Name: Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Erfahren Sie die retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zur Erzeugung von T-Zell-Rezeptor-Retrogenic-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Analyse multipler TCRs in vivo und eliminiert Founder-Effekte durch die Untersuchung verschiedener Mäuse.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIH (5K22A1119151-01 und 1R56DK104903-01) zu MLB, Pilot / Machbarkeits Programm des Diabetes Research Center (P30-DK079638) bei BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA unterstützt 1-15-JF-07, AAI Karriere in Immunology Fellowship MB und The Robert und Janice McNair-Stiftung.

Ethik - Statement: Es wird alles unternommen Tier Beschwerden oder Stress auf ein Minimum während der Bestrahlung und Schwanzvene Injektionen zu halten. Mäuse werden als Quelle der Zellen in diesen Experimenten verwendet wird; als solche sind keine Verfahren oder Manipulationen abgesehen von Euthanasie. Die Mäuse werden durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte eingeschläfert Tod zu bestätigen. Dieses Verfahren ist mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association konsistent. 1. Bereiten Sie Retrovirale Construct <ol><li> Sub-Klon der T-Zell - Rezeptor (TCR) alpha und beta - Ketten, durch ein 2A - Linker getrennt sind , in eine MSCV-basierenden retroviralen Vektor 11 (beispielsweise pMIAII oder pMIGII) 11. HINWEIS: Die 2A Linkers ermöglicht stöchiometrische und konkordant Expression der alpha- und beta-TZR-Ketten von einem einzelnen offenen Leserahmen. Der Vektor enthält eine IRES fluoreszierendes Protein Kassette (ametrine oder GFP), das verwendet wird, umSpur transduzierten Zellen und Transduktionseffizienz. Für eine detaillierte Protokoll finden Sie unter Holst et al. 11 </li><li> Isolieren Plasmid-DNA im Handel erhalten Plasma-Prep-Kit oder ein ähnliches Produkt. Verwenden Sie eine Arbeitskonzentration von 1 bis 2 &amp; mgr; g &amp; mgr; l -1. </li></ol> 2. Erzeugung von Retrovirale Producer-Zelllinien <ol><li> Verwenden einen zweistufigen Prozess die retrovirale Produzentenzelllinien zu erzeugen. HINWEIS: Für ein ausführliches Protokoll, sehen Sie bitte Holst et al . 11. <ol><li> Generieren Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T - Zellen mit drei Plasmiden (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) und Vektor von Interesse 11) und nehmen Sie die retrovirale Überstand von den 293T - Zellen die GP + E86 ekotropischen retroviralen Produzentenzelllinie zu transduzieren. </li><li> Isolieren Sie die oberen 40% der fluoreszierenden exprimierenden GP + E86 produzierenden Zellen durch FACS und propagieren die transdcuced-GP + E86 Produzentenzellen als Quelle des Virus. HINWEIS: Die Erzeugungvon hohem Titer Erzeuger ist kritisch für eine effiziente Transduktion von Knochenmarkszellen. Für eine vollständige Protokoll bitte Holst et al anzuzeigen. 11 </li></ol></li></ol> 3. Retrovirus-vermittelte Stem Cell Gene Transfer (Tag -5) <ol><li> Auftauen und Kultur 0,5 -1,0 x 10 6 jedes GP + E86 Produktionszelllinie in komplettem DMEM 10% (vol / vol) FBS ein ausreichendes Wachstum für zwei konfluenten 150-mm - Platten von Tag 0 dieses Protokolls zu ermöglichen. HINWEIS: Thawing 0,5 - 5. 50% Konfluenz am Tag Dies gilt auch für 5 Tage der Kultur, um den GP + E86 zu erweitern ermöglicht - 1,0 x 10 6 jedes GP + E86 Produktionszelllinie in einem 10 - cm - Platte für 30 erlauben Hersteller-Zelllinien zu zwei konfluenten 150-mm-Platten von Tag 0. <ol><li> Kultur retroviralen Producer-Zelllinie in vollständiger Gewebekulturmedien, enthaltend 5% Kälberserum Feta und Ciprofloxacin (10 ug / ml) Mycoplasma-Kontamination zu vermeiden. Hinweis: Die Verwendung von Ciprofloxacin brechen, wenn generating der virale Überstand für Knochenmarkübertragung. Vermeiden Sie über Wachstum der Erzeugerzelllinie, da diese sich negativ auf Knochenmark Transduktionswirksamkeit auswirken wird. </li></ol></li></ol> 4. Inject Spendermäusen mit 5-Fluorouracil (5-FU) (Tag -3) <ol><li> Wiegen Sie die Spendermäuse (5-12 Wochen alt) erforderlich, um die Menge an 5-FU zu bestimmen. Mit Mäuse jünger als 5 Wochen alt Ergebnisse in Ausbeute gering Knochenmark. Um sicherzustellen, dass die Expression eines einzelnen TCR, verwenden Sie eine T-Zell-defizienten Mausstamm wie SCID, RAG oder TCR alpha defizienten Mäusen als Knochenmarkspender. </li><li> Zu liefern , 0,15 mg 5-FU pro Gramm Körpergewicht Arbeiten in der Gewebekultur Haube verdünnen Sie die 5-FU Lager mit sterilem PBS , um eine ausreichende Menge von 10 mg ml -1 Arbeitslösung von 5-FU zu machen. </li><li> Unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 37 G Nadel injiziert intraperitoneal 0,15 mg 5-FU pro Gramm Körpergewicht pro Spendermaus. HINWEIS: Verwenden Sie 1 Spendermaus pro Empfänger zu starten und zu justierendie Anzahl von Spendermäusen nach der Zellausbeute. Ein alternatives Verfahren zu den 5-FU - Behandlung zur Anreicherung und Isolierung von Knochenmarksvorläuferzellen ist die negative Selektion von Lineage - positiven Zellen , wie in Viret et al. </li></ol> 5. Knochenmark-Extraktionsverfahren (Tag 0) <ol><li> Erhalten Dissektion Schere und Pinzette für die Knochen Isolation. Bereiten Medien (HBSS, ergänzt mit 5% FCS (vol / vol)) Knochen in einem 50 ml konischen Röhrchen zu sammeln. Halten Sie 50 ml konischen haltigen Medien auf Eis. Euthanize Mäuse durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte Tod zu bestätigen. Pinch Pfote um sicherzustellen, dass keine Reflexe erkannt. </li><li> Sterilisieren der Operationsstelle und chirurgische Werkzeuge mit Ethanol oder Methanol. Entfernen Sie den Femur, Tibia, Humerus, und Beckengürtel sorgfältig indem zuerst nach oben und unter dem Beckengürtel. Schnitt zurück nach unten entlang des Oberschenkels an der Tibia. Entfernen Sie das gesamte umliegende Gewebe Schere und Pinzette sauberen Knochen zu erhalten. BehaltenKnochen in HBSS + 5% (vol / vol) FBS hydratisiert. </li><li> Trennen Sie die Knochen von an den Gelenken schneiden, um sicherzustellen, beide abzuschneiden endet in jedem Knochen. Legen Sie eine 25-Gauge-Nadel in eine 10-ml-Spritze befestigt enthält HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Wenden Sie Druck und spülen Sie alle Knochenmark durch einen 70 &amp; mgr; m Sieb ruht in einem 50 ml konischen. </li><li> Von Zeit zu Zeit, drücken Sie die Knochenmark durch die 70-um-Filter den Kolben aus einer 1 ml oder 3 ml Spritze. Spülen Sie das Sieb mit HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Dies wird eine Zellsuspension gewährleisten, die frei von Knochenfragmenten und Gewebe. Halten Zellen steril durch das Verfahren in einer sterilen Haube durchgeführt wird. </li><li> Zentrifuge Knochenmarkszellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. </li></ol> 6. Knochenmark-Kultur (Tag 0) <ol><li> Dekantieren oder absaugen Medien und resuspendieren Zellpellet in 1 ml Ammoniumchlorid-Basis roten Blut Lysepuffer (oder gleichwertig RBC-Lyse-Puffer) pro 50 ml konischen Röhrchen. Nach 1 min Inkubation bei RaumTemperatur, quenchen die rote Puffer Zelllyse durch 10 ml vollständigem DMEM 20% (Vol / Vol) FBS hinzugefügt wird. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren oder absaugen Überstand und resuspendieren Knochenmark in 5 ml komplettem DMEM 20% (vol / vol) FBS. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer. HINWEIS: Allgemeine Ausbeute sollte ca. 5 - 10 x 10 6 Zellen pro Maus; jedoch kann die Ausbeute bei den verschiedenen Stämmen von Mäusen variieren. </li><li> Platte Knochenmarkzellen in einer Dichte von 4 x 10 7 Zellen pro 150 mm-Platte in 30 ml vollständigem DMEM 20% (Vol / Vol) FBS ergänzt mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1). HINWEIS: Verwenden Sie frisch aufgetauten-aliquotiert Zytokinen. Verwenden Sie keine Cytokine, die eingefroren wurden und aufgetaut als einmal oder bei 4 ° C für mehr als 2 Wochen gehalten. </li><li> Inkubieren über Nacht Knochenmark (ca. 24 h) bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol><ol><li> Platte 3 x 10 6 retroviralen Erzeugerzellen pro 150 mm-Platte in 18 ml vollständigem DMEM - 20% (Vol / Vol) FBS. </li><li> Inkubieren retroviralen Erzeugerzellen bei 37 ° C über Nacht. Antizipieren einer 150-mm-Platte für 15 Millionen Knochenmarkzellen (ca. 2 - 3 Donormäusen). </li></ol> 8. Retroviral Supernatant (Tag 1) <ol><li> Am nächsten Tag (etwa 24 Stunden später), ernten den retroviralen Überstand von den Produzenten Platten durch die Erstellung des retroviralen Überstand direkt aus der 150-mm-Platte mit einer 10-ml-Spritze und Filter mit einem 0,45 (in Schritt 7 eingestellt ist) -μm Spritzenfilter. </li><li> ersetzen Sie vorsichtig den entfernten retroviralen Überstand mit 18 ml frischem komplettem DMEM 20% (vol / vol) FBS. </li><li> Ergänzung des gefilterten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) und Hexadimethrinbromid (Polybrene) (6 &amp;# 956; g ml -1). HINWEIS: Hexadimethrinbromid sollten frisch alle 2 Monate gemacht werden, um einen Rückgang der Wirksamkeit der retroviralen Transduktion zu vermeiden. </li></ol> 9. Knochenmark-Ernte (Tag 1) <ol><li> Nach Abschluss von Schritt 8.3, ernten die Knochenmarkzellen aus Schritt 6.4 und übertragen Sie die Medien nicht adhärenten Zellen in sterile 50-ml-Röhrchen enthält. </li><li> Waschen Sie die Platten kräftig mit 10 ml PBS und sammeln sich in der 50-ml-Erlen aus Schritt 9.1. Falls erforderlich, wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Zentrifuge die Zellen bei 300 · g für 10 min bei 4 ° C, dekantiert den Überstand, resuspendiere Zellen in einem kleinen Volumen (1 - 3 ml) komplett DMEM 20% (Vol / Vol) FBS und zählen. Antizipieren von 50 bis 75% Rückgewinnung von Tag 0 Resuspendieren Knochenmark bei 1 x 10 6 Zellen pro 1 ml des retroviralen Überstand Zytokinen und Hexadimethrinbromid enthält. </li></ol> 10. Bone Marrow Transduction (Tag 1) <ol><li> Platte des retroviralen Überstand / Knochen marrow Mischung mit einem Volumen von 3 ml pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte. Wickeln Sie die Platten in der Plastikverpackung um einen Gasaustausch während der Zentrifugation in Schritt 10.2 minimieren. </li><li> Dreh die gewickelt Sechs-Well-Platten bei 1.000 xg für 60 min ein 37 ° C. </li><li> Nach dem Spin abgeschlossen ist, entfernen Sie die Plastikfolie und legen Sie die Platten in einem 37 ° C CO 2 Inkubator für 24 Stunden. </li></ol> 11. Retroviral Supernatant und Transduction (Tag 2) <ol><li> Nach 24 Stunden sammeln frische Virusüberstand aus der viralen Hersteller-Zelllinie. Filtriere den retroviralen Überstand unter Verwendung einer 10-ml-Spritze und eine 0,45-um-Spritzenfilter. Ergänzung des gefilterten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1) und Hexadimethrinbromid (6 g ml -1). </li><li> Als nächstes vorsichtig mit Pipette entfernen oder die obersten 2 ml Medium aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte aspirieren die Knochenmarkszellen enthält,. HINWEIS: Arbeit sorgfältig nicht das Knochenmark anzusaugen, die in der Regel in der Mitte der Vertiefung konzentriert wird. Alternativ kann der abgenommenen versponnen werden Sie sich alle verlorenen Knochenmarkszellen zu erholen. </li><li> Zu jeder Vertiefung im Knochenmark 6-Well-Platte 3 ml frischem viralen Überstand mit Zytokinen und Hexadimethrinbromid. Wickeln Sie die Platten aus Kunststoff, und wiederholen Sie die Spinübertragung bei 1.000 × g für 60 min ein 37 ° C. Auszupacken , die Platten und Inkubieren Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht (etwa 24 h). </li></ol> 12. Zugabe von frischem Ergänzte DMEM (Tag 3) <ol><li> Nach 24 Stunden die Top 2 ml Medium aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte entfernen Sie die Knochenmarkzellen, wie in Schritt 11.2 enthält. Ersetzen Sie die entfernt Medien mit frischem DMEM 20% (vol / vol) FBS mit Endkonzentrationen von IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1) . </li><li> Inkubieren KnochenmarkPlatten bei 37 ° C CO 2 Inkubator für weitere 24 hr. </li></ol> 13. Ernte transduzierten Knochenmark (Tag 4) <ol><li> Nach 24 Stunden, sammeln die Knochenmarkszellen aus den Sechs-Well-Platten. Waschen Sie die Platten kräftig mit PBS alle nicht-adhärente Zellen zu entfernen. <ol><li> Zentrifugieren der Zellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C und dekantiert den Überstand. </li><li> Resuspendieren des Knochenmarks in einem kleinen Volumen (1 ml) PBS + 0,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS. Halten Sie Zellen auf Eis. </li></ol></li><li> Nehmen Sie eine 10-ul-Probe jeder Knochenmark Zustand und zählen Sie die Zellen, die eine Neubauer-Zählkammer verwendet wird. Unter der Annahme , 1 - mindestens 4 x 10 6 Zellen zu übertragen pro Empfängermaus 2 - Donor pro Empfänger, wird die Ausbeute ausreichend sein. Resuspendieren des Knochenmarks in einem ausreichenden Volumen von PBS + 0,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS 200 einzuspritzen - 300 &amp; mgr; l pro Maus. <ol><li> Injizieren mindestens 2 x 10 6 Zellen mit einer Transduktionseffizienz(injizieren bis zu 8 x10 6 Zellen) pro Maus intravenös von 25%. HINWEIS: Es wird routinemßig fünf Empfängermäuse injizieren pro zwei Platten mit 6 Vertiefungen von Knochenmarkszellen. Wenn die Ausbeute wesentlich geringer, mehr Donormäusen ist, sollte bis kann eine ausreichende Knochenmark verwendet werden Zahl erhalten werden. Um eine optimale Wiederherstellung zu erreichen, von mindestens 5 x 10 5 transduzierte (fluoreszierend positive) sollte in jedem Empfänger injiziert werden. </li></ol></li><li> Mit einem Mikro - Pipette, nehmen Sie eine 10-ul - Probe von jeder Bedingung Knochenmark und Transduktionseffizienz durch Fluss analysieren Zytometrie basierend auf der Expression des fluoreszierenden Marker (Abbildung 1A) 11. HINWEIS: In der Regel ist der Anteil der Fluoreszenz-positiven Zellen liegt zwischen 25% und 70%, abhängig von dem Konstrukt und retrovirale Titer. Die Zahl der transduzierten Knochenmarkzellen erforderlich a subletal bestrahlen Maus zu rekonstituieren kann abhängig von der Transduktionseffizienz variieren. Je niedriger die transduction Effizienz, benötigt die mehr Knochenmarkzellen und umgekehrt, je höher die Knochenmark Transduktionseffizienz, die geringere Anzahl von Zellen für die Rekonstitution benötigt. Transduktionseffizienz unter 25% ist suboptimal und kann zu einer unzureichenden Rekonstitution und Überleben führen. Um eine optimale Knochenmark Erholung und Transduktionseffizienz zu gewährleisten, verwenden Sie frisch zubereitete Gewebekulturmedien und Zytokinen. Wenn ein neues TCR Expression des retrogenic System verwendet wird , ist die Auswahl des TCR in vivo unbekannt. In Abhängigkeit von jedem einzelnen TCR - Affinität, TCR Selektion im Thymus und peripheren T - Zell - Expression wird 17 variieren. </li></ol> 14. Maus-Bestrahlung, Knochenmark-Injection und Pflege <ol><li> Bestrahlen Mäuse am Tag vor der Knochenmark-Injektion (am selben Tag wie Schritt 13). Verwenden Sie die folgenden Dosen: C57BL / 6 - Mäuse (und andere Wildtyp - Stämme), 900 rads; Rag1 - / - Mäuse, 500 Rad; SCID - Mäuse, 300 rad). <ol><li> Platz Empfängermäuse auf Amoxicillin (50 mg / kg / Tag) oder ein anderes Antibiotikum Wasserbehandlung vor der Bestrahlung, und halten Sie auf Antibiotika für die ersten zwei Wochen nach der Knochenmark-Injektion. HINWEIS: Die optimale Bestrahlungsdosis kann empirisch bestimmt werden müssen. </li></ol></li><li> Für die Injektion laden die Zellen aus Schritt 13.1 in eine 1-ml-Spritze mit stumpfen Nadeln unmittelbar vor der Injektion, dann Injektion die Nadel 27er ändern, zu vertreiben jegliche Luft Luftembolie zu vermeiden. Wärme Mäuse unter einer Wärmelampe und 0,2 ml Knochenmark pro Maus intravenös injiziert. HINWEIS: Lassen Sie sich nicht Zellen in der Spritze für längere Zeit oder die Zellen absetzen sitzen. </li><li> Überwachen Sie die Mäuse wöchentlich, um sicherzustellen, dass sie gesund bleiben. </li><li> Nach 5 - 6 Wochen, bluten die Mäuse zur Rekonstitution auf der Grundlage von GFP zu überprüfen + / ametrine + und TCR Co-Expression (Abbildung 1B) 11. </li></ol>

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<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73(2011).</li>
<li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

In dem Protokoll wir ausführlich einige kritische Schritte optimale Knochenmark Gesundheit, Transduktionseffizienz und Rekonstitution zu gewährleisten. Erster wichtiger Schritt ist die Erzeugung und die ordnungsgemäße Wartung der GP + E86 Virusproduzentenzellen. Verwenden frühen Passage Produktionszelllinien und halten bei 80% Konfluenz oder niedriger vor der Verwendung. Wenn frisch machen viralen Produzentenzellen GP + E86, sicherzustellen, sind die 293T-Zellen frühen Passage und wachsen in der Kultur für 24 bis 48 Stu...

T - Zell - Rezeptor (TCR) Repertoire von Mensch und Maus wurde mit 1 x 10 8 und 2 x 10 6 einzigartige TCRs jeweils 1,2 geschätzt. Diese große Vielfalt ermöglicht T-Zellen eine Vielzahl von Antigen-Epitope aus selbst Peptiden sowie von Pathogenen dargestellt durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) abgeleitet zu erkennen. Die feinen Unterschiede in den Wechselwirkungen der TCRs mit einzigartigen Peptid-MHC-Komplexe diktieren, ob eine T-Zell-Apoptose durchlaufen wird, Anergie, Aktivierung, Differenzierung, Zytokinproduktion oder Zytotoxizität. Jedoch aufgrund der großen TCR-Repertoire, Analyse, wie ein spezifischer TCR zu einem bestimmten Antigen zu reagieren erfordert die Verwendung von einzelnen TCR-Systeme. Verschiedene TCR transgene Mäuse wurden erzeugt , um die Funktion eines einzelnen TCR in einem in vivo - Modell 3-9 zu studieren. Es gibt jedoch Einschränkungen transgenen Mäusen einschließlich der TCRKosten, die Länge der Zeit eine einzelne transgene Maus und die so genannte Gründereffekt von zufälligen Transgen - Insertion in die Keimbahn DNA 10 zu erzeugen. Daher relativ wenige TCR transgene Mäuse wurden für jede gegebene Antigen und die funktionellen Auswirkungen von hohen und niedrigen TCR-Affinität für das gleiche Epitop gerichtet werden selten erzeugt. Um die Notwendigkeit für eine schnelle Annäherung an Bildschirm - Adresse und mehrere TZR einzeln oder in Kombination, retrogenic ( &#39;retro&#39; von Retrovirus und &quot;gene&quot; von transgenen) Mäuse wurden als Alternative genutzt studieren 11-13 transgene Mäuse zu TCR. Die 2A Peptid Konsensusmotiv innerhalb von mehreren Viren gefunden bestehen aus einer 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, bei der Spaltung zwischen dem Glycin der 2A und dem Prolin der 2B auftritt von cis - aktiven Hydrolase - Aktivität, was zu einer ribosomalen Skipping bei der Übersetzung 10,14-16. Für eine detaillierte Darstellung der c darstelltlaub der verschiedenen 2A Peptide (F2A, E2A, T2A und P2A) finden Sie auf Referenzen 10 - 12. Auf diese Weise zwei Cistrons (TCR alpha und TCR beta) können in einem einzigen Vektor was in stöchiometrischen Übersetzung verknüpft werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes können wir zum Ausdruck bringen und direkt mehrere Antigen - spezifischen TZR in vivo vergleichen.

<table><tbody><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt +</td><td>Glutamin Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Dulbecco's Modifikation von Eagle's Medium mit 4,5 g/L Glukose, L-Glutamin & Natriumpyruvat</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versen</td><td>Lonza</td><td>17-161F</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &#181; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268-10G</td><td>Sterilfiltriert in dH2O</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAJ61970-06</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorouracil (5-FU)</td><td>VWR</td><td>AAA13456-06</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM nichtessentielle Aminosäuren</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M Lösung</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Gewebekulturschalen</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Tisue kulturbehandelte 6-Well-Flachplatte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>70 &#181; m Nylon-Zellsiebe</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL-3</td><td>Invitrogen</td><td>PMC0033</td><td></td></tr><tr><td>Humanes IL-6</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; </td><td></td>PHC0063</tr><tr><td>Maus Stammzellfaktor</td><td>Invitrogen</td><td>PMC2113L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-D13-CM</td><td></td></tr><tr><td>HANKS Buffer</td><td>Corning Cellgro</td><td>21020147</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml Spritze</td><td>BD</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 BD Präzisions-Gleitnadel</td><td>BD</td><td></td><td></td>305109</tr><tr><td>30 G x 1/2 BD Präzisions-Gleitnadel</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

retrovirale transduktion von knochenmark-progenitorzellen zu generieren t-zell-rezeptor retrogenic mäuse

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T-Zell-Rezeptor (TCR)-Signalübertragung ist essentiell für die Entwicklung und Differenzierung von T-Zellen im Thymus bzw. in der Peripherie. Die große Auswahl an TCRs macht es schwierig, eine spezifische antigene Reaktion zu untersuchen. Daher wurden TCR-transgene Mäuse dazu gebracht, die positive und negative Selektion im Thymus sowie die Aktivierung, Proliferation und Toleranz der peripheren T-Zellen zu untersuchen. Es wurden jedoch relativ wenige TCR-transgene Mäuse erzeugt, die spezifisch für ein bestimmtes Antigen sind. Daher fehlten Studien mit TCRs unterschiedlicher Affinitäten für dasselbe antigene Peptid. Die Generierung einer neuen transgenen TCR-Linie kann sechs oder mehr Monate dauern. Darüber hinaus können bestimmte Rückkreuzungen weitere sechs Monate dauern. Um eine schnellere Generierung und ein schnelleres Screening mehrerer TCRs zu ermöglichen, wurde ein Protokoll für die retrovirale Transduktion des Knochenmarks mit stöchiometrischer Expression der TCRα- und TCRβ-Ketten und der Erzeugung retrogener Mäuse etabliert. Jede retrogene Maus ist im Wesentlichen ein Gründer, wodurch ein Gründereffekt praktisch negiert wird, während die Zeitspanne für die Erzeugung eines retrogenen TCR-Maus von sechs Monaten auf etwa sechs Wochen verkürzt wird. Hier stellen wir eine schnelle und flexible Alternative zu TCR-transgenen Mäusen vor, die auf jedem gewählten Hintergrund mit einem bestimmten TCR exprimiert werden kann.

Knochenmark Transduktionseffizienz bei Schritt 13.3 des Protokolls überprüft , bevor das Knochenmark in Schwanzvene iv In der repräsentativen bone marrow Transduktion Figur (1A) eingespritzt wird, ungefähr 10 &amp; mgr; l der geernteten Knochenmark wurden zu 100-ul PBS und für ametrine Expression analysiert. Im allgemeinen der Prozentsatz der fluoreszierenden positiven Zellen liegt zwischen 25% und 70%, abhängig von dem Konstrukt und retrovirale Titer. Nach 6 Wochen Knoc...

Wir präsentieren ein schnelles und flexibles Protokoll für ein retrovirales In-vivo-Expressionssystem auf Basis eines einzelnen T-Zell-Rezeptors (TCR). Retrovirale Vektoren werden verwendet, um Vorläuferzellen des Knochenmarks zu transduzieren, um die Entwicklung und Funktion eines einzelnen TCR in vivo als Alternative zu TCR-transgenen Mäusen zu untersuchen.

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, retrogenische Mäuse zu erzeugen, um die In-vivo-Funktion mehrerer T-Zell-Rezeptoren zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem ein retroviraler Konstrukt verwendet wird, der die alpha- und beta-Ketten des T-Zell-Rezeptors kodiert, die durch ein 2A-Peptid-Konsensmotiv verbunden sind. Diese Methode kann tatsächlich helfen, zentrale Fragen im Immunologiebereich zu beantworten, da durch das Screening mehrerer, für verschiedene Antigene spezifischer TCRs, deren In-vivo-Funktion bestimmt werden kann.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass nach Abschluss des retroviralen Konstrukts der T-Zell-Kompartiment der retrogenen Mäuse innerhalb von etwa sieben Wochen wiederhergestellt ist. Außerdem ist jede retrogene Maus im Wesentlichen eine Stammmaus, sodass durch die Analyse mehrerer Tiere der Stammereffekt ausgeschlossen wird. Diesen Teil des Verfahrens wird Dr. Maria Bettini demonstrieren.Richten Sie die Knochenmarkentnahme ein, indem Sie sterile Dissektionscheren und -pinzetten im Operationsbereich platzieren und das Dissektionsmedium in einem 50-Milliliter-Konischgefäß auf Eis abkühlen. Nach der Tötung der Maus und Bestätigung des Todes durch Halswirbelverrenkung, entfernen Sie mithilfe der Dissektionscheren das Becken, indem Sie entlang und unterhalb des Beckengürtels schneiden. Schneiden Sie dann entlang des Femurs bis zum Tibia zurück und entfernen Sie vorsichtig Femur, Tibia und Humerus.Überführen Sie die Knochen in eine Schale mit Dissektionsmedium im Zellkulturwerkbank und verwenden Sie eine Schere und Pinzette, um das gesamte umgebende Gewebe zu entfernen, um saubere Knochen zu erhalten. Trennen Sie die Knochen, indem Sie an den Gelenken schneiden, und achten Sie darauf, beide Enden jedes Knochens abzuschneiden. Führen Sie dann eine 25-Gauge-Nadel, die an eine 10-Milliliter-Spritze mit Dissektionsmedium angeschlossen ist, in einen Knochen ein.Üben Sie Druck aus und spülen Sie das gesamte Knochenmark durch einen 70 µm-Filter, der in einem 50 Milliliter kegelförmigen Reagenzglas steht. Drücken Sie das Knochenmark regelmäßig mit dem Kolben einer Ein-Milliliter-Spritze durch den 70 µm-Filter und spülen Sie den Filter mit Medium aus. Zentrifugieren Sie die Einzelzell-Suspension des Knochenmarks bei 300 ×g für 10 Minuten bei 4 °C.Nach der Zentrifugation das Medium dekantieren oder abpipettieren und jedes Zellpellet in einem Milliliter eines auf Ammoniumchlorid basierenden Puffers zur Lyse der roten Blutkörperchen resuspendieren. Eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die Lyse der roten Blutkörperchen durch Zugabe von 10 Milliliter Plattierungsmedium stoppen und danach wie zuvor zentrifugieren.Nach dem Entfernen des Überstandes das Knochenmark in fünf Milliliter Plattierngmedium resuspendieren und eine Zellzählung mit einer Neubauer-Zählkammer durchführen. Die Ausbeute sollte etwa fünf bis 10 mal 10 hoch sechs Zellen pro Maus betragen, kann jedoch je nach Stamm variieren. 30 Milliliter Plattierngmedium, ergänzt mit frisch aufgetautem IL-3, IL-6 und SCF, zu 150-Millimeter-Zellkulturplatten hinzufügen.Fügen Sie dann viermal 10 hoch 7 Knochenmarkzellen zu jeder Platte hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid. Thomas Lee wird diesen Teil des Verfahrens demonstrieren. Als Nächstes werden dreimal 10 hoch 6 retrovirale produzierende Zellen in 150-Millimeter-Platten mit 18 Milliliter Platingmedium ausplattiert.Inkubieren Sie die retroviralen Produzentenzellen über Nacht. Am nächsten Tag sammeln und filtern Sie das retrovirale Überstandmedium mit einer 10-Milliliter-Spritze und einem 0,45-Mikron-Filter aus den Produktionsplatten. Ersetzen Sie das entfernte retrovirale Überstandmedium vorsichtig durch 18 Milliliter frisches Ansaatmedium.Supplementieren Sie das gefilterte retrovirale Überstand mit IL-3, IL-6, MSCF und Hexadimethrinbromid. Danach fahren Sie mit der Gewinnung der Knochenmarkzellen fort, indem Sie zunächst das Medium mit den nicht-anklebenden Zellen in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen überführen. Anschließend waschen Sie die Platte kräftig mit 10 Millilitern PBS und geben diese zur konischen 50-Milliliter-Röhrchen hinzu.Nach der Zentrifugation der Zellen bei 300 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius das Überstand entfernen und die Zellen anschließend in ein bis drei Milliliter Platingmedium resuspendieren. Nach Durchführung einer Zellzählung die Knochenmarkzellen in die Brühe geben. Diese Zellmischung mit einem Volumen von drei Milliliter pro Vertiefung in eine sechswellige Gewebekulturplatte ausplattieren.Die Platten mit Knochenmarkszellen mit Plastikfolie abdecken, um den Gasaustausch zu minimieren, und anschließend die Platten bei 1.000 ×g für 60 Minuten bei 37 °C zentrifugieren. Nach Beendigung der Zentrifugation die Plastikfolie entfernen und die Platten für 24 Stunden in einen 37 °C warmen Kohlendioxid-Inkubator stellen. Nach 24 Stunden frisches virales Überstandmedium aus der virusproduzierenden Zelllinie sammeln.Zu diesem Zeitpunkt sollten die Zellen gut verteilt und von defiierter Morphologie sein. Danach vorsichtig die oberen zwei Milliliter Medium aus jedem Brunnen der sechsbrülligen Platte, die die Knochenmarkzellen enthält, abpipettieren. Dabei die Knochenmarkzellen, die sich gewöhnlich in der Mitte des Brunnens konzentrieren, nicht abpipettieren.Geben Sie drei Milliliter frisch supplementiertes virales Überstandmedium in jede Vertiefung der sechs-Loch-Platte, die Knochenmarkzellen enthält. Nachdem die Platten wie zuvor mit Plastikfolie umwickelt wurden, wiederholen Sie die Spin-Transduktion und stellen die ungepackten Platten anschließend in den Zellkultur-Inkubator. Entfernen und ersetzen Sie nach 24 Stunden, am Tag drei, zwei Milliliter Medium aus den Vertiefungen.Am vierten Tag sammeln Sie die Knochenmarkzellen aus der sechswelligen Platte durch kräftiges Waschen mit PBS und sammeln anschließend die Zellsuspension in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Nach der Zentrifugation der Zellen bei 300 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius wird der Überstand abgenommen und das Knochenmark in einem Milliliter PBS mit 0,5 Prozent hitzeinaktiviertem FBS resuspendiert. Stellen Sie das Röhrchen mit den Zellen auf Eis.Danach die Knochenmarkzellen nach einer Zellzählung in einem ausreichenden Volumen an PBS mit 0,5 Prozent hitzeinaktiviertem FBS resuspendieren, um mindestens zwei mal 10 hoch sechs Zellen in einem Volumen von 200 bis 300 Mikroliter pro Maus zu injizieren. Abschließend mit einer Mikropipette eine 10-Mikroliter-Probe jeder Knochenmarkbedingung entnehmen und zu 100 Mikrolitern PBS hinzufügen, um die Transduktionseffizienz mittels Durchflusszytometrie zu analysieren. Die Transduktionseffizienz der Knochenmarkzellen wurde anhand des fluoreszierenden Markers Ametrin analysiert.Das linke Panel zeigt die Vorwärts- und Seitwärtsstreuung von Knochenmarkzellen nach fünf Tagen in Kultur. Das rechte Panel ist auf ametrylpositiv eingestellt und beinhaltet die transduzierten Knochenmarkzellen. Eine erfolgreiche Knochenmark-Transduktion führt zu einem Prozentsatz an fluoreszenzpositiven Zellen zwischen 25 und 70 Prozent.Diese Abbildung zeigt retrogen erzeugte T-Zell-Rezeptor-T-Zellen im peripheren Blut sechs Wochen nach der Knochenmark-Rekonstitution. Nach der Lyse der roten Blutkörperchen wurden die verbleibenden Zellen für den T-Zell-Rezeptor-Beta markiert. Das rechte Panel zeigt eine repräsentative Analyse für die Ametrin-Expression und den anti-T-Zell-Rezeptor-Beta-Nachweis.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Knochenmarkzellen retroviral transduziert und kultiviert, um retrogene Mäuse zu erzeugen.

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese Technik zeigt eine effiziente Möglichkeit, replikationsdefekte retroviralen Aktien Kodierung eines menschlichen Onkogen vorzubereiten, und anschließend zur Induktion der myeloproliferativen Erkrankung im Mausmodell verwendet.

Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen

Wir zeigen hier, dass epigenetische Reprogrammierung über Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) als Instrument zur Maus-Modellen mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor (TCR) Besonderheiten erzeugen kann verwendet werden. Diese transnuclear Mäuse exprimieren die entsprechenden TCR von ihren endogenen Locus unter die Kontrolle des endogenen Promotors.

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Wir präsentieren ein Protokoll zur Antigen-spezifischen Maus-T-Zellen produzieren unter Verwendung von retroviralen...

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Ein effizientes System der Struktur-und Funktionsanalyse eines Gens in...

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

Die Generierung und Charakterisierung von Tumor-spezifischen T-Zellen mit humanisierten Mäusen wird hier beschrieben. Menschliche Thymus-Gewebe und gentechnisch veränderten humanen hämatopoetischen Stammzellen in immungeschwächten Mäusen transplantiert. Hierdurch ergibt sich der Rekonstitution eines konstruierten menschliche Immunsystem so zur in vivo-Untersuchung von Anti-Tumor-Immunantwort.

Mit der BLT humanisierte Maus als Stem Cell based Gene Therapy Tumormodell

Die Manipulation der temporalen Genexpression in differenzierenden embryonalen Stammzellen (ESCs) kann mit induzierbaren Gensystemen erreicht werden. Die Erzeugung dieser Zelllinien ist jedoch kostspielig und zeitaufwändig. Dieses Protokoll erreicht eine schnelle Expression eines Transgens bei der Differenzierung von ES-abgeleiteten Zellen und die anschließende Analyse der nachgeschalteten hämatopoetischen Differenzierung.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Dieses Manuskript bietet eine Beschreibung der Methodik, die zur Etablierung von Transduktions-Transplantations-Mausmodellen verwendet wurde. Es wird detailliert über technische Fehler berichtet, die bei der Durchführung von Knochenmarktransplantationen vermieden werden sollten. Es sollte ein klares Verständnis für die Bedeutung eines hohen Virustiters, Transfektion/Transduktion und Bestrahlung gewonnen werden.

Transduction-Transplantation Maus-Modell der myeloproliferativen Neoplasien

Das aktuelle Protokoll kombiniert, die einzelne Zelle menschlichen TCR Alpha- und Beta-Kette Sequenzierung mit gepaart gestrafft Generation kompatibel mit in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck retroviralen Vektoren.

Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Hier beschreiben wir eine Methode zur retroviralen Überexpression und Adoptivübertragung von murinen B-1a-Zellen zur Untersuchung der in vivo B-1a-Zellmigration und -lokalisierung. Dieses Protokoll kann für verschiedene nachgelagerte funktionelle Assays erweitert werden, einschließlich der Quantifizierung der Spender-B-1a-Zelllokalisierung oder der Analyse von spenderzellabgeleiteten sekretierten Faktoren nach der Übertragung.

Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion

Wir stellen ein Protokoll für die retrovirale Transduktion von Guide-RNA in primäre T-Zellen von Cas9-transgenen Mäusen vor, das eine effiziente Alternative für die Geneditierung bei der Untersuchung der Th17-Differenzierung darstellt.

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

Erfahren Sie die retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zur Erzeugung von T-Zell-Rezeptor-Retrogenic-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Analyse multipler TCRs in vivo und eliminiert Founder-Effekte durch die Untersuchung verschiedener Mäuse.

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

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