Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mesenchymale Stammstromazellen, die aus menschlichem Plazentagewebe gewonnen werden, zu isolieren und zu erweitern. Hallo, ich bin Mike Doran. Ich bin Gruppenleiter an der Queensland University of Technology am Translational Research Institute in Brisbane, Australien.

Hallo, mein Name ist Rebecca Pelekanos und ich bin Forscherin am Center for Clinical Research der University of Queensland. Heute werde ich das MSC-Isolationsverfahren demonstrieren. Die Plazenta wird normalerweise nach der Geburt entsorgt.

Da das Gewebe fünf bis 700 Gramm wiegt, bietet es eine einzigartig große Quelle für allogene mesenchymale Stammzellen. Im Allgemeinen werden Menschen, die neu in der Plazenta-MSC-Isolierung sind, Schwierigkeiten haben, weil sie mit der Plazenta-Anatomie und der Verarbeitung des Gewebes nicht vertraut sind und nicht wissen, welche Art von Zellen, mütterlich oder fötal, ihre endgültige MSC-Kultur besiedeln werden. Um Forschern eine Hilfestellung zu geben, besprechen wir diese wichtigen Details in diesem Video.

Der erste Schritt bei diesem Verfahren besteht darin, sich an der Anatomie der Plazenta zu orientieren. Der zweite Schritt bei diesem Verfahren besteht darin, mit einer Schere manuell 10 Gramm Gewebe entweder von der Decidua, den Chorionzotten oder der Chorionplatte zu präparieren. Die ersten beiden Schritte werden hier noch einmal schematisch zusammengefasst.

Im dritten Schritt werden die Decidua, die Chorionzotten oder die Chorionplattengewebe mit einer Schere weiter in feine Stücke zerkleinert. In Schritt vier werden die Zellen über einen ein- bis zweistündigen Verdau in Dispase und Kollagenase von den kleinen Gewebestücken befreit I.In Schritt fünf werden die Zellen durch Waschen durch ein Zellsieb vom fibrösen Gewebe getrennt. Die Zellen werden dann gesammelt, in Kulturmedium resuspendiert und in Kulturflaschen gegeben.

Mesenchymale Stromazellen, MSCs, werden auf der Grundlage ihrer Neigung zur plastischen Adhärenz und ihrer Fähigkeit, im Zellkulturmedium zu überleben und zu proliferieren, ausgewählt. Schließlich kann der erweiterte MSC im Abschnitt "Ergebnisse" charakterisiert und für die Verwendung in zukünftigen Experimenten gespeichert werden. Die Plazenta ist ein temporäres Organ, das den Austausch von Nährstoffen und Abfallprodukten zwischen dem Fötus und der Mutter während der Schwangerschaft ermöglicht.

Die Plazenta kann nach dem Kaiserschnitt und der sicheren Entbindung des Babys leicht aseptisch entnommen werden. Die Plazenta besteht überwiegend aus Gefäßen und Membranen, die vom Fötus stammen. Es enthält jedoch auch einige mütterliche Zellen.

Die Plazenta ist sowohl durch mütterliche, aus der Gebärmutter stammende Dezidualzellen als auch durch vom Fötus stammende, eindringende Trophoblasten mit der Gebärmutter verbunden. Es ist in der Regel nicht möglich, mit dem Auge die genaue Grenzfläche zwischen mütterlichem und fötalem Gewebe zu erkennen. Die fötale Seite der Plazenta ist jedoch leicht als die Seite zu identifizieren, auf der sich die Nabelschnur befindet.

Bei der Geburt des Babys bleibt nur eine dünne Schicht Dezidualgewebe mit der Plazenta verbunden. Durch die physische Ausrichtung der Plazenta ist es möglich, die drei Gewebe zu lokalisieren, die wir heute entnehmen werden. Das erste Gewebe, das entnommen wird, ist maternale Decidua.

Der grüne Marker zeigt auf das Dezidualgewebe, das auf der Oberfläche verbleibt, nachdem die Plazenta von der Gebärmutterwand abgestoßen wurde. Das zweite Gewebe, das aus dem Inneren der Plazenta entnommen wird, sind die fetalen Chorionzotten. Dies wird durch die blauen Kreise in den Diagrammen angezeigt.

Das dritte Gewebe, das entnommen wird, ist die fötale Chorionplatte. Dieses Gewebe ist an den roten Markern in den Diagrammen zu erkennen. Okay, fangen wir an.

Legen Sie die Plazenta in die biologische Sicherheitswerkbank. Öffnen Sie die fetalen Membranen und orientieren Sie sich an den Teilen der Plazenta. Die fötale Seite mit dem Nabelschnuransatz, der Chorioamnionliege oder Fruchtblase.

Die fötale Oberfläche der Plazenta weist offensichtlich große Blutgefäße in der Chorionplatte auf, mit darüber liegender Amnionmembran, die wiederum leicht mechanisch getrennt werden kann. Die mütterliche Seite ist der fetalen Seite gegenübergesetzt, mit den offensichtlichen Keimblättern oder Lappen. Stellen Sie sicher, dass die mütterliche Oberfläche nach oben zeigt.

Schneiden Sie 0,5 cm dicke Stücke von der mütterlichen Seite der Plazenta oder Dezidua ab. Legen Sie während der Dissektionen Taschentuchstücke in eine Petrischale, die Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) enthält, um das Gewebe feucht zu halten. Rühren Sie das Gewebe in den Schalen mit HBSS auf, um etwas Blut zu entfernen.

Übertragen Sie ausreichend Gewebe, um das Röhrchen bis zur 10-Milliliter-Markierung eines 50-Milliliter-Röhrchens zu füllen, etwa 10 Gramm. Beachten Sie, dass in diesem Stadium mehr Gewebe isoliert werden kann, wenn am Ende des Eingriffs mehr Zellen benötigt werden. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Fötus nach oben zeigt.

Entfernen Sie mechanisch die Amnionmembran von der fötalen Oberfläche der Plazenta, wobei die Chorionplatte intakt bleibt. Schneiden Sie die Chorionplatte in etwa einen halben Zentimeter tiefe Streifen in das darunter liegende Zottengewebe. Präparieren Sie dann Chorionzottengewebe etwa einen Zentimeter tief in die Plazenta, aus der die Chorionplatte entnommen wurde.

Legen Sie das Gewebe in das HBSS und messen Sie etwa 10 Milliliter des Gewebes, wie es zuvor gemacht wurde. Übertragen Sie Taschentücher mit minimalem Flüssigkeitstransfer in eine 10 Zentimeter große Petrischale und hacken Sie sie mit einer Schere in feine Stücke von etwa einem Kubikmillimeter. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe zurück in das 50-mil-Röhrchen.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle verbleibenden Gewebeproben. Geben Sie das frisch zubereitete Verdauungsmedium mindestens im Verhältnis eins zu eins mit dem Gewebe hinzu. Drehen Sie das Rohr zum Mischen mehrmals um.

Inkubieren Sie das Gewebe im Röhrchen mit Verdauungsmedium für ein bis zwei Stunden bei 37 Grad in einem Schüttelinkubator. Wenn sich die Gewebeverdaulösung in ein trübes Aussehen verwandelt hat und weiße Blutgefäße in Lösung sichtbar waren, fügen Sie 15 Milliliter HBSS hinzu, um die Enzyme im Verdaumedium zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die Proben nur kurz pulsierend, bis die Zentrifuge fünf Sekunden lang 340 g erreicht, und stoppen Sie dann.

Dadurch werden die großen Ablagerungen gezwungen, sich am Boden des Rohrs zu sammeln. Geben Sie die Proben an die biologische Sicherheitswerkbank zurück. Geben Sie ein Zellsieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.

Pipettieren Sie den Überstand mit den mononukleären Zellen in das Sieb und fangen Sie das Eluat in dem neuen Röhrchen auf. Lassen Sie die Ablagerungen des Plazentagewebes in der ersten Röhre zurück. Geben Sie 15 Milliliter HBSS zu den Plazenta-Trümmern, schütteln Sie kräftig, um mehr Zellen zu gewinnen, und zentrifugieren Sie die Probe.

Pipettieren Sie den Überstand erneut in das Röhrchen, wobei sich das Zellsieb im Sammelröhrchen befindet. Das Eingießen des Überstands in das Zellsieb kann je nach Konsistenz der Probe besser geeignet sein. Waschen Sie das Zellsieb mit 5 Millilitern HBSS.

Entsorgen Sie den Schlauch mit den Geweberesten der Plazenta. Die überstehende Probe wird fünf Minuten lang bei 340 g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die roten Blutkörperchen sind als Schicht am unteren Rand des Pellets sichtbar, und die mononukleären Zellen, einschließlich der MSCs, sind die hellere Schicht auf den roten Blutkörperchen.

Geben Sie die Proben an die biologische Sicherheitswerkbank zurück. Den Überstand vorsichtig dekantieren und entsorgen. Schnippen Sie mehrmals mit einem Finger mit dem Röhrchen, um das Zellpellet zu lösen, und resuspendieren Sie das Zellpellet in 35 Millilitern MSC-Medium.

Übertragen Sie die Zellsuspension in einen T175-Kolben pro 10 mil Gewebe und kultivieren Sie sie in einem 37-Grad-Inkubator mit 5 % CO2. Wechseln Sie nach der Isolierung den Nährboden nach 48 Stunden. Füttern Sie die Kulturen einmal pro Woche, bis sie zusammenfließen.

Die Kulturen sollten nach etwa 14 Tagen zusammenfließen. Schließlich können Zellen expandiert und kryokonserviert werden, MSC-Eigenschaften analysiert und in Experimenten verwendet werden. Nach 48-stündiger Kultivierung hat sich MSC an den Kunststoff der Gewebekultur anheftet, während dies bei hämatopoetischen und anderen Zellpopulationen nicht der Fall ist.

Zu diesem Zeitpunkt wird das Medium durch 35 Milliliter frisches Nährmedium ersetzt. Das Erscheinungsbild des Kulturüberstands kann zwischen den Plazentaspendern erheblich variieren. Beispiel eins und zwei veranschaulichen diese Variation.

Diese beiden Isolationen wurden gleichzeitig durchgeführt, jedoch von zwei verschiedenen Plazenten. Nach dem Waschen sind die Kulturen frei von roten Blutkörperchen und Geweberesten, wie in Beispiel drei gezeigt, und die nachfolgenden Expansionsergebnisse sind im Allgemeinen konsistent. Nach dem 48-stündigen Medienwechsel sind nur noch wenige Zellen an den Kolben angeschlossen.

Sieben Tage nach der Isolierung sind fibroblastische MSC-Kolonien sichtbar, obwohl auch Nicht-MSC-Zellen als runde oder lose angehängte Zellen vorhanden sind. 13 Tage nach der Isolierung sind die fibroblastischen MSC-Kolonien groß, und oft ist die Monoschicht der MSC ausreichend konfluent und bereit für die Passage. Von der Passage bis zum Verlauf entwickelt die MSC-Monoschicht am Zusammenfluss eine charakteristische strudelartige Morphologie.

Die plazentaren MSC zeigen durch die durchflusszytometrische Analyse ein klassisches MSC-Markerprofil. Die Zellen sind positiv für CD73, CD105 und CD90 und negativ für die hämatopoetischen Marker CD45, CD34 und HLA-DR. Die plazentare MSC weist im Allgemeinen eine robuste osteogene Differenzierung, aber eine schlechte adipogene Differenzierung auf.

Viele Publikationen gehen davon aus, dass Zellen, die aus dem fetalen Chorion isoliert wurden, nach Kultur fetale MSC liefern. Wie wir jedoch bereits berichtet haben, werden alle Kulturen, die unter Verwendung dieses Protokolls aus fötalem Chorion gewonnen werden, schnell für maternale MSC angereichert, wie es für die mütterlichen dezidualen MSC-Kulturen zu erwarten wäre. Die hier gezeigten Daten quantifizieren die fetale und maternale Zellzusammensetzung der plazentaren MSC-Kulturen, die aus Dezidual-, Chorionzotten- und Chorionplattengeweben isoliert wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine ziemlich gute Vorstellung davon haben, wie MSC aus Plazentagewebe isoliert und kultiviert werden kann. Wir hoffen, dass Sie diese Methoden für Ihre Forschung und klinische Anwendungen, bei denen plazentare MSCs verwendet werden könnten, nützlich finden.