Femur Fensterkammer Modell für

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Langzeit-Mikroskopie und Verfolgung von Neutrophilen in vaskulären Strukturen innerhalb des murinen Knochenmarks durch eine implantierte chronische Fensterkammer über dem Femur durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Immunologie und Onkologie bezüglich der Rolle von Monozyten bei der Regulation einer Infektion, der Tumorentstehung und der Tumormetastasierung zu beantworten. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass sie einen langfristigen mikroskopischen Zugang zum femoralen Knochenmark, einem zentralen Ort der Hämatopoese, ermöglicht und dynamische Informationen liefert, die mit herkömmlichen Methoden nur schwer zu erhalten sind.

Obwohl diese Methode spezifisch für die Bildgebung von Neutrophilen innerhalb eines vaskulären Netzwerks ist, kann sie ebenfalls zur Visualisierung anderer gewünschter Immunzellpopulationen verwendet werden. Am Tag der Operation bestätigen Sie den angemessenen Sedierungszustand durch das Fehlen einer Reaktion auf einen Zehenquetschtest eines athymischen Nacktmauses. Anschließend platzieren Sie die Maus auf einer elektrischen Heizplatte, bedeckt mit einem chirurgischen Tuch, unter einem Stereomikroskop.

Als Nächstes Salbe auf die Augen des Tieres auftragen und den Operationsbereich durch zwei aufeinanderfolgende Abreibungen mit 7,5 % Povidon-Jod, 70 % Isopropylalkohol und 10 % Povidon-Jod sterilisieren. Sobald das Tier vorbereitet ist, mit einem Skalpell mit Klinge Nr. 15 einen 10 Millimeter langen longitudinalen Hautschnitt vornehmen, wobei man von der lateralen Seite zum Femur hin vorgeht. Anschließend mit Pinzette und Hämostaseklemme stumpf dissezieren, um den Femur zwischen den Flexor- und Extensormuskeln freizulegen.

Wenn der Femur sichtbar ist, bringen Sie eine U-förmige Stange unter dem Knochen an und installieren Sie die Fensterkammer. Befestigen Sie die Stange mit zwei Muttern am Fenster. Anschließend ziehen Sie die Muttern mit einer Pinzette fest.

Verwenden Sie die Pinzette, um die Muskulatur der Flexoren und Extensoren wieder in ihre ursprüngliche Position zu bringen. Füllen Sie den Raum zwischen dem Knochen und der Fensterkammer mit Zahnzement, um die Fensterkammer zu fixieren. Anschließend verwenden Sie einen Mikrobohrer, um einen Bereich von sechs mal zwei Millimetern in den kortikalen Knochen abzutragen, um optischen Zugang zur Markhöhle zu erhalten.

Wenn eine nahezu durchsichtige periostale Schicht des Knochens erhalten wurde, setzen Sie ein acht Millimeter großes Deckglas auf das Fenster und sichern Sie es mit einem Haltering. Nun verschließen Sie die Dermis mit einer 5-0-Naht und einer Nadelhalterzange. Anschließend stellen Sie die Maus in einen neuen Käfig mit sauberer Einstreu und überwachen sie, bis sie sich vollständig erholt hat.

Um kombinierte Bilder der Multiphoton- und Konfokalmikroskopie durch die Fensterkammer zu erhalten, spritzen Sie zunächst die geeigneten fluoreszierenden Lösungen zur Markierung der Gefäße und Neutrophilen in die Schwanzvene der Maus. Befestigen Sie die Maus durch Anklipsen der Enden der Fensterkammer mit Krokodilklemmen an einer speziell angefertigten Halterung. Anschließend stellen Sie die Bildgebungsplattform auf das kombinierte Multiphoton- und Konfokalmikroskop.

Wenn die Maus sicher fixiert ist, schalten Sie den Zwei-Photonen-Laser und das konfokale System ein und klicken Sie auf „System starten“, um die Bildaufnahmesoftware zu starten. Um die Bildgebungskanäle einzurichten, klicken Sie im Reiter „Aufnahme“ auf „Schnelleinrichtung“ und wählen die Laser für die Bildaufnahme aus. Wählen Sie „Bestes Signal“ und klicken Sie auf „Übernehmen“.

Fügen Sie den Kanal für die Bildaufnahme der zweiten Harmonischen Erzeugung manuell hinzu, indem Sie im Laser-Fenster den Zweiphotonenlaser einschalten und die geeigneten Aufnahmewellenlängen für die zweite Harmonische Erzeugung einstellen. Wechseln Sie zur Registerkarte „Locate“, klicken Sie auf „Oculars online“ und suchen Sie den interessierenden Bereich am Mikroskop durch visuelle Inspektion. Klicken Sie anschließend auf „Oculars offline“ und öffnen Sie die Registerkarte „Acquisition“.

Wählen Sie im Fenster „Channels“ die FITC-Spur aus, und klicken Sie auf „Live“, um das FITC-Dextran-Bild mit einem 5x-Objektiv vorab anzuzeigen. Passen Sie bei Bedarf die Fokussierung an. Klicken Sie anschließend im Reiter „Acquisition“ auf „Stop“, um die Vorschau zu beenden.

Wählen Sie nun manuell das 20x-Wasserobjektiv aus und betrachten Sie das FITC-Dextran-Bild erneut. Passen Sie dabei den Master Gain und den Pinhole im Fenster „Channels“ an, um das beste Signal und den besten Kontrast zu erzielen. Sobald ein optimales Bild für alle drei Kanäle erreicht wurde, wählen Sie alle Kanäle im Fenster „Channels“ aus und klicken Sie auf „Snap“ im Reiter „Acquisition“, um eine 2D-Aufnahme zu erstellen. Um anschließend eine 2D-Zeitrafferaufnahme zu erstellen, wählen Sie „Time Series“, um das Fenster „Time Series“ zu öffnen, und geben Sie null für die Intervalle und 40 für die Gesamtanzahl der Scans ein, um kontinuierlich 40 Bilder ohne Zeitintervall aufzunehmen.

Um die Bilder zu analysieren, öffnen Sie die geeignete Bildanalyse-Software und eine Bilddatei. Um Objektspuren anhand der Zeitrafferbilder zu erstellen, öffnen Sie in der Surpass-Ansicht das zu analysierende Bild und klicken Sie auf das Symbol mit dem Bild orangefarbener Punkte, um das neue Fenster „Spots“ zu öffnen. Nachdem Sie die Verfolgungsparameter festgelegt haben, aktivieren Sie das Kontrollkästchen „Lücken mit allen erkannten Objekten füllen“, um die Spurverfolgung zu starten.

Und klicken Sie auf den blauen Pfeil, um zum nächsten Schritt zu gelangen. Wählen Sie unter „Filtertyp“ den Filter „Aufspürdauer“ aus und klicken Sie auf den grünen Pfeil, um die Verfolgung abzuschließen. Überprüfen Sie anschließend die erzeugten Spuren und kehren Sie bei Bedarf zum vorherigen Schritt zurück.

Um die zelluläre Bewegung zu messen, definiert durch die Objektspuren in den Zeitrafferaufnahmen, wählen Sie im Fenster „Edit Tracks“ das Feld „Tracks“ und anschließend eine Spur aus, die der Bewegung der Zelle von Interesse entspricht. Die ausgewählte Spur wird in der Zeitreihenaufnahme gelb hervorgehoben. Klicken Sie abschließend im Reiter „Statistics“ auf das Symbol mit dem Grafikbild, um das Statistikfenster zu öffnen.

Danach klicken Sie unter „Auswahl“ auf den nach unten zeigenden Pfeil, um die mittlere Bahn-Geschwindigkeit zu erzeugen. Die Gefäße im Knochenmark können mithilfe intravasaler Farbstoffe, wie FITC-Dextran, sichtbar gemacht werden. Da der Kontrast von der Injektion des Farbstoffs abhängt, stellt das aufgezeichnete Bild die funktionelle Gefäßversorgung dar, wo ein ausreichender Blutfluss vorhanden ist.

Diese Aufnahmen desselben Bereichs des Knochenmarks zu verschiedenen Zeitpunkten zeigen die Anwesenheit von Neutrophilen sowohl in intravasculären als auch in extravasculären Bereichen über einen Zeitraum von mehreren Tagen. Die Bildgebung dieses kortikalen Knochens, der hauptsächlich aus Kollagenfasern besteht, erfolgte mittels zweiter harmonischer Generation und verdeutlicht zusätzlich die Infiltration des vaskulären Gewebes durch Neutrophile. Diese Neutrophilen wurden im vaskulären Nischenbereich des Knochenmarks kontinuierlich verfolgt, ohne zusätzliche zeitliche Intervalle zwischen den einzelnen Scans, wodurch eine präzise Nachverfolgung ihrer Bewegung ermöglicht wurde.

Die Geschwindigkeit der von der Bildanalyse-Software erzeugten Spuren kann anschließend gemessen werden, um die Bewegungsgeschwindigkeit jeder einzelnen Zelle zu analysieren. Mit dieser Methode können weitere Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung von ex vivo markierten Zellen oder transgenen Reportermäusen, angewendet werden, um andere biologische Prozesse in situ zu untersuchen, etwa den Einfluss von Immunzellen auf Tumorprogression und Metastasierung. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Fensterkammer am femoralen Knochen von Mäusen implantieren kann, um Neutrophile innerhalb des vaskulären Knochenmarknischen und der Kollagenstrukturen zu verfolgen.