Name: Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Expansion mesenchymaler Stammzellen aus humanem Plazentagewebe. Diese Methode nutzt manuelle Dissektion und enzymatische Verdauung für zuverlässige Zellkulturen.

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RP wurde von einem National Health and Medical Research Council (NHMRC) Postdoc Fellowship unterstützt. VS wurde von einer Universität von Queensland International Postgraduate Studienstipendium unterstützt. MRD wurde von der NHMRC und Inner Wheel Australien unterstützt. Wir danken der klinischen und Pflegepersonal in die Zustimmung des Patienten und Probensammlung zu unterstützen. Wir danken Prof. Nickolas Fisk, Prof. Kerry Atkinson und Dr. Rohan Lourie für aufschlussreiche Diskussionen in der Geburtshilfe, feto-Entwicklung der Plazenta und der Plazenta Anatomie.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Plazenta ist eine physikalisch große fetomaternalen Organ, von dem Fötus oder der Mutter MSC 22 isoliert werden. Dabei stellten wir einen detaillierten Überblick über Plazenta Anatomie und Anleitung, wie man speziell sezieren Decidua (mütterlicherseits), Chorionzotten (fötalen) und Chorionplatte (fötalen) Gewebe (Schritt 2,2-2,4). Anschließend skizzierte wir ein robustes Protokoll, das MSC Isolierung von jedem dieser drei Gewebe ermöglicht (Schritt 2,5-2,6). Placental MSC Expansion ist effizient und Kulturen erscheinen ähnlich wie Knochenmark stammenden MSC - Kulturen (3 und 4). Osteogene Differenzierung ist zuverlässig (5B), während adipogene Differenzierung der Regel weniger effizient (5C) 5. Viele Neulinge auf dem Gebiet wird davon ausgehen, dass abgeleitete Kulturen von fötalen Chorionzotten oder Chorionplatte Gewebe wird für die fetale MSC angereichert werden. Doch in unseren Händen fetal Zellanreicherung ist nur vorübergehend , wenn Standard - MSC Expansionsmedium wie DMEM-LG + 10% FBS 5 verwendet wird. Hier bieten wir repräsentative Ergebnisse Plazentagewebe unter Verwendung von einem männlichen Baby abgeleitet. Durch die Verwendung von Plazentagewebe von einem männlichen Baby, die fötalen Zellen sind leicht erkennbar als XY - Chromosomen, während mütterlichen Zellen als mit XX - Chromosomen erkennbar sind. Abbildung 6 zeigt XY FISH Ergebnisse für eine repräsentative Kultur. Während fötalen MSC (XY) (bis zu 80%) in den ersten Kulturen von fötalen Chorionzotten oder Chorionplatte Gewebe, diese gleichen Kulturen schnell überholt (~ 100%) durch mütterliche (XX) MSC über die ersten beiden Stellen abgeleitet angereichert sind, . In Standardmedium, bestehend aus DMEM-LG + 10% FBS, die wenigen mütterlichen abgeleiteten MSC, die die fötale Gewebe outcompete die fetale abgeleiteten Zellen in Kultur verunreinigen. Ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll skizziert ist eine Anerkennung der Plazenta-Anatomie und von wo aus fötalenund mütterlichen Gewebe kann am effektivsten geerntet. Wie in den repräsentativen Ergebnissen Abschnitt beschrieben, wird Präparation von fetalen Gewebe transienter Anreicherung für MSC fötalen abgeleiteten ermöglichen. Verbesserungen in der Expansionsmedium Formulierung durch spezifische exogene Wachstumsfaktor Mediumergänzung sollten selektive Expansion der fetalen abgeleiteten MSC Populationen erlauben und ein Zellprodukt herzustellen, das für die fetale angereichert ist, anstatt mütterlichen Zellen (unsere Gruppe gegenwärtig solche Medium Formulierungen zu entwickeln). Die Herstellung von fötalen MSC Populationen kann eine Reihe von Vorteilen aufweisen, wie fötales MSC größer Angiogenese und immunsuppressive Eigenschaften als gleichwertig mütterlichen MSC Populationen 37 haben werden vorgab. In jeder der beschriebenen Isolierungsprotokollen verwendeten wir etwa 10 g Gewebe. Eine ganze placenta ist typischerweise 500-750 g, und in früheren Arbeiten haben wir gezeigt, dass digest durch automatisierte Gewebe und einer Zellexpansions Bioreaktor proczesse , dass es möglich sein sollte , 4 mehr als 7.000 klinische Zell Dosen aus einer einzigen Plazenta herzustellen. Diese Zahlen unterstreichen die mögliche Eignung von plazentalem abgeleitetes MSC in allogenen MSC-Therapien, und die Bedeutung dieses Verfahren unabhängig von der MSC Ursprungs (Fötus oder der Mutter). Aus therapeutischer Sicht ist es sehr wichtig, dass Benutzer ein umfassendes Verständnis der Zellprodukt haben und die Fähigkeit, zuverlässig diese Zellprodukt herzustellen. Wir hoffen, dass unsere Video-Forscher unterstützen Plazenta Anatomie zu verstehen, zu isolieren MSC aus der Plazenta, und erwarten, dass die wahrscheinlich Fötus oder der Mutter Zelle Zusammensetzung ihrer Kulturen.

Mesenchymale Stammzellen / Stromazellen (MSC) entstehen als aussichtsreicher Kandidat für die Verwendung in zellbasierten Therapien 1. Die meisten Anwendungen werden zwei MSC-vermittelte Gewebereparatur oder Immunregulation zu zielen. In vielen dieser Anwendungen kann allogenen MSC sein , so effektiv wie autologe MSC 3. Der Einsatz von allogenen MSC hat den wirtschaftlichen Vorteil , der mit der großtechnischen Herstellung von mehreren Zelldosen aus einer Hand Gewebe 4 kompatibel für viele Patienten zu behandeln. Historisch gesehen , aus dem Knochenmark 4 präklinische und klinische Studien haben MSC-derived verwendet. Knochenmark wird aus dem Beckenkamm eines Freiwilligen Spender im Allgemeinen gesammelt. Dieses Verfahren ist invasiv und nur ein kleines Volumen von marrow (~ 20 ml) wird durch eine einzige Punktion entnommen. Generierung klinisch bedeutsame Zahl von MSC erfordert in vitro - Expansion umfangreich. Totipotenz nimmt mit Passage-Nummer <sup&gt; 3, ein Paradoxon zu schaffen , wo die theoretische Anzahl der für die klinische Wirksamkeit erforderlich Zellen desto mehr wird die Zellpopulation erhöht wird erweitert. Im Gegensatz zu Knochenmark - Aspiraten ist Begriff Plazenta eine physikalisch große Ausgangsgewebe (typischerweise 500-750 g 4), die ohne Risiko für den Spender während aseptisch Sectio geerntet werden können. MSC aus der Plazenta haben MSC langfristige Proliferation 5 und immunmodulierende Kapazität 6, überlegen aus dem Knochenmark abgeleitet. In einer früheren Studie haben wir gezeigt , dass eine einzige Begriff Plazenta für die Herstellung von bis zu 7.000 klinischen Dosen 4 ausreichend MSC enthalten. Diese Eigenschaften machen placenta eine ideale Quelle Gewebe für die Herstellung von allogenen MSC. Die Plazenta ist ein fetomaternalen Organ , bestehend aus sowohl fötalen und mütterlichen Gewebe 7 und damit MSC fetaler oder mütterlichen Ursprungs kann theoretisch sein, isoliert. Die folgenden Referenzen bieten detailed Informationen über die Entwicklung und Pathologie sowie mikroskopische und makroskopische Untersuchung der menschlichen Plazenta und adnexa 8,9. Die Plazenta richtige ist weitgehend von fetalen Blutgefäße und sekretorischen und Stützzellen genannt Trophoblasten besteht, die Chorionzotten durch die Chorion frondosum (Platte) 8 abgedeckt bilden. Die verzweigten Plazentazotten werden im mütterlichen Blut geliefert von der Gebärmutterspiralarterien gebadet, so dass Nährstoff, Hormon-und Gasaustausch zwischen Fötus und Mutter. Die Plazenta auf das Endometrium über mütterliche dezidualen Stromazellen und fetale extravillious Trophoblasten verankert ist , sind in der extrazellulären Matrix 8 durchsetzt. Die Zotten konvergieren auf die fetale Chorionplatte , wo sie die Nabelschnur 8 bilden. Ein Ergebnis der ersten internationalen Workshop über Plazentare gewonnenen Stammzellen (2008) war eine Anerkennung der Notwendigkeit, die Isolation und characterizatio zu standardisierenn von Zellen aus der menschlichen Plazenta 10. Aufgrund der Anatomie der Plazenta, Präparation der verschiedenen Gewebe, Isolierung von MSC und erwartete Kultur Ergebnisse können für Neulinge auf dem Gebiet überwältigend sein. In diesem Protokoll ist die Ernte von Plazenta Chorion-Gewebe, gefolgt von MSC Isolierung und Expansion gründlich detailliert. MSC Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie und in vitro Differenzierung Routine 5,11-13 betrachtet und daher hier nur kurz beschrieben. Wie kürzlich in einer systematischen Literaturrecherche 14 hervorgehoben, erhalten MSC aus der Plazenta Chorionzotten sind fetale werden allgemein angenommen wird . Obwohl nur 18% der Studien untersuchten die Herkunft der MSC erhalten werden, und von denen nur die Hälfte der Studien berichtet fötalen MSC und die andere Hälfte berichtet mütterlichen oder gemischte Populationen MSC. Jede der drei Gewebe hier beschriebenen Komponenten (Chorionzotten, Chorionplatte und Decidua basalis) sind compin erster Linie aus der fetalen Membran / Zotten und einem geringen Anteil an uterine abgeleitetes mütterlichen Zellen osed, die der entbundenen Plazenta befestigt bleiben. Wir liefern Daten , die zeigen , dass MSC von der mütterlichen Seite der Plazenta zu isolieren, anstatt der fetalen Seite der Plazenta, wie wir zuvor 5,11 berichtet haben, ist ein geeigneter Ausgangsstoff , wenn mütterliche MSC erwünscht sind. Dieses Protokoll beschreibt auch die Verwendung von XY FISH fötalen oder maternalen Beitrag zur Zellkulturen zu validieren. Während dies ein Standardprotokoll des Herstellers ist, wird diese Analyse oft vernachlässigt und seine Bedeutung unterschätzt 14.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>Langer Name: Hanks Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Langer Name: Fötales Rinderserum</td></tr><tr><td>Trypsin-Ersatz</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>12563-029</td><td>Langer Name: TrypLE Select</td></tr><tr><td>DMEM-LG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11885-092</td><td>Langer Name: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-Low Glucose</td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Langer Name: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-High Glucose (4,5 g/L)</td></tr><tr><td>PBS (Mg+Ca+ frei)</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>Langer Name: Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, Magnesium- und Calciumfrei</td></tr> <tr><td>Anti-Anti-Gibco/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Langer Name: Antibiotisch-antimykotische Lösung x100</td><td></td></tr> <tr><td>Paraformaldehyd-Pulver oder 4%ige Lösung</td><td>beliebig&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase I</td><td>Invitrogen</td><td>17100-017&nbsp;</td><td>2.500 U/ml</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>10 mg/ml in&nbsp; 0,15 M NaCl</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041&nbsp;</td><td>10 mg/ml in Wasser (20.000 U/ml).</td></tr><tr><td>Material</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Einwegartikel:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon oder Petrischalen jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, steril praktisch (25 cm und 10 cm Durchmesser)</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellsiebe (100 &mu; m)</td><td>Becton Dickinson</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>175 und 75 cm2 (T175 und T75) Gewebekulturflaschen</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgische Pipetten</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Zentrifuge&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Gewebekultur-Inkubator 37 &DE; C, 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sterile Scheren und Pinzetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Röhrchengestelle&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenboy oder gleichwertige</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettierer vom Typ Gilson und sterile Spitzen 1.000 & Mikro; L, 200 &Mikro; l, 20 &micro;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schaukel- oder Schütte-Inkubator (37 &°; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reinigungslösungen für persönliche Schutzausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(geeignet für Blut)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abfallbehälter, geeignete Entsorgungsbehälter für Gewebe/Blut</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien für die MSC-Charakterisierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antikörper (Klon-ID)</td><td>Hersteller</td><td>Katalog-Nr.</td><td>Isotyp</td></tr><tr><td>CD73 (AD2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-183</td><td>Maus IgG1</td></tr><tr><td>CD105 (43A4E1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-941</td><td>Maus IgG1</td></tr><tr><td>CD90/THY-1 (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-403</td><td>Maus IgG1</td></tr><tr><td>CD45 (5B1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-202</td><td>Maus IgG2a</td></tr><tr><td>CD34 (AC136)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-954</td><td>Maus IgG2a</td></tr><tr><td>HLA-DR (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-298</td><td>Maus IgG2a</td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555446</td><td>Maus IgG1</td></tr><tr><td>CD146 (541-10B2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-849</td><td>Maus IgG1</td></tr><tr><td>CD44 (DB105)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-180</td><td>Maus IgG1</td></tr><tr><td>Isotyp-Steuerungen (Klon-ID)</td><td>Hersteller<</td><td>strong>Katalog-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG1 Isotyp (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-214</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG1 Isotyp (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-212</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG1 Isotyp (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG2a (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-837</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG2a (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-849</td><td></td></tr><tr><td>MACS Puffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Osteogene Differenzierung</td><td>Hersteller</td><td>Katalog-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Langer Name: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-High Glucose (4,5 g/L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Langer Name: Fötales Rinderserum</td></tr> <tr><td>Anti-Anti-Gibco/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Langer Name: Antibiotisch-antimykotische Lösung x100</td><td></td></tr> <tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerin Phophate</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure 2-phosphat</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Rot S</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>Für die Färbung von Calcium-Matrix</td></tr><tr><td><stark>Adipogene Differenzierung</td><td>Hersteller</strong<>strong</td><td>>Katalog-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Langer Name: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-High Glucose (4,5 g/L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Langer Name: Fötales Rinderserum</td></tr> <tr><td>Anti-Anti-Gibco/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Langer Name: Antibiotisch-antimykotische Lösung x100</td><td></td></tr> <tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methyl-xanthin</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Öl Rot O-Lösung</td><td>Sigma</td><td>O1391-250ML</td><td>Für die Färbung von Lipidvakuolen</td></tr><tr><td>XY FISH-Kit zur Bestimmung des fetalen oder mütterlichen Ursprungs von ZellenXY-Chomosom FISH-Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Vysis (Abbott Molecular)</td><td>07J20-050</td><td>Langer Name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direkt markiertes fluoreszierendes DNA-Sondenkit</td></tr></tbody></table>

isolierung und expansion von mesenchymalen stamm- / stroma-zellen aus humanen placenta gewebe gewonnen

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymale Stamm-/Stromazellen (MSC) sind vielversprechende Kandidaten für den Einsatz in zellbasierten Therapien. In den meisten Fällen scheint das therapeutische Ansprechen von der Zelldosis abhängig zu sein. Die menschliche Terminplazenta ist reich an MSC und ist ein physisch großes Gewebe, das in der Regel nach der Geburt verworfen wird. Plazenta ist ein ideales Ausgangsmaterial für die großtechnische Herstellung von mehreren Zelldosen allogener MSC. Die Plazenta ist ein fetomaternales Organ, von dem entweder fötales oder mütterliches Gewebe isoliert werden kann. Dieser Artikel beschreibt die Anatomie der Plazenta und das Verfahren zur Trennung des Gewebes der Dezidua (mütterlich), der Chorionzotten (fötal) und der Chorionplatte (fötal). Das Protokoll beschreibt dann, wie MSC aus jeder präparierten Geweberegion isoliert werden kann, und bietet eine repräsentative Analyse von expandiertem MSC, das aus den jeweiligen Gewebetypen gewonnen wurde. Diese Methoden sind für die präklinische MSC-Isolierung vorgesehen, wurden aber auch für die klinische Herstellung von plazentarer MSC für den therapeutischen Gebrauch beim Menschen angepasst.

Hier beschreiben wir Verfahren zur Präparation von fetalen und mütterlichen Geweben aus menschlichen Plazenta, gefolgt von der Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stromazellen (MSC) aus diesen Geweben.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mesenchymale stromale Stammzellen, die aus menschlichem Plazentagewebe stammen, zu isolieren und zu vermehren. Hallo, ich bin Mike Doran. Ich bin Gruppenleiter an der Queensland University of Technology am Translational Research Institute in Brisbane, Australien.Hallo, mein Name ist Rebecca Pelekanos und ich bin Forscherin am Zentrum für klinische Forschung der Universität von Queensland. Heute werde ich das Verfahren zur Isolierung von MSCs demonstrieren. Die Plazenta wird normalerweise nach der Geburt entsorgt.Da das Gewebe ein Gewicht von fünf bis 700 Gramm hat, stellt es eine einzigartig große Quelle allogener mesenchymaler Stammzellen dar. Personen, die neu in der Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus der Plazenta sind, haben in der Regel Schwierigkeiten, da sie mit der Anatomie der Plazenta, der Gewebeverarbeitung sowie damit, welche Zelltypen – mütterliche oder fetale – die endgültige mesenchymale Stammzellkultur besiedeln werden, nicht vertraut sind. Um Forschende zu unterstützen, erläutern wir diese wichtigen Details in diesem Video.Der erste Schritt bei diesem Verfahren besteht darin, sich mit der Anatomie der Plazenta vertraut zu machen. Der zweite Schritt besteht darin, manuell 10 Gramm Gewebe aus der Decidua, den Chorionzotten oder der Chorionplatte mit einer Schere zu isolieren. Die ersten beiden Schritte werden hier nochmals schematisch zusammengefasst.Im dritten Schritt werden die Decidua, die Chorionzotten oder das Chorionplatte-Gewebe mit einer Schere weiter in feine Stücke zerkleinert. Im vierten Schritt werden die Zellen durch eine ein- bis zweistündige Verdauung mit Dispase und Kollagenase I aus den kleinen Gewebestücken freigesetzt. Im fünften Schritt werden die Zellen durch Waschen durch ein Zellsieb von dem faserigen Gewebe getrennt. Anschließend werden die Zellen gesammelt, in Kulturmedium resuspendiert und in Kulturflaschen gegeben.Stromazellen des mesenchymalen Ursprungs, MSCs, werden basierend auf ihrer Neigung zur Anheftung an Kunststoffoberflächen sowie auf ihrer Fähigkeit zur Überlebensfähigkeit und Proliferation im Zellkulturmedium ausgewählt. Schließlich können die expandierten MSCs im Ergebnisabschnitt charakterisiert und für zukünftige Experimente eingelagert werden. Die Plazenta ist ein vorübergehendes Organ, das während der Schwangerschaft den Austausch von Nährstoffen und Abfallprodukten zwischen Fetus und Mutter ermöglicht.Die Plazenta kann nach einer Kaiserschnittentbindung und der sicheren Geburt des Babys leicht aseptisch gewonnen werden. Die Plazenta besteht hauptsächlich aus fetalen Blutgefäßen und Membranen. Sie enthält jedoch auch einige mütterliche Zellen.Die Plazenta ist über mütterliche, aus dem Uterus stammende Deziduazellen und fötale, eindringende Trophoblasten mit dem Uterus verbunden. Normalerweise ist es nicht möglich, die genaue Grenzfläche zwischen mütterlichem und fötalem Gewebe mit bloßem Auge zu erkennen. Die fötale Seite der Plazenta lässt sich jedoch leicht anhand der Seite identifizieren, an der die Nabelschnur sitzt.Nach der Geburt des Babys bleibt nur eine dünne Schicht des Deziduagewebes mit der Plazenta verbunden. Durch die physikalische Orientierung der Plazenta lässt sich feststellen, wo sich die drei Gewebe befinden, die wir heute entnehmen werden. Das erste zu entnehmende Gewebe ist die mütterliche Dezidua.Der grüne Marker zeigt auf das Deziduagewebe, das nach dem Abstoßen der Plazenta von der Uteruswand an der Oberfläche verbleibt. Das zweite Gewebe, das aus dem Inneren der Plazenta gewonnen wird, sind die fetalen Chorionzotten. Dies ist in den Diagrammen durch die blauen Kreise gekennzeichnet.Das dritte zu entnehmende Gewebe ist die fetale Chorionplatte. Dieses Gewebe wird in den Abbildungen durch rote Markierungen gekennzeichnet. Gut, beginnen wir.Platzieren Sie die Plazenta in dem biologischen Sicherheitswerkbank. Entfalten Sie die fötalen Membranen und orientieren Sie sich an den Bestandteilen der Plazenta. Die fötale Seite mit der Nabelschnureinsetzungsstelle, das Chorioamnion laeve oder der Amnionsack.Die fötale Fläche der Plazenta weist deutliche große Blutgefäße in der Chorionplatte auf, die von der überlagerten Fruchtblase bedeckt sind, die sich erneut leicht mechanisch abtrennen lässt. Die mütterliche Seite liegt der fötalen Seite gegenüber und zeigt die deutlich sichtbaren Kotylidonien oder Lappen. Stellen Sie sicher, dass die mütterliche Oberfläche nach oben zeigt.Schneiden Sie Stücke mit einer Dicke von 0,5 cm von der mütterlichen Seite der Plazenta oder des Deciduagewebe ab. Legen Sie die Gewebestücke während der Präparationen in eine Petrischale, die Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) enthält, um die Gewebe feucht zu halten. Schütteln Sie die Gewebe in den Schalen mit HBSS, um etwas Blut zu entfernen.Überführen Sie ausreichend Gewebe, um das Röhrchen bis zur 10-Milliliter-Marke eines 50-Milliliter-Röhrchens zu füllen, etwa 10 Gramm. Beachten Sie, dass in diesem Schritt mehr Gewebe gewonnen werden kann, wenn am Ende des Verfahrens mehr Zellen benötigt werden. Stellen Sie sicher, dass die fötale Oberfläche nach oben zeigt.Entfernen Sie die Amnionmembran mechanisch von der fötalen Oberfläche der Plazenta, wobei die Chorionplatte intakt bleibt. Schneiden Sie die Chorionplatte in Streifen, die etwa einen halben Zentimeter tief in das darunterliegende Villusgewebe reichen. Danach dissezieren Sie das Chorionvillusgewebe etwa einen Zentimeter tief in die Plazenta hinein von der Stelle, an der die Chorionplatte entfernt wurde.Legen Sie die Gewebestücke in HBSS und messen Sie etwa 10 Milliliter des Gewebes, wie zuvor durchgeführt. Überführen Sie die Gewebestücke mit minimalem Flüssigkeitsanteil in eine 10 cm große Petrischale und zerschneiden Sie sie mit einer Schere in feine Stücke von etwa einem Kubikmillimeter. Überführen Sie das zerkleinerte Gewebe zurück in das 50-ml-Röhrchen.Wiederholen Sie dies für alle verbleibenden Gewebeproben. Geben Sie das frisch zubereitete Digestionsmedium in einem Verhältnis von mindestens 1:1 zum Gewebe hinzu. Drehen Sie das Gefäß mehrmals um, um die Probe zu mischen.Die Gewebe im Reagenzglas mit dem Verdauungsmedium für ein bis zwei Stunden bei 37 Grad in einem schüttelnden Inkubator inkubieren. Wenn die Gewebeverdauungslösung trüb geworden ist und weiße Blutgefäße in der Lösung sichtbar sind, 15 Milliliter HBSS hinzufügen, um die Enzyme im Verdauungsmedium zu verdünnen. Die Proben kurz zentrifugieren, und zwar nur so lange, bis die Zentrifuge 340 g für fünf Sekunden erreicht hat, dann anhalten.Dadurch wird sichergestellt, dass sich die groben Rückstände am Boden des Rohrs absetzen. Bringen Sie die Proben zurück in den Sicherheitswerkbank. Stellen Sie ein Zellfilter in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.Pipettieren Sie das Überstand, der die mononukleären Zellen enthält, in den Sieb und fangen Sie das Eluat im neuen Röhrchen auf. Lassen Sie das Plazentagewebs-Debris im ersten Röhrchen zurück. Geben Sie 15 Milliliter HBSS zu dem Plazentadebris hinzu, schütteln Sie kräftig, um weitere Zellen zu gewinnen, und zentrifugieren Sie die Probe kurzzeitig. Pipettieren Sie erneut den Überstand in das Röhrchen mit dem Zellfilter im Sammelröhrchen. Je nach Konsistenz der Probe kann das Eingießen des Überstands in den Zellfilter geeigneter sein. Spülen Sie den Zellfilter mit 5 Milliliter HBSS aus.Entsorgen Sie das Röhrchen mit den Plazentageweberesten. Zentrifugieren Sie die Überstandprobe fünf Minuten bei 340 g, um die Zellen zu pelletieren. Die roten Blutkörperchen sind als Schicht am Boden des Pellets sichtbar, und die mononukleären Zellen, einschließlich der MSCs, bilden die hellere Schicht über den roten Blutkörperchen.Bringen Sie die Proben zurück in den Sicherheitswerkbank. Gießen Sie vorsichtig den Überstand ab und entsorgen Sie ihn. Schlagen Sie das Röhrchen mehrmals mit dem Finger an, um den Zellpellet zu lösen, und resuspendieren Sie den Zellpellet in 35 Milliliter MSC-Medium. Überführen Sie die Zellsuspension in einen T175-Flasche pro 10 ml Gewebe und kultivieren Sie im Brutschrank bei 37 Grad mit 5 % CO2. Wechseln Sie das Kulturmedium 48 Stunden nach der Isolierung. Versorgen Sie die Kulturen wöchentlich mit frischem Medium, bis sie konfluent sind.Die Kulturen sollten nach etwa 14 Tagen konfluent sein. Abschließend expandieren und kryokonservieren Sie die Zellen, analysieren die MSC-Charakteristika und verwenden Sie in Experimenten. Nach 48 Stunden Kultivierung haben sich die MSCs an den Gewebekulturkunststoff angeheftet, während hämatopoetische und andere Zellpopulationen dies nicht getan haben.Zu diesem Zeitpunkt wird das Medium durch 35 Milliliter frisches Kulturmedium ersetzt. Das Erscheinungsbild des Kulturüberstands kann zwischen verschiedenen Plazentaspendern erheblich variieren. Beispiel eins und zwei verdeutlichen diese Unterschiede.Diese beiden Isolationen wurden gleichzeitig, jedoch aus zwei verschiedenen Plazenten durchgeführt. Nach dem Waschen sind die Kulturen, wie in Beispiel drei gezeigt, frei von roten Blutkörperchen und Gewebeabfällen, und die anschließende Expansion verläuft im Allgemeinen konsistent. Nach dem Mediumwechsel nach 48 Stunden sind nur wenige Zellen am Kolben angeheftet.Sieben Tage nach der Isolierung sind faserbl&auml;sige MSC-Kolonien sichtbar, obwohl auch Nicht-MSC-Zellen vorhanden sind, die als runde oder locker angeheftete Zellen erscheinen. Dreizehn Tage nach der Isolierung sind die faserbl&auml;sigen MSC-Kolonien gro&szlig; und h&auml;ufig ist die MSC-Einschicht ausreichend konfluent und bereit f&uuml;r die Passage. Ab der ersten Passage entwickelt die MSC-Einschicht bei Konfluenz eine charakteristische wirbelartige Morphologie.Die mesenchymalen Stromazellen der Plazenta weisen mittels Durchflusszytometrie-Analyse ein klassisches Markerprofil für mesenchymale Stromazellen auf. Die Zellen sind positiv für CD73, CD105 und CD90 sowie negativ für die hämatopoetischen Marker CD45, CD34 und HLA-DR. Die mesenchymalen Stromazellen der Plazenta zeigen im Allgemeinen eine starke osteogene Differenzierung, jedoch eine schwache adipogene Differenzierung.Viele Veröffentlichungen gehen davon aus, dass aus der fetalen Chorionhaut isolierte Zellen bei der Kultivierung fetale MSC liefern. Wie wir jedoch bereits früher berichtet haben, reichern sich in allen Kulturen, die aus fetalem Chorion mit diesem Protokoll gewonnen wurden, schnell mütterliche MSC an, was für mütterliche deziduale MSC-Kulturen zu erwarten ist. Die hier gezeigten Daten quantifizieren die fetale und mütterliche Zellzusammensetzung der aus dezidualem Gewebe, Chorionzotten und Chorionplatten isolierten plazentaren MSC-Kulturen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine ziemlich gute Vorstellung davon haben, wie man aus Plazentagewebe stammende MSCs isoliert und kultiviert. Wir hoffen, dass Sie diese Methoden für Ihre Forschungs- und klinischen Anwendungen, die möglicherweise plazentabasierte MSCs verwenden, als nützlich erachten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir haben die Plazenta als wichtiger blutbildenden Organ während der Entwicklung identifiziert. Wir fanden, dass hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind beide generiert und erweitert in der Plazenta in einzigartige Mikroumgebung Nischen. Hier beschreiben wir experimentelle Techniken zur Isolierung und Visualisierung von HSZ in der Maus Plazenta erforderlich.

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) haben ein Differenzierungspotenzial in Richtung osteoblastischer Linie, wenn sie mit löslichen Faktoren oder spezifischen Biomaterialien stimuliert werden. Diese Arbeit stellt eine neuartige Option für die Verabreichung von MSCs aus der humanen Amnionmembran (AM-hMSCs) vor, die die bovine Knochenmatrix Nukbone (NKB) als Gerüst verwendet.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

Hier stellen wir ein Protokoll für die Präparation der menschlichen Nabelschnur (UC) und fetaler placenta Probe in Kord Belages (CL), Wharton-Sulze (WJ), Cord-Plazenta-Übergang (CPJ) und fetale Plazenta (FP) für die Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs), um die Explantation Kultur-Technik.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

Menschlichen Nabelschnur (UC) erhalten Sie während der Perinatalperiode durch Frühgeburt, Begriff und postterm Lieferung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und Charakterisierung von UC-mesenchymale Stammzellen (UC-MSCs) von Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.

Isolierung und Charakterisierung der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus Frühgeborenen und Kleinkindern Begriff

Dieses Protokoll bietet eine enzymfreie Methode zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus abdominoplastischen und lipoaspiratischen Proben mit einer Explant-Methode. Das Fehlen harter Enzyme oder Zentrifugationsschritte sieht klinisch relevante Stammzellen vor, die für Studien in vitro verwendet oder in die Klinik zurückgebracht werden können.

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

Das Fettgewebe ist eine ausgezeichnete Quelle für mesenchymale Stammzellen. Hier bringen wir die Schritt-für-Schritt-Extraktion, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe von Schweizer Mäusen an.

Isolierung, In-vitro-Expansion und Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen aus epididymalem Fettgewebe der Maus

Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht zwei repräsentative Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in mesenchymale Stromazellen (MSCs). Die Monolayer-Methode zeichnet sich durch geringere Kosten, einfachere Bedienung und leichtere osteogene Differenzierung aus. Die Methode der Embryoidkörper (EBs) zeichnet sich durch einen geringeren Zeitaufwand aus.

Vergleich zweier repräsentativer Methoden zur Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in mesenchymale Stromazellen

Die Isolierung von BAMBI-hohenMFGE8-hohen MSCs, einer der drei Hauptuntergruppen der heterogenen humanen UC-MSCs, ist hilfreich, um die Eigenschaften und Funktionen dieses Subtyps für seine zukünftige Anwendung zur Verbesserung der klinischen Wirksamkeit bei bestimmten Erkrankungen vollständig zu verstehen. Hier stellen wir eine Methode zur Sortierung von BAMBIhochMFGE8hoch UC-MSCs vor.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stromazellen mitBAMBI-Gehalt anhohemMFGE8-Nabelschnurgehalt

Die transkriptionelle Heterogenität innerhalb menschlicher Fettgewebe-abgeleiteter Stromazellen kann auf Einzelzellebene mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und osteogenen Genen definiert werden.  Wir beschreiben ein Protokoll, das die Durchflusszytometrie zur Isolierung von Zellsubpopulationen mit erhöhtem osteogenem Potenzial verwendet, das zur Verbesserung der kraniofazialen Skelettrekonstruktion verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Lernen Sie die Isolierung und Expansion mesenchymaler Stammzellen aus humanem Plazentagewebe. Diese Methode nutzt manuelle Dissektion und enzymatische Verdauung für zuverlässige Zellkulturen.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

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