur Regeneration ihrer durchtrennten Axone erforderlich sind. Sobald das regenerierende Axon das Ziel erreicht, muss es sich von einem Wachstumskegel in ein Nervenende verwandeln, das in der Lage ist, Informationen ordnungsgemäß zu übermitteln (für motorische Axone) oder zu empfangen (für sensorische Axone)10. In dieser Hinsicht durchlaufen alpha-motorische Axone eine Reihe von gut orchestrierten Veränderungen, die darin gipfeln, dass sich ihr Wachstumskegel zu einer voll funktionsfähigen präsynaptischen Nervenendigung differenziert, die der postsynaptischen Stelle auf der Zielmuskelfaser nahezu perfekt entgegengesetzt ist11. 
Der Ischiasnerv, der Nervus tibia und der Nervus accessorius waren die primäre Wahl für die Untersuchung der axonalen undNMJ-Regeneration 12-14. Es gibt jedoch eine Reihe von Nachteilen, wenn diese Modelle verwendet werden, um zelluläre und molekulare Veränderungen zu untersuchen, die mit der Regeneration von NMJs zwischen Tieren und unter verschiedenen Bedingungen verbunden sind. Erstens versorgt der Ischiasnerv den Großteil der Muskeln der hinteren Extremität, wobei Verletzungen sowohl die Bewegung als auch die Empfindung erheblich einschränken. Es ist daher nicht möglich, mit dieser Methode die Auswirkungen von Bewegung allein oder in Kombination mit anderen Faktoren zu untersuchen. Darüber hinaus ist der Ischiasnerv eine ziemlich dicke Struktur und erfordert daher eine große Menge an Druckkraft, um alle Axone vollständig zu verletzen. Dies wiederum kann zu einer vollständigen Durchtrennung der oberflächlicheren Axone führen, während die endoneuriale Röhre tiefer liegender Axone intakt bleibt, was zu einer signifikanten Variabilität in der Geschwindigkeit und Genauigkeit der Regeneration zwischen diesen Axonen führt. Eine vollständige Durchtrennung dieses Nervs ist umso weniger wünschenswert, da viele Axone nicht wieder mit denselben Muskelfasern verbunden werden können. Erschwerend kommt hinzu, dass der Ischiasnerv eine intrinsische anatomische Variabilität besitzt, sowohl in der Anzahl als auch in dem Entstehungsort seiner Endnervenäste. Es ist daher sehr schwierig, die gleiche Stelle zu läsieren. Während der Nervus tibialis kleiner und anfälliger für Quetschverletzungen ist, gibt es auch keinen leicht zugänglichen Orientierungspunkt, der als Läsionsstelle für diesen Nervenast dienen könnte. 
Der akzessorische Nervenast (Teil des Hirnnervs XI), der den M. sternocleidomastoideus versorgt, wurde auch verwendet, um die Regeneration von NMJs15 zu untersuchen. Dieser Nerv ist besonders attraktiv, da NMJs im Musculus sternocleidomastoideus bei lebenden Tieren leichter abgebildet werden können als NMJs in anderen Muskeln. Aber ähnlich wie beim Ischias- und Tibianerv gibt es keinen spezifischen Orientierungspunkt, der verwendet werden kann, um diesen Nerv an der gleichen Stelle zu verletzen, was ihn als Modell für den Vergleich der Regeneration von NMJs zwischen einzelnen Tieren einer Versuchskohorte einschränkt. Eine inkonsistente Läsionsstelle führt zu einer Variabilität in den Raten der NMJ-Reinnervation. Aufgrund dieser Unzulänglichkeiten nutzt das hier vorgestellte Verfahren die Verletzung eines anderen peripheren Nervenastes, um regenerierende NMJs zu untersuchen. 
Der Nervus fibularis communis, auch Nervus peroneus communis genannt, enthält viele Merkmale, die ihn zu einem zuverlässigen Nerv machen, um die Regeneration von NMJs zwischen Tieren und über verschiedene Behandlungen hinweg zu untersuchen. Der Nervus fibularis communis hat einen vorhersehbaren anatomischen Verlauf, da er über die Sehne des lateralen Kopfes des Musculus gastrocnemius im Knie verläuft, wobei der Schnittpunkt als stabiler Orientierungspunkt für Läsionen dient. Der Zugang zum Nerv erfolgt durch einen kleinen und minimalinvasiven Schnitt in der Nähe, aber anatomisch von den interessierenden Muskeln getrennt. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass regenerierende motorische Axone bei 70 Tage alten jungen erwachsenen weiblichen Mäusen 8 Tage nach der Zerquetschung des Nervus fibularis beginnen, NMJs im Musculus extensor digitorum longus (EDL) zu reformieren. Wichtig ist, dass das Muster und die Rate der Reinnervation bei Tieren gleichen Alters und Geschlechts konsistent sind und daher ein zuverlässiges Verletzungsmodell liefern, das unser Verständnis der zellulären und molekularen Veränderungen, die zur Aufrechterhaltung und Reparatur von NMJs erforderlich sind, erheblich beschleunigen wird.

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>VetOne</td><td>501072</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc.&nbsp;</td><td>003437&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>&nbsp; Zoopharm</td><td>1Z-73000-150910&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kim-wipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Elektrorasierer</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-64800</td><td></td></tr><tr><td>80% EtOH/H20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% Proviod</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Insulinspritze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Vannas</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Nr. 15 Skalpell</td><td>Braintree Scientific</td><td>SSS 15</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinzette</td><td>Dumont</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Seidennaht auf umgekehrter Schnittnadel</td>&<td>nbsp; Naht Express</td><td>752B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nagetier-Heizkissen</td><td>Braintree Scientific</td><td>AP-R-18.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 konjugierte alpha-BTX</td><td>Molekularsonden</td><td>B35451</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Stereo Zoom Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>562037192</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 700 Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusionspumpe mit variablem Durchfluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-3</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Total RNA Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>7326820</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad iScript RT Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725200</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Salbe</td><td>Puralube</td><td>1621</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin-2</td><td>Antikörper-Antikörper-Online</td><td>ABIN401605</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament</td><td>Antikörper-Antikörper-Online</td><td>ABIN2475842</td><td></td></tr></tbody></table>

die fibula nervenverletzung methode: ein zuverlässiger test zur identifizierung und test faktoren, die reparatur neuromuskulären synapsen

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

Die neuromuskulären Synapse (NMJ) erfährt schädliche strukturelle und funktionelle Veränderungen als Folge des Alterns, Verletzungen und Krankheiten. Daher ist es zwingend notwendig, um die zellulären und molekularen Veränderungen bei der Aufrechterhaltung und der Reparatur NMJs beteiligt zu verstehen. Zu diesem Zweck haben wir eine Methode entwickelt, um zuverlässig und konsistent untersuchen NMJs in Mäusen zu regenerieren. Diese Nervenverletzung Verfahren umfasst das Zerkleinern des N. fibularis communis, wie es der lateralen Kopf des M. gastrocnemius Sehne in der Nähe des Knies verläuft. vorherige postsynaptischen Ziele innerhalb von 7 Tagen nach reinnervate Post-crush unter Verwendung von 70 Tage alten weiblichen Mäusen zeigen wir, dass Motoraxonen beginnen. Sie reoccupy vollständig ihre vorherigen synaptischen Bereiche von 12 Tagen. Um die Zuverlässigkeit dieser Verletzung Methode bestimmen, verglichen wir reinnervation Raten zwischen den einzelnen 70 Tage alten weiblichen Mäusen. Wir fanden, dass die Anzahl der postsynaptischen reinnervated Stellen zwischen Mäusen ähnlich war bei 7, 9 und 12 Tage nach-crush. Um festzustellen, obDiese Verletzungs Assay kann auch zum Vergleich molekularen Veränderungen in Muskeln verwendet werden, untersuchten wir Ebenen der gamma-Untereinheit des nikotinischen Rezeptors Muskel (gamma-AChR) und der muskelspezifische Kinase (MuSK). Die Gamma-AChR-Untereinheit und MuSK zu folgen Denervierung hoch oben reguliert und zurück auf ein normales Niveau folgende reinnervation von NMJs. Wir fanden eine enge Beziehung zwischen Transkriptniveaus für diese Gene und Innervation Zustand der Muskeln. Wir glauben, dass diese Methode das Verständnis der zellulären und molekularen Veränderungen bei der Reparatur der NMJ und anderen Synapsen beteiligt beschleunigen wird.

Der N. fibularis communis, auch genannt der N. peronaeus, ergibt sich aus dem Ischiasnerv oberhalb der Kniekehle, wo es um den Kopf der Fibula zur Vorderseite des Beins (1A) schwingt. Dort zweigt in die oberflächlichen und tiefen fibular Nerven, zusammen, um die Dorsalflexoren des Fußes und der Zehen Versorgung (Tibialis anterior, extensor digitorum longus und brevis und extensor Zehen longus) und die everters des Fußes (Peronaeus Muskeln). Dieser Nerv trägt auch sensori...

Wir haben eine Methode zur Nervenverletzung entwickelt, um die Muskelreinnervation und damit die Regeneration neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen zuverlässig zu untersuchen. Bei dieser Technik wird der Nervus fibularis communis durch eine einfache und hochgradig reproduzierbare Operation verletzt. Die Muskelreinnervation wird dann durch Ganzmontage des Musculus extensor digitorum longus beurteilt.

Die Fibula Nervenverletzung Methode: Ein zuverlässiger Test zur Identifizierung und Test Faktoren, die Reparatur neuromuskulären Synapsen

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode zur peripheren Nervenverletzung besteht darin, regenerierende neuromuskuläre Endplatten bei Mäusen zuverlässig zu untersuchen. Mit dieser Methode können wir die molekularen, zellulären und funktionellen Veränderungen identifizieren, die mit der Regeneration neuromuskulärer Endplatten assoziiert sind. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass die Regenerationsrate neuromuskulärer Endplatten zwischen experimentellen Gruppen zuverlässig verglichen werden kann, weitgehend unbeeinflusst von myogenen Veränderungen.Den Ablauf wird William Dalkin, ein Medizinstudent in meinem Labor, demonstrieren. Vor Beginn des Eingriffs verwenden Sie 80 % Ethanol, um den Operationsbereich, das Operationsbrett und die Instrumente zu reinigen, gefolgt von einer Desinfektion mit Povidon-Jod. Anschließend platzieren Sie die Maus auf dem Operationsbrett und überprüfen, ob keine Reaktion auf einen Zehenquetschtest erfolgt.Richten Sie die Gliedmaßen innerhalb der Halterungen in einer anatomisch natürlichen Position aus, wobei die Hintergliedmaßen ausgerichtet und die Kniegelenke leicht gestreckt sind, ohne innere oder äußere Rotation. Bringen Sie dann das Tier unter ein Operationsmikroskop und justieren Sie die Halteplatte, bis das knöcherne Kniegelenk und der Grat zwischen dem Musculus tibialis anterior und den Musculus gastrocnemius durch das Objektiv sichtbar sind. Machen Sie mithilfe eines Skalpells und einer Pinzette einen etwa drei Zentimeter langen Schnitt durch die Haut, senkrecht zum darunterliegenden Verlauf des Nervus fibularis communis.Setzen Sie den Schnitt durch die oberflächliche Faszie fort, um den Musculus biceps femoris und den Musculus vastus lateralis freizulegen, gefolgt von einem ein bis zwei Zentimeter langen Schnitt durch die verbindende tiefe Faszie, um die Muskeln zu trennen. Verwenden Sie anschließend mechanische Retraktoren, um den Musculus biceps femoris kaudal zu verlagern und so den Nervus fibularis communis freizulegen. Verfolgen Sie den Nerv proximal, bis seine Kreuzung mit dem Sehnenansatz des lateralen Kopfes des Musculus gastrocnemius gefunden ist.Verwenden Sie anschließend eine feine Pinzette, um den Nerv zu fassen, wobei die Spitzen parallel zum seitlichen Rand der Gastrocnemius-Sehne ausgerichtet sind, und üben Sie fünf Sekunden lang gleichmäßigen, konzentrierten Druck aus, um den Nervus fibularis communis zu quetschen. Halten Sie die Pinzette senkrecht zur Faserlage, fassen Sie das Gewebe mit dem Bereich direkt hinter der Pinzetten­spitze und führen Sie festen, aber sanften Druck aus, um eine saubere, lineare Quetschung des Nervs entlang der Sehnenkante zu erzielen. Überprüfen Sie den Nerv visuell mithilfe des Operationsmikroskops, um eine vollständige Quetschung des Gewebes zu bestätigen.Der Nerv erscheint an der Verletzungsstelle durchscheinend. Wenn Mäuse verwendet werden, die Fluoreszenzproteine in den peripheren Axonen exprimieren, verschwindet die Fluoreszenz an der Verletzungsstelle. Falls der Nerv ausreichend beschädigt wurde, entfernen Sie die Retraktoren und bringen Sie die Muskeln in ihre anatomischen Positionen zurück.Verwenden Sie anschließend 6-0-Seidennähte, um die Inzisionsstelle mit ein bis drei einfachen unterbrochenen Nähten zu verschließen, und legen Sie die Maus auf eine Heizplatte in einen sauberen Käfig mit Überwachung, bis sie sich vollständig erholt hat. Durch das fünfsekündige Komprimieren des Nervs mit einer feinen Pinzette verschwindet YFP von der Verletzungsstelle. Das Epineurium bleibt kontinuierlich und dient als Leitung für die präzise Regeneration der Axone zu ihren ursprünglichen Zielstrukturen.Bei 70 Tage alten weiblichen M&auml;usen f&uuml;hrt die Nervenverletzung vier Tage nach der Quetschung zur Degeneration s&auml;mtlicher axonaler Segmente distal zum neuronalen Soma. Sieben Tage nach der Quetschung besiedeln die Nervenenden aktiv die verlassenen postsynaptischen Stellen wieder. Am Tag 12 differenzieren sich die Nervenenden weiterhin zu pr&auml;synaptischen Stellen aus, und die neuromuskul&auml;ren Verbindungen sind vollst&auml;ndig reinnerviert.Es gibt nur geringe Variabilität zwischen Mäusen, die für die gleiche Dauer denerviert wurden, was zeigt, dass das Zerquetschen des Fibularisnervs als Assay verwendet werden kann, um die Reinnervation von Muskeln zwischen Tieren gleichen Alters und gleichen Geschlechts zu vergleichen. Wie erwartet treten eine Reihe von Veränderungen in den alpha-motorischen Axonen auf, während diese Muskelfasern reinnervieren. Die axonalen Wachstumskonen dehnen sich aus und verzweigen sich, während sie postsynaptische Stellen kontaktieren, über bestimmte Bereiche der Postsynapse wachsen und schließlich in einer nahezu vollständigen Gegenüberstellung der axonalen Endigungen zu den postsynaptischen Stellen münden.Wie quantitative PCR gezeigt hat, nehmen die mit der neuromuskulären Junction assoziierten Gene nach einer Denervierung zu und ab, sobald die neuromuskulären Junctionen wieder innerviert werden. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in 15 Minuten abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen, alle Strukturen genau zu visualisieren und nochmals zu überprüfen, ob eine vollständige Quetschung erreicht wurde.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die QPCR angewendet werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Hoch- oder Herunterregulierung bestimmter Gene zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Neurobiologie, synaptische Regenerationen bei Mäusen zu untersuchen. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Würfelnerverdrückung durchführt, um die Wiedereinnervierungsraten der neuromuskulären Endplatte bei Mäusen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Maus Ischiasnerv zu zerschlagen. Diese Methode verwendet leicht verfügbar Arterienklemmen und einfach und reproduzierbar produziert komplette Ischiasnerv verknallt. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um Muskeln ganzen Halterungen für die Analyse der Nervenregeneration nach Ischiasnerv verknallt vorzubereiten.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Dieses Video zeigt eine Methode zur Beurteilung funktioneller neuromuskulärer Verbindungen. Mit Hilfe eines Bioreaktors, der Muskelgewebe und Motoneuronen enthält, werden zusammen mit der Fluoreszenzmikroskopie die lichtempfindlichen Kanäle in den Neuronen stimuliert, um elektrische Signale zu erzeugen, was zu Muskelfaserkontraktionen führt.

Beurteilung einer funktionellen neuromuskulären Verbindung durch gleichzeitige optische Stimulation und Videoaufzeichnung

Quelle: Dalkin, W., et al. Die Methode zur Verletzung des Nervus fibularis: Ein zuverlässiger Assay zur Identifizierung und zum Test von Faktoren, die neuromuskuläre Verbindungen reparieren. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt ein chirurgisches Verfahren zur Induktion einer Fibulausverletzung bei einer Maus, um die Regeneration der neuromuskulären Verbindung (NMJ) zu untersuchen. Bei diesem Verfahren wird der Nervus fibularis freigelegt, kontrollierter Druck ausgeübt, um eine Verletzung...

Induktion einer Verletzung des Nervus fibularis bei einer Maus zur Untersuchung der Regeneration neuromuskulärer Verbindungen

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist in einer Vielzahl von Zuständen verändert, die manchmal in einem synaptischen Versagen gipfeln können. In diesem Bericht werden fluoreszenzmikroskopische Methoden zur Quantifizierung solcher Strukturveränderungen beschrieben.

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

Eine funktionale Bewertung der neuromuskulären Synapse (NMJ) kann wesentliche Informationen über die Kommunikation zwischen Muskeln und Nerven. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die NMJ und Muskel Funktionalität mit zwei verschiedenen Muskel-Nerv-Präparate, d.h. Soleus-Ischias und Membran-Phrenicus umfassend zu bewerten.

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Axonalen Erregbarkeit Techniken bieten ein leistungsfähiges Werkzeug zur Prüfung Pathophysiologie und biophysikalische Veränderungen, die irreversible degenerative Ereignisse vorausgehen. Diese Handschrift zeigt den Einsatz dieser Techniken auf der ulnaren Nerv anästhesierten Ratten.

In Vivo Elektrophysiologische Messungen der Ratte ulnaris mit axonalen Erregbarkeit testen

Präsentiert wird ein Protokoll, um verschiedene Arten von Mediannerven (MN) Läsionen und Reparatur in der Ratte zu produzieren. Darüber hinaus zeigt das Protokoll, wie die funktionelle Erholung des Nervs anhand mehrerer nichtinvasiver Verhaltenstests und physiologischer Messungen bewertet werden kann.

Funktionelle und physiologische Methoden zur Beurteilung der medianen Nervenregeneration in der Ratte

Die automatisierte Ganganalyse ist ein praktikables Werkzeug zur Bewertung der funktionellen Erholung in Nagetiermodellen von peripheren Nervenverletzungen und Rückenmarksprellungen. Während es nur ein Setup erfordert, um die Funktion des Bewegungsapparates in verschiedenen experimentellen Modellen zu bewerten, ist eine sorgfältige Hard- und Software-Anpassung und Das Training der Tiere sehr wichtig.

Automatisierte Gait-Analyse zur Beurteilung der funktionellen Erholung bei Nagetieren mit peripheren Nerven- oder Rückenmarkskontitionsverletzungen

Die Bewertung der motorischen Erholung bleibt das Benchmark-Ergebnismaß in experimentellen peripheren Nervenstudien. Die isometrische tetanische Kraftmessung des Tibialis-Vordermuskels bei der Ratte ist ein unschätzbares Werkzeug, um funktionelle Ergebnisse nach der Rekonstruktion von Ischiasnervendefekten zu beurteilen. Die Methoden und Nuancen werden in diesem Artikel ausführlich beschrieben.

Maximale isometrische tetanische Kraftmessung des Tibialis-Vordermuskels bei ratten

Die Fähigkeit, neuromuskuläre Verbindungskomponenten genau zu erkennen, ist entscheidend für die Bewertung von Modifikationen in ihrer Architektur aufgrund pathologischer oder Entwicklungsprozesse. Hier präsentieren wir eine vollständige Beschreibung einer einfachen Methode, um qualitativ hochwertige Bilder von neuromuskulären Verbindungen ganzer Mounts zu erhalten, die für quantitative Messungen verwendet werden können.

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg

Lernen Sie die Fibula-Nervenverletzungsmethode zur Untersuchung regenerierender neuromuskulärer Synapsen bei Mäusen. Diese Technik ermöglicht einen zuverlässigen Vergleich der Reinnervationsraten zwischen Versuchsgruppen.

Die Fibula Nervenverletzung Methode: Ein zuverlässiger Test zur Identifizierung und Test Faktoren, die Reparatur neuromuskulären Synapsen (Video) | JoVE Journal

Die Fibula Nervenverletzung Methode: Ein zuverlässiger Test zur Identifizierung und Test Faktoren, die Reparatur neuromuskulären Synapsen

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