Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, die Auswirkungen von Behandlungen von Interesse auf die zelluläre Adhäsion unter Scherspannungsbedingungen zu bestimmen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Immunzellsignale zu beantworten, z. B. welche Faktoren die Integrinaktivierung vermitteln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass einzelne Adhäsionsmolekül-Integrinpaare in einem leicht replizierbaren Strömungssystem untersucht werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die LFA1-Aktivierung geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung anderer Integrine angewendet werden. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die technische Einrichtung präzise ausgeführt werden muss. Um die CHO-ICAM-Zellen zu ernten, behandeln Sie die Kultur eine Minute lang bei Raumtemperatur mit 0,5 % Trypsin-EDTA unter leichtem Schütteln.

Wenn sich die Zellen abzulösen beginnen, neutralisieren Sie das Trypsin mit vier Millilitern frischem Medium und zählen Sie die Anzahl der dissoziierten Zellen. Verdünnen Sie die Zellen auf eine 0,75-fache Konzentration von 10 bis fünf Zellen pro Kammer und schleudern Sie sie in einer Zentrifuge herunter. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet in 30 Mikrolitern pro Durchflusskammer in vollständigem CHO-ICAM-Kulturmedium und säen Sie langsam 30 Mikroliter Aliquots von Zellen pro Reservoir der Durchflusskammer aus.

Legen Sie die Zellen fünf Minuten lang in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Geben Sie dann 200 Mikroliter des vollständigen Nährmediums in beide Reservoirs jeder Kammer und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator für die Übernachtkultur. Nach der Ernte der T-Zellen wird die Zellsuspension auf eine Konzentration von zwei mal 10 bis sechs Zellen pro Kammer gezählt und verdünnt.

Zentrifugieren Sie dann die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS, ergänzt mit 1% Glukose pro zwei mal zehn bis zu den sechsten T-Zellen. Als nächstes markieren Sie die T-Zellen in einer Verdünnung von 1 bis 1000 CFSE, die acht Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt ist. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in 240 Mikrolitern serumfreiem RPMI-Medium pro Kammer.

Teilen Sie dann die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Kammer auf und lagern Sie die Röhrchen bis zum Beladen in einem 37 Grad Celsius heißen Heizblock. Erwärmen Sie vor der Bildgebung die Live-Imaging-Kammer des Mikroskops auf 37 Grad Celsius und füllen Sie eine 500-Milliliter-Glasflasche mit Wasser. Machen Sie zwei Löcher in den Deckel, die nach innen und außen beschriftet sind, und führen Sie den Spritzenanschlussschlauch durch das Eingangsloch und den Verbindungsschlauch für den Eingangsbehälter durch das Ausgangsloch.

Verwenden Sie eine 60-Milliliter-Spritze, um den Eingangsschlauch mit 60 Millilitern Wasser zu spülen, gefolgt von 60 Millilitern serumfreiem Medium mit einer Temperatur von 37 Grad Celsius, um jegliche Luft aus dem System zu entfernen. Wenn der Schlauch vorbereitet ist, übertragen Sie den gesamten Eingangsaufbau in die Live-Imaging-Kammer des Mikroskops, um das System auf 37 Grad Celsius zu halten. Führen Sie den Schlauch und die Spritze aus der Kammer und laden Sie die Spritze in die Spritzenpumpe.

Machen Sie als Nächstes ein Loch in den Deckel einer 250-Milliliter-Flasche, die als Abfallbehälter dient, und führen Sie den Ausgangsschlauch durch das Loch in die Flasche. Befestigen Sie dann den Deckel der Ausgabeflasche locker und legen Sie das gesamte Ausgabe-Setup in die Live-Imaging-Kammer. Platzieren Sie nun den Objektträger der Durchflusskammer auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie mit dem 20X-Objektiv die Fokusebene auf der CHO ICAM-Monoschicht ein.

Dann, beginnend mit der unstimulierten Kontrolle, werden drei 70-Mikroliter-Volumina aus dem Ausgangsreservoir der ersten Kammer verworfen und drei 70-Mikroliter-Volumina von FCKWS-markierten T-Zellen in das Eingangsreservoir gegeben. Während sich die T-Zellen vom Einlass zum Auslass bewegen, bilden Sie fünf zufällige Felder von CFSE-positiven T-Zellen in jeder Kammer ab, um die Zellzahlen vor dem Fluss zu erhalten. Befestigen Sie als Nächstes gleichzeitig die Eingangs- und Ausgangsschläuche an den Behältern der Durchflusskammer, achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen, und beginnen Sie den Scherspannungsfluss bei 0,3 Millilitern pro Minute, während Sie die CFSC-gefärbten T-Zellen weiter visualisieren.

Sobald eine Bewegung der T-Zellen beobachtet wird, starten Sie einen Timer für fünf Minuten und beenden Sie den Fluss am Ende des Fünf-Minuten-Zeitraums. Bilden Sie dann fünf Felder mit CFSE-positiven Zellen in jeder Kammer ab und wählen Sie die Felder nach dem Zufallsprinzip aus, um die Anzahl der Zellen nach dem Fluss zu erhalten. Für die PMA-Stimulation stimulieren Sie ein Röhrchen mit T-Zellen mit PMA, um als Positivkontrolle zu dienen, unmittelbar bevor Sie die T-Zellen in die zweite Durchflusskammer für die Bildgebung laden, wie gerade gezeigt.

Für die SDF-1-alpha-Stimulation entfernen Sie zuerst drei 70-Mikroliter-Aliquots des Mediums aus dem Ausgangsreservoir der dritten Kammer und fügen Sie dann 70 Mikroliter SDF-1 alpha in das Eingangsreservoir hinzu. Nach fünf Minuten verwerfen Sie drei 70-Mikroliter-Aliquots aus dem Ausgangsreservoir und fügen Sie das verbleibende Röhrchen mit den T-Zellen für die Bildgebung hinzu, wie gerade gezeigt. In diesen repräsentativen Bildern ist eine ähnliche Anzahl von T-Zellen vor dem Fluss unter den verschiedenen Stimulationsbedingungen zu beobachten.

Nach fünf Minuten kontinuierlicher Scherbelastung steigt die Anzahl der adhärenten T-Zellen unter den PMA- und SDF-1-alpha-Stimulationsbedingungen an, während einige wenige unstimulierte T-Zellen adhaftiert bleiben. Tatsächlich induziert die Aktivierung von SDF-1-alpha-T-Zellen beispielsweise eine nahezu zweifache Erhöhung der T-Zell-Adhäsion im Vergleich zu den unstimulierten Kontrollzellen. Wenn die prozentuale Adhäsion von primären humanen CD3-positiven T-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von SDF-1 alpha berechnet wird, haften 15 % der nicht stimulierten T-Zellen unter Scherspannung, verglichen mit 50 % der T-Zellen unter SDF-1-alpha-Aktivierungsbedingungen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik sinnvoll auf sechs Versuchskammern in einem Assay erweitert werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, nur mit der konfluentiellen ICAM-Monoschicht zu arbeiten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die Zellformanalyse, an den aufgenommenen Bildern durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Zelladhäsion unter Scherspannungsbedingungen quantifizieren kann. Vielen Dank, dass Sie sich dieses Video angesehen haben, und viel Glück bei Ihren Experimenten.