Schnelle Hochdurchsatz-Spezies Identifizierung von Pflanzen von Material mit Direktanalyse in Echtzeit hochauflösender Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Spezies des botanischen Materials mit Hilfe der Umgebungsionisations-Massenspektrometrie zu identifizieren. In Verbindung mit multivariater statistischer Analyse. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen aus dem Bereich Chemie und Biologie zu beantworten, wie zum Beispiel, welche Pflanzenart man aufgrund seines chemischen Fingerabdrucks hat.

Und Sie können auch Informationen über die bioaktiven Moleküle erhalten, die sich im Pflanzengewebe befinden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass für die Analyse nur eine sehr geringe Probenvorbereitung erforderlich ist und die Daten innerhalb weniger Minuten erfasst werden können. Diese Methode kann auch zur Lösung anderer Probleme in der Chemie eingesetzt werden.

Zum Beispiel die Verfolgung von Reaktionszwischenprodukten und Produkten in der organischen Synthese, die Analyse komplexer Matrizen verschiedener Typen und die Durchführung von Headspace-Analysen. Um das frische Kratom-Blattmaterial zuzubereiten, verwenden Sie einen Locher mit einem Durchmesser von sechs Millimetern, um gleichmäßige Blätter aus Kratom-Blattmaterial aus der M.speciosa-Pflanze herzustellen. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal.

Um das Kratom-Pulver zu extrahieren, arbeiten Sie in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und suspendieren Sie eine kleine Menge Kratom Bali-Pulver in einem Milliliter einer Eins-zu-Eins-Mischung aus Ethanol und Wasser-Lösungsmittel. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal. Beschallen Sie die Kratom Bali Pulverextraktproben in einem Ultraschallbad für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur.

Zentrifugieren Sie dann die Kratom Bali Pulverextraktproben für zwei Minuten bei 750 mal G bei Umgebungstemperatur. Dekantieren Sie das Lösungsmittel aus dem Restpulver für die anschließende Analyse. Um die Stechapfel zuzubereiten, schneiden Sie einen D.stramonium-Samen mit einer Rasierklinge quer über die Querebene in zwei Hälften.

Wiederhole diesen Vorgang mit fünf verschiedenen Samen. Nachdem Sie das Massenspektrometer oder die MS-Parameter, wie im Textprotokoll beschrieben, eingerichtet haben, drücken Sie Start Run in der Massenspektrometer-Steuerungssoftware, um das Kratomblatt zu analysieren. Suspendieren Sie den Tschad aus Kratom-Blattpflanzenmaterial mit einer Pinzette zwischen der Ionenquelle und dem Einlass des Massenspektrometers, bis ein Spektrum erhalten wird.

Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal mit separaten Blättern Pflanzenmaterial. Um das Spektrum mit Polyethylenglykol 600, abgekürzt PEG, zu kalibrieren, tauchen Sie das geschlossene Ende eines Schmelzpunkt-Kapillarrohrs in den PEG-Standard. Hängen Sie die beschichtete Kapillare zwischen der Ionenquelle und dem Einlass des Massenspektrometers auf.

Wählen Sie die Schaltfläche Stopp aus, um den Analyselauf zu beenden. Drücken Sie Start Run in der Massenspektrometer-Steuerungssoftware, um das getrocknete Kratomblatt zu analysieren. Suspendieren Sie eine kleine Menge getrocknetes Blattmaterial mit einer Pinzette zwischen der Ionenquelle und dem Einlass des Massenspektrometers, bis ein Spektrum erhalten wird.

Wiederholen Sie die Erfassung fünfmal, indem Sie jedes Mal neues Pflanzenmaterial analysieren. Kalibrieren Sie das Spektrum wie zuvor mit PEG, und wählen Sie dann die Schaltfläche Stopp aus, um den Analyselauf zu beenden. Um das Kratom-Pulver zu analysieren, drücken Sie Start Run in der Massenspektrometer-Steuerungssoftware.

Tauche das geschlossene Ende einer Schmelzpunktkapillare in das Kratompulver. Die beschichtete Kapillare wird zwischen der Ionenquelle und dem Einlass des Massenspektrometers aufgehängt, bis ein Spektrum erhalten wird. Wiederholen Sie die Analyse fünfmal mit jeweils einer neuen Kapillare, gefolgt von einer PEG-Kalibrierung.

Um den Kratom-Extrakt zu analysieren, tauchen Sie das Ende eines Kapillarrohrs in den Extrakt. Hängen Sie das Kapillarrohr in den 12-Probenhalter an der Linearschiene des Massenspektrometers auf. Wiederholen Sie dies fünfmal mit jeweils einem anderen Extrakt.

Drücken Sie Start Run in der Steuerungssoftware für das Massenspektrometer. Wählen Sie auf dem Bedienfeld die Vorwärtsvorschub-Taste, um die lineare Schiene mit einer Geschwindigkeit von einem Millimeter pro Sekunde durch den Ionenstrom zu bewegen und Spektren zu sammeln. Kalibrieren Sie das Spektrum wie zuvor mit PEG und drücken Sie Stopp, um den Analyselauf zu beenden.

Um die Datursamen zu analysieren, drücken Sie Start Run in der Massenspektrometer-Steuerungssoftware. Hängen Sie die Hälfte des Daturas mit einer Pinzette zwischen der Ionenquelle und dem Einlass des Massenspektrometers auf, bis ein Spektrum gesammelt ist. Stellen Sie sicher, dass die Schnittseite zur Ionenquelle ausgerichtet ist.

Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal und analysieren Sie jedes Mal eine neue Samenhälfte. Schließen Sie die Analyse mit einer PEG-Kalibrierung ab und drücken Sie Stopp, um den Analyselauf zu beenden. Nachdem Sie die Datenverarbeitung durchgeführt haben, wie im Textprotokoll beschrieben, führen Sie die Hauptkomponentenanalyse durch, indem Sie zum Abschnitt Klassifizieren der Spektralanalysesoftware auf der Registerkarte Setup navigieren und Klassen für die Datenverarbeitung erstellen, indem Sie Klasse hinzufügen auswählen.

Importieren Sie die Textdateien mit Daten, indem Sie Dateien hinzufügen auswählen. Ordnen Sie Datendateien der entsprechenden Anlagenklasse zu, indem Sie Textdateien und Klasse für ausgewählte Dateien festlegen auswählen. Wählen Sie Merkmalsmassen für die Unterscheidung von MS aus dem Trainingssatz aus, und legen Sie den Schwellenwert in Prozent auf 1 % fest. Legen Sie als Nächstes eine Massentoleranz auf 10 fest, und wählen Sie Vektoren aus Datendateien erstellen aus.

Führen Sie im Abschnitt Berechnen eine Hauptkomponentenanalyse durch, indem Sie das Kontrollkästchen für 3D-PCA-Diagramm aktivieren und Berechnen auswählen. Führen Sie eine Kreuzvalidierung ohne Auslass durch, indem Sie Überprüfen auswählen. Generieren Sie dann die Heatmap der Daten, indem Sie zur Registerkarte Frequency Plot der Spektralanalysesoftware navigieren und Heatmap auswählen.

Wählen Sie Gespeicherte Daten für den Schwellenwert aus, um den Schwellenwert für die Abundanz auf 1 % festzulegenExportieren Sie die Heatmap in eine Tabellenkalkulation, indem Sie Heatmap in Excel speichern auswählen. Speichern Sie im Tabellenkalkulationsprogramm die exportierte Heatmap als Textdatei. Um dann die hierarchische Clustering-Analyse durchzuführen, importieren Sie die Heatmap als Textdatei in die Cluster 3.0-Software.

Auf der Registerkarte Hierarchisch von Cluster 3.0 unter Gene und Arrays die Kontrollkästchen Clustern und Gewichte berechnen. Legen Sie den Grenzwert auf 0,1 und den Exponenten auf eins fest. Wählen Sie Single Linkage Clustering aus, um eine Analyse durchzuführen.

Zeigen Sie abschließend die generierte cdt-Datendatei in der Java-Baumansicht an. Repräsentative Spektren des positiven Ionenmodus der weichen Ionisation von Kratom-Produkten sind hier dargestellt. Es wurden Verbindungen identifiziert, die zuvor aus M. speciosa isoliert worden waren.

Einschließlich der psychoaktiven Biomarker Mitragynin und 7-Hydroxy-Mitragynin. Repräsentative Spektren des positiven Ionenmodus der weichen Ionisation von Datura Seeds sind hier dargestellt. Es wurden Verbindungen identifiziert, die zuvor aus Stechapfel isoliert worden waren, darunter die psychoaktiven Biomarker Atropin und Scopolamin.

Heatmap-Renderings der massenspektrometrischen Daten sind hier dargestellt. Es wird eine Hauptkomponentenanalyse oder ein PCA-Diagramm der Kratom- und Datura-Daten gezeigt. Das PCA-Diagramm zeigt deutlich, dass die Kratom-Daten und die Datura-Daten gut voneinander aufgelöst sind.

Die PCA-Analyse ergab auch, dass die einzelnen Kratom-Sorten und die verschiedenen Arten von Stechapfel identifiziert und voneinander unterschieden werden können. Hierarchische Clustering-Analyse oder HCA-Ergebnisse der Massenspektraldaten von Kratom und Datura werden gezeigt. Die Ergebnisse der HCA zeigten eine Differenzierung von Klassen, Spezies und Sorten, die ausschließlich auf der direkten Analyse in hochauflösenden Massenspektrometriedaten in Echtzeit basierten, und bestätigten die Ergebnisse der PCA-Analyse.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Proben, die Sie haben, wenn Sie es richtig machen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die direkte Analyse und die Echtzeit-Massenspektrometrie zur Analyse komplexer Proben und die statistische Analyse der Daten zur Gewinnung von Speziesinformationen einsetzen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Probe für eine angemessene Zeit im Ionenstrom zu halten, um ein vollständiges Massenspektrum der Probe zu erhalten.

Diese Technik hat es Forschern in vielen Bereichen ermöglicht, darunter Pflanzenomics, Forensik, organische und analytische Chemie, die Analyse von flüchtigen Stoffen, die von Pflanzen emittiert werden, zu untersuchen, legale Alternativen zur Auslösung von Arzneimitteln zu identifizieren und Reaktionsprodukte in Echtzeit zu überwachen.