Schnelle Hochdurchsatz-Spezies Identifizierung von Pflanzen von Material mit Direktanalyse in Echtzeit hochauflösender Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Art des pflanzlichen Materials mithilfe der Umgebungsionisations-Massenspektrometrie zu identifizieren. In Verbindung mit der multivariaten statistischen Analyse kann diese Methode helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Chemie und Biologie zu beantworten, beispielsweise, um welche Pflanzenart es sich anhand des chemischen Fingerabdrucks handelt.

Sie können außerdem Informationen über die bioaktiven Moleküle erhalten, die im Pflanzengewebe enthalten sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass für die Analyse nur eine geringe Probenvorbereitung erforderlich ist und die Daten innerhalb weniger Minuten erfasst werden können. Diese Methode kann auch zur Lösung anderer Probleme in der Chemie eingesetzt werden.

Zum Beispiel die Verfolgung von Reaktionszwischenprodukten und -produkten in der organischen Synthese, die Analyse komplexer Matrizen verschiedener Art sowie die Headspace-Analyse. Um das frische Kratomblattmaterial vorzubereiten, verwenden Sie eine Lochzange mit einem Durchmesser von sechs Millimetern, um gleichmäßige Kratomblattstücke von der M. speciosa-Pflanze zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal.

Um das Kratom-Pulver zu extrahieren, arbeiten Sie in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und suspendieren Sie eine kleine Menge Kratom-Bali-Pulver in einem Milliliter eines Ethanol-zu-Wasser-Lösungsmittelgemischs im Verhältnis 1:1. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal. Suspendieren Sie die Extraktproben aus Kratom-Bali-Pulver für 30 Minuten in einem Ultraschallbad bei Raumtemperatur.

Anschließend die Kratom-Bali-Pulver-Extraktproben zwei Minuten lang bei 750 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Das Lösungsmittel vom verbleibenden Pulver abgießen, um es einer anschließenden Analyse zuzuführen. Um die Datura-Samen vorzubereiten, einen Samen von D. stramonium mit einem Rasiermesser in der Querebene halbieren.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mit fünf verschiedenen Samen. Nachdem Sie die Massenspektrometer- oder MS-Parameter wie in der Textanleitung beschrieben eingestellt haben, klicken Sie in der Steuerungssoftware des Massenspektrometers auf „Start Run“, um das Kratomblatt zu analysieren. Halten Sie den Chad des Kratomblatt-Pflanzenmaterials mit einer Pinzette zwischen der Ionenquelle und dem Einlass des Massenspektrometers, bis ein Spektrum erhalten wird.

Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal mit getrennten Pflanzenmaterialproben. Um das Spektrum mit Polyethylenglykol 600, abgekürzt PEG, zu kalibrieren, tauchen Sie das geschlossene Ende eines Schmelzpunkt-Kapillarrohrs in den PEG-Standard. Hängen Sie die beschichtete Kapillare zwischen die Ionenquelle und den Einlass des Massenspektrometers.

Wählen Sie die Schaltfläche „Stop“ aus, um den Analyselauf zu beenden. Drücken Sie im Steuersoftware des Massenspektrometers auf „Start Run“, um das getrocknete Kratomblatt zu analysieren. Befestigen Sie mit einer Pinzette eine kleine Menge des getrockneten Blattmaterials zwischen der Ionenquelle und dem Einlass des Massenspektrometers, bis ein Spektrum erhalten wird.

Wiederholen Sie die Erfassung fünfmal, wobei jedes Mal neues Pflanzenmaterial analysiert wird. Kalibrieren Sie das Spektrum wie zuvor mit PEG und wählen Sie anschließend die Schaltfläche „Stop“, um den Analysegang zu beenden. Um das Kratom-Pulver zu analysieren, drücken Sie im Steuersoftware des Massenspektrometers die Taste „Start Run“.

Tauchen Sie das geschlossene Ende eines Schmelzpunkt-Kapillarröhrchens in das Kratom-Pulver ein. Befestigen Sie die beschichtete Kapillare zwischen der Ionenquelle und dem Einlass des Massenspektrometers, bis ein Spektrum erhalten wird. Wiederholen Sie die Analyse fünfmal jeweils mit einer neuen Kapillare, gefolgt von einer PEG-Kalibrierung.

Um den Kratom-Extrakt zu analysieren, tauchen Sie das Ende eines Kapillarrohrs in den Extrakt ein. Befestigen Sie das Kapillarrohr in der 12er-Probenhalterung auf der linearen Schiene des Massenspektrometers. Wiederholen Sie den Vorgang fünfmal, jeweils mit einem anderen Extrakt.

Drücken Sie „Start Run“ in der Steuerungssoftware des Massenspektrometers. Wählen Sie mithilfe des Bedienfelds die Vorwärts-Taste, um die lineare Schiene mit einer Geschwindigkeit von einem Millimeter pro Sekunde durch den Ionenstrom zu bewegen und Spektren zu erfassen. Kalibrieren Sie das Spektrum wie zuvor mit PEG und drücken Sie „Stop“, um die Analyse zu beenden.

Um die Datura-Samen zu analysieren, drücken Sie „Start Run“ in der Steuersoftware des Massenspektrometers. Halten Sie die halbe Datura-Samenkapsel mit einer Pinzette zwischen der Ionenquelle und dem Einlass des Massenspektrometers, bis ein Spektrum aufgezeichnet wurde. Achten Sie darauf, dass die Schnittfläche zur Ionenquelle hin ausgerichtet ist.

Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal, wobei jedes Mal eine neue Samenhälfte analysiert wird. Schließen Sie die Analyse mit der PEG-Kalibrierung ab und klicken Sie auf „Stop“, um den Analyselauf zu beenden. Führen Sie nach der Datenverarbeitung gemäß dem schriftlichen Protokoll die Hauptkomponentenanalyse durch, indem Sie im Reiter „Setup“ zum Abschnitt „Classify“ der Spektralanalyse-Software navigieren und Klassen für die Datenverarbeitung erstellen, indem Sie „Add Class“ auswählen.

Importieren Sie die Textdateien mit den Daten, indem Sie „Dateien hinzufügen“ auswählen. Weisen Sie die Datendateien der entsprechenden Pflanzenklasse zu, indem Sie „Textdateien“ und „Ausgewählte Dateien klassifizieren“ auswählen. Wählen Sie Merkmalsmassen zur Unterscheidung aus dem MS aus dem Trainingsset aus und legen Sie den Schwellenwert in Prozent auf 1 % fest. Legen Sie anschließend eine Massentoleranz von 10 fest und wählen Sie „Vektoren aus Datendateien erstellen“.

Führen Sie im Abschnitt „Compute“ eine Hauptkomponentenanalyse durch, indem Sie das Kontrollkästchen für 3D-PCA-Diagramm aktivieren und „Calculate“ auswählen. Führen Sie eine Leave-one-out-Kreuzvalidierung durch, indem Sie „Validate“ auswählen. Generieren Sie anschließend die Wärmekarte der Daten, indem Sie zum Reiter „Frequency Plot“ der Spektralanalyse-Software wechseln und „Heat Map“ auswählen.

Wählen Sie „Schwellenwert gespeicherte Daten“ aus, um die Häufigkeitsschwelle auf 1 % festzulegen. Exportieren Sie die Heatmap in eine Tabellenkalkulation, indem Sie „Heatmap als Excel-Datei speichern“ auswählen. Speichern Sie die exportierte Heatmap im Tabellenkalkulationsprogramm als Textdatei. Importieren Sie die Heatmap anschließend als Textdatei in die Cluster 3.0-Software, um die hierarchische Clusteranalyse durchzuführen.

Wählen Sie im Hierarchical-Tab von Cluster 3.0 unter den Kontrollkästchen für Gene und Arrays die Optionen Cluster und Calculate weights aus. Legen Sie den Cutoff bei 0,1 fest und den Exponenten auf eins. Wählen Sie die Einzelverknüpfungs-Clusteranalyse (single linkage clustering), um die Analyse durchzuführen.

Abschließend wird die generierte CDT-Datendatei in der Java-Baumansicht angezeigt. Hier sind repräsentative Spektren von Kratom-Produkten im Weichionisationsmodus für positive Ionen dargestellt. Verbindungen, die zuvor aus M. speciosa isoliert wurden, wurden identifiziert.

Unter den nachgewiesenen Verbindungen befinden sich die psychoaktiven Biomarker Mitragynin und 7-Hydroxymitragynin. Hier sind repräsentative Spektren im positiven Ionenmodus mit sanfter Ionisierung von Datura-Samen dargestellt. Es wurden Verbindungen identifiziert, die zuvor bereits aus Datura isoliert wurden, darunter die psychoaktiven Biomarker Atropin und Scopolamin.

Heatmap-Darstellungen der massenspektrometrischen Daten sind hier veranschaulicht. Eine Hauptkomponentenanalyse oder PCA-Plot der Kratom- und Datura-Daten wird gezeigt. Der PCA-Plot verdeutlicht deutlich, dass sich die Kratom-Daten und Datura-Daten gut voneinander unterscheiden.

Die PCA-Analyse zeigte außerdem, dass die einzelnen Sorten von Kratom und die verschiedenen Datura-Arten identifiziert und voneinander unterschieden werden können. Die Ergebnisse der hierarchischen Clusteranalyse (HCA) der Massenspektren von Kratom und Datura werden dargestellt. Die HCA-Ergebnisse zeigten eine Unterscheidung auf Klassen-, Arten- und Sortenebene allein anhand von Daten, die mittels Direktanalyse in Echtzeit mit hochauflösender Massenspektrometrie gewonnen wurden, und bestätigten damit die Ergebnisse der PCA-Analyse.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der vorliegenden Proben, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die direkte Analyse und die Echtzeit-Massenspektrometrie zur Untersuchung komplexer Proben anwendet und wie man die statistische Datenverarbeitung nutzt, um Informationen über die Spezies zu erhalten. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Probe für eine angemessene Dauer im Ionenstrom zu halten, um ein vollständiges Massenspektrum der Probe zu erhalten.

Mithilfe dieser Technik konnten Forscher in zahlreichen Bereichen, darunter die Pflanzen-Omik, Forensik, Organische und Analytische Chemie, die Analyse flüchtiger Verbindungen, die von Pflanzen emittiert werden, untersuchen, legale Alternativen zur Herbeiführung von Drogen identifizieren und Reaktionsprodukte in Echtzeit überwachen.