Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, die Auswirkungen von Behandlungen von Interesse auf die zelluläre Adhäsion unter Scherstressbedingungen zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunzellsignalgebung zu beantworten, beispielsweise welche Faktoren die Integrinaktivierung vermitteln. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass einzelne Integrinpaare von Adhäsionsmolekülen in einem leicht reproduzierbaren Flusssystem untersucht werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Aktivierung von LFA1 ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf die Untersuchung anderer Integrine anwenden. Im Allgemeinen könnten Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten haben, da der technische Aufbau exakt durchgeführt werden muss. Um die CHO-ICAM-Zellen zu gewinnen, behandeln Sie die Kultur für eine Minute bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln mit 0,5 % Trypsin-EDTA.

Wenn sich die Zellen beginnen abzulösen, neutralisieren Sie die Trypsin-Lösung mit vier Millilitern frischem Medium und zählen Sie die Anzahl der dissoziierten Zellen. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 0,75 × 10⁵ Zellen pro Kammer und zentrifugieren Sie sie. Resuspendieren Sie anschließend das Zellpellet in 30 Mikroliter pro Flusskammer in vollständigem CHO-ICAM-Kulturmedium und geben Sie langsam 30-Mikroliter-Aliquote Zellen pro Reservoir der Flusskammer zu.

Die Zellen fünf Minuten lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid ansiedeln lassen. Anschließend 200 Mikroliter komplettes Kulturmedium in beide Reservoire jeder Kammer geben und die Platte für eine Übernachtkultur in den Inkubator zurückstellen. Nach der Gewinnung der T-Zellen die Zellsuspension zählen und auf eine Konzentration von zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Kammer verdünnen.

Anschließend die Zellen zentrifugieren und das Pellet in einem Milliliter PBS resuspendieren, ergänzt mit 1 % Glukose pro zwei mal zehn hoch sechs T-Zellen. Danach die T-Zellen in einer 1:1000-Verdünnung von CFSE unter Lichtschutz für acht Minuten bei Raumtemperatur markieren. Am Ende der Inkubation die Zellen zentrifugieren und das Pellet in 240 Mikroliter serumfreiem RPMI-Medium pro Kammer resuspendieren.

Teilen Sie die Zellen anschließend auf ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Kammer auf und lagern Sie die Röhrchen bis zur Beladung in einem Wärmeblock bei 37 Grad Celsius. Erwärmen Sie vor der Bildaufnahme die Live-Bildgebungskammer des Mikroskops auf 37 Grad Celsius und füllen Sie eine 500-Milliliter-Glasflasche mit Wasser. Bohren Sie zwei Löcher in den Deckel, die als Ein- und Ausgang gekennzeichnet sind, führen Sie den Schlauch des Spritzenanschlusses durch das Ein-Loch und den Schlauch des Eingangsreservoirs durch das Aus-Loch.

Spülen Sie den Zulaufschlauch mit einer 60-Milliliter-Spritze zunächst mit 60 Milliliter Wasser und anschließend mit 60 Milliliter serumfreiem Medium bei 37 Grad Celsius, um jegliche Luft aus dem System zu entfernen. Sobald der Schlauch befüllt ist, bringen Sie die gesamte Zulaufvorrichtung in die Live-Bildgebungs-Kammer des Mikroskops ein, um das System bei 37 Grad Celsius zu halten. Führen Sie den Schlauch und die Spritze aus der Kammer heraus und setzen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe ein.

Als Nächstes bohren Sie ein Loch in den Deckel einer 250-Milliliter-Flasche, die als Ablaufbehälter dient, und führen Sie die Auslassleitung durch das Loch in die Flasche ein. Danach befestigen Sie den Deckel des Ablaufbehälters locker und stellen die gesamte Ablaufvorrichtung in die Live-Bildgebungs-Kammer. Platzieren Sie nun den Objektträger der Durchflusskammer auf dem Mikroskoptisch und verwenden Sie das 20X-Objektiv, um die Fokusebene auf die CHO-ICAM-Einschicht festzulegen.

Danach, beginnend mit der unbehandelten Kontrolle, verwerfen Sie drei Portionen von jeweils 70 Mikroliter aus dem Ausgangsreservoir der ersten Kammer und geben drei Portionen von jeweils 70 Mikroliter CFCS-markierte T-Zellen in das Eingangsreservoir. Während sich die T-Zellen vom Einlass zum Auslass bewegen, nehmen Sie Bilder von fünf zufälligen Feldern CFSE-positiver T-Zellen in jeder Kammer auf, um die Zellzahlen vor dem Fluss zu bestimmen. Anschließend verbinden Sie gleichzeitig die Ein- und Auslassschläuche mit den Reservoirs der Flusskammer, achten dabei darauf, keine Luftblasen einzuführen, und beginnen den Scherstrom mit 0,3 Millilitern pro Minute, während Sie weiterhin die mit CFSC gefärbten T-Zellen visuell überwachen.

Sobald eine Bewegung der T-Zellen beobachtet wird, starten Sie einen Timer für fünf Minuten und beenden Sie die Strömung am Ende des Fünf-Minuten-Zeitraums. Anschließend nehmen Sie Bilder von fünf Feldern CFSE-positiver Zellen in jeder Kammer auf, wobei die Felder zufällig ausgewählt werden, um die Zellzahlen nach der Strömung zu ermitteln. Für die PMA-Stimulation stimulieren Sie ein Röhrchen mit T-Zellen mit PMA, um unmittelbar vor dem Beladen der T-Zellen in die zweite Durchflusskammer zur Bildgebung einen positiven Kontrollansatz zu erhalten, wie gerade gezeigt.

Für die SDF-1-alpha-Stimulation entnehmen Sie zunächst drei Aliquote zu je 70 Mikroliter Medium aus dem Ausgangsreservoir der dritten Kammer und geben anschließend 70 Mikroliter SDF-1 alpha in das Eingangsreservoir. Nach fünf Minuten verwerfen Sie drei Aliquote zu je 70 Mikroliter aus dem Ausgangsreservoir und geben das verbleibende Röhrchen mit T-Zellen zur Bildgebung hinzu, wie gerade gezeigt. In diesen repräsentativen Bildern wird vor der Durchflussbehandlung unter den verschiedenen Stimulationsbedingungen eine ähnliche Anzahl von T-Zellen beobachtet.

Nach fünf Minuten andauernder Scherbelastung steigt die Anzahl der adhärenten T-Zellen unter den Stimulationsbedingungen mit PMA und SDF-1 alpha, während nur wenige nichtstimulierte T-Zellen adhärent bleiben. Tatsächlich führt beispielsweise die Aktivierung von T-Zellen durch SDF-1 alpha zu einem nahezu zweifachen Anstieg der T-Zelladhäsion im Vergleich zu nichtstimulierten Kontrollzellen. Außerdem zeigt die Berechnung der prozentualen Adhäsion primärer humaner CD3-positiver T-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von SDF-1 alpha, dass 15 % der nichtstimulierten T-Zellen unter Scherbelastung adhärieren, verglichen mit 50 % der T-Zellen unter SDF-1-alpha-Aktivierungsbedingungen.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in einem Assay vernünftigerweise auf sechs Versuchskammern erweitert werden. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, nur mit der konfluenten ICAM-Monoschicht zu arbeiten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden, wie beispielsweise die Analyse der Zellform, an den aufgenommenen Bildern durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Zelladhäsion unter Scherstressbedingungen quantifiziert werden kann. Vielen Dank für das Anschauen dieses Videos und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.