Name: Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch Coxiella burnetii Während siRNA Silencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Lernen Sie die Untersuchung bakterieller Effektor-Translokation durch Coxiella burnetii mittels siRNA-Silencing und FRET-basierter Reporter-Assays. Diese Methode liefert Einblicke in Wirt-Pathogen-Interaktionen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Health and Medical Research Council (NHMRC) (Grant ID 1062383 und 1063646) unterstützt, die an HJN vergeben wurden. EAL wird durch einen Australian Postgraduate Award unterstützt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Sekret-Systeme sowie der bakteriellen Effektor-Proteine ​​diese Systeme Transport in das Zytoplasma der Wirtszellen, sind eine wichtige Komponente, die Virulenz viele pathogene Bakterien verwenden, um eine Infektion innerhalb von einzigartigen replikativen Nischen zu etablieren. Im Mittelpunkt vieler Forschungsgruppen wurde das Zusammenspiel zwischen bakteriellen Effektoren und Wirtsproteinen und dem Einfluss diese Effektoren auf Host zellulären Wege haben zu untersuchen. Sehr begrenzte Forschung, wenn überhaupt, hat da...

Coxiella burnetii ist ein einzigartiges intrazelluläre Erreger der zoonotischen Infektionen beim Menschen Q - Fieber verursacht. Diese Krankheit wird mit einem breiten Spektrum von klinischen Präsentationen im Zusammenhang von asymptomatischen Serokonversion zu lebensbedrohlichen chronischen Infektion erstreckt , die als Endokarditis Jahre nach der Exposition 1 oft manifestiert. Die Infektion des Menschen erfolgt in erster Linie durch das Einatmen von kontaminierten Aerosolen mit Wiederkäuern der großen Reservoir für Infektionen, insbesondere Milchkühe, Schafe und Ziegen. Obwohl Coxiella Infektion bei diesen Tieren der Regel subklinischen ist, kann die Infektion Abtreibung auslösen und die erhebliche bakterielle Belastung innerhalb der Entbindungs ​​Flüssigkeit und Plazenta kann die lokale Umgebung 1 verunreinigen. Ein Beispiel für die enorme Belastung eine solche Kontamination kann sowohl auf die öffentliche Gesundheit haben und die Agrarindustrie vor kurzem in der Q - Fieber - Ausbruch beobachtet wurde , die in den Niederlanden 2 aufgetreten ist . Zwischen 2007 und2010 mehr als 4.000 menschliche Fälle von Q - Fieber diagnostiziert wurden und dieser Ausbruch zu erheblichen Kontamination von Ziegenbetriebe 3 wurde verknüpft. Darüber hinaus ist Coxiella eine potenzielle biologische Waffe, wie für Disease Control von den US Centers klassifiziert und Prävention, durch die Umweltstabilität der Bakterien und geringe Infektionsdosis erforderlich schwere Morbidität und Mortalität 4 zu verursachen. Coxiella existiert in zwei Phasen: Phase I Organismen, isoliert aus natürlichen Quellen, sind extrem virulent und Phase - II - Organismen in vivo stark gedämpft. Beispielsweise nach mehreren in vitro Passagen Coxiella burnetii Nine Mile Phase I Organismen, Phase II Bakterien produziert wurden , die eine irreversible chromosomale Deletion in abgeschnittene Lipopolysaccharid (LPS) enthalten 5. Dieser Stamm, C. burnetii NMII ist phänotypisch ähnlich ich in Gewebekulturmodellen zu Phase und bietet einen sichereren Modusl für Forscher Coxiella Pathogenese in Laboratorien zu untersuchen 5. In den letzten Jahren haben mehrere Durchbrüche auf dem Gebiet der Genetik Coxiella rasch vorangetrieben . Vor allem die Entwicklung von axenic Medien (Citrat Cystein Medium angesäuert - ACCM-2) hat die zellfreie Wachstum von Coxiella sowohl in flüssiger und auf festen Medien 6,7 erlaubt. Dies führte zu direkten Verbesserungen der genetischen Werkzeuge zur Verfügung , für Coxiella einschließlich eines induzierbaren Genexpressionssystem, Shuttle - Vektoren und zufällige Transposon - Systeme 11.08. In jüngster Zeit werden zwei Verfahren zur gezielten Geninaktivierung sind ebenfalls entwickelt worden, die den Weg für 12 spezifische Virulenzgen Kandidaten untersucht. Folgende Internalisierung durch Alveolarmakrophagen, repliziert Coxiella zu hohen Zahlen innerhalb eines membrangebundenen Kompartiment bezeichnet die Coxiella- enthält Vakuole (CCV). Der CCV erfordert Host endocytic Handel thrau frühen und späten Endosomen , bis es reift in ein Lysosom abgeleiteten Organell 13. Im Laufe dieses Prozesses erwirbt der CCV Wirtsfaktoren , die entweder vorübergehend erscheinen oder bleiben mit der Vakuole verbunden sind , einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Rab5, Rab7, CD63 und LAMP-1 . 13-15 Die Replikation von Coxiella innerhalb von Wirtszellen ist völlig abhängig von einem voll funktionsfähigen Dot / Icm Typ IVB - Sekretionssystem (T4SS) 8,16,17. Dieses Sekretionssystem ist ein Multi-Proteinstruktur ancestrally Konjugation Systemen und erstreckt sich über sowohl bakterielle als auch vacuolar Membranen bakterielle Proteine ​​zu liefern, bezeichnet als Effektoren in das Wirts Zytoplasma 18. Die Coxiella T4SS funktionell sehr ähnlich dem gut charakterisierten Typ IVB Dot / Icm Sekretionssystem von Legionellen pneumophila 19,20. Interessanterweise Aktivierung des T4SS und nachfolgende Translokation Effektor nicht auftritt , bis die saure Coxiella Lysosom-derived erreichtOrganell, etwa 8 Stunden nach der Infektion 17,21. Bis heute sind über 130 Dot / Icm Effektoren wurden 9,17,22-24 identifiziert. Viele dieser Effektoren spielen wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Replikation von Coxiella in Wirtszellen; jedoch nur wenige Effektoren wurden funktionell 25-29 charakterisiert. In dieser Studie nutzen wir eine fluoreszenzbasierten Translokation Assay, der auf der Spaltung des (bezeichnet im Folgenden als BlaM Substrat) CCF2-AM FRET Substrat stützt über β-Lactamase - Aktivität in der Wirtszelle Zytoplasma (Abbildung 1). Das Gen von Interesse fusioniert an TEM-1-β-Lactamase (BlaM) auf einem Reporterplasmid, das eine konstitutive Expression sorgt. Das BlaM Substrat besteht aus zwei Fluorophore (Cumarin und Fluorescein), die ein FRET-Paar bilden. Anregung der Cumarin Ergebnisse in FRET des Fluorescein und grüne Fluoreszenzemission in Abwesenheit von Effektorzellen Translokation; Wenn jedoch die BlaM-Effektor-Fusionsprotein wird in das Wirts Zytoplasma transloziert, die sich ergebende β-Lactamase-Aktivität spaltet die β-Lactam-Ring des BlaM Substrat, wobei das FRET-Paar produzieren blaue Fluoreszenzemission nach Anregung zu trennen. Diese Translokation Assay wurde als ein Ansatz zur Identifizierung Effektor - Proteine ​​aus einer Reihe von verschiedenen intra- und extrazellulären Bakterien gut bewährt, einschließlich C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, darmpathogene E. coli, Salmonella und Brucella 17,30-35. Um die Rolle der spezifischen Wirtsfaktoren auf Coxiella Effektor Translokation bestimmen verwenden wir ein gut etabliertes Verfahren zur Gen - Silencing als RNA - Interferenz bekannt, insbesondere small interfering RNA (siRNA). Ursprünglich in Caenorhabditis elegans identifiziert, ist die RNA - Interferenz ein konserviertes endogenen zellulären Prozess für angeborene defe verwendetnse gegen Viren sowie der Genregulation 36,37. Von sequenzspezifischen siRNA, Abbau von mRNA erfolgt durch RISC (RNA-induced silencing complex) , was zu spezifischen Gen - Silencing oder Zuschlags 38 nach der Bindung. In dieser Studie wurde siRNA zwei Wirtsproteine ​​zu zielen, RAB5A und Rab7A, die wichtige Regulatoren des endocytischen sind. Die Auswirkungen der RAB5A und Rab7A auf Effektor - Translokation zum Schweigen zu bringen wurde mit C ermittelt burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 ausgewählt wurde , wie es zuvor durch die Dot / Icm Sekretionssystem von Coxiella 17 transloziert werden , wurde gezeigt. Unter Verwendung sowohl siRNA Gen - Silencing und die fluorescencebased Translokation Assay hier beschrieben, beginnen wir eine Rolle für die Wirtsfaktoren bei der Translokation von Effektor - Proteine ​​, die durch Coxiella zu etablieren. Dieser Ansatz kann auf eine breite Palette von sowohl intra- und extrazellulären Bakterien angewendet werden, die ähnliche secretio besitzenn-Systeme, die für die Translokation von Effektor-Proteine.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat</td><td>Sigma</td><td>60218</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>ACCM-2 Medium Komponente</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>ACCM-2 mittelkomponentig</td></tr><tr><td>Eisensulfat</td><td>Fisher</td><td>S93248</td><td>ACCM-2 mittelkomponentig</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ACCM-2 mittelkomponentig</td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>C6852</td><td>ACCM-2 mittelkomponentig</td></tr><tr><td>Bacto-Neopepton</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 medium Komponente</td></tr><tr><td>Casaminosäuren</td><td>Fisher</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 mittlere Komponente</td></tr><tr><td>Methyl-Beta-Cyclodextrin</td><td>Sigma</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 mittlere Komponente</td></tr><tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 mittlere Komponente</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Für Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Non-targeting-Kontrolle Pool (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td></td></tr><tr><td>siRNA für humane PLK1 (5347) siRNA ohne Zielkontrolle - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-003290-01-005</td><td>Verursacht den Zelltod; Messung der Transfektionseffizienz</td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA-Puffer</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Verwenden Sie steriles RNase-freies Wasser, um 5x siRNA-Puffer auf 1x siRNA-Puffer zu verdünnen</td></tr><tr><td>DharmaFECT-1 Transfektionsreagenz</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>Für die Transfektion</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>Serumreduziertes Medium für die Transfektion</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>Für Zellkulturen und Infektionen</td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Kann ein alternatives gleichwertiges Produkt verwenden</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Für die Lagerung von Coxiella-Stamm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Für Zellkulturen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin + EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Für Zellkulturen</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>Zur Verdünnung von Proben und Standards für die qPCR</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>Kann ein alternatives äquivalentes Produkt zur Extraktion von gDNA</td></tr><tr><td>verwenden SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>Kann ein alternatives äquivalentes qPCR-Mastermix-Produkt für die qPCR-Reaktion</td></tr><tr><td>verwenden LiveBLAzer FRET-B/G Ladekit mit CCF2-AM</td><td>Invitrogen</td><td>K1032</td><td>Zur Messung der Translokation mittels Fluoreszenz und Erzeugung der 6X-Beladungslösung (enthält Lösung A, B, C und DMSO)</td></tr><tr><td>Natronlauge</td><td>Merck</td><td>106469</td><td>Probenicid-Lösungskomponente</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td>Probenicid-Lösungskomponente</td></tr><tr><td>Di-Natriumhydrogenorthophosphat</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>Probenicid-Lösung Komponente</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>Probenicid-Lösung Komponente</td></tr><tr><td>DRAQ5 Fluoreszenzsondenlösung (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62251</td><td>Zellkernfärbung zur Bestimmung der Zellviablität. Verwenden Sie 1:4000 verdünnt in PBS.</td></tr><tr><td>4%ige PFA-Lösung (Paraformaldehyd) in PBS</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Fixierlösung für HeLa 229 Zellen</td></tr><tr><td>25 cm2 Gewebekulturflasche mit belüfteter Kappe</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Für das Wachstum von Bakterienstamm</td></tr><tr><td>96 Well Flacher Boden Schwarzer Polystyrol TC-behandelte Mikrotiterplatten, einzeln verpackt, mit Deckel, steril</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Gewebekulturflasche mit belüfteter Kappe</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Für das Wachstum von HeLa 229 Zellen</td></tr><tr><td>175 cm2 Gewebekulturflasche mit belüfteter Kappe</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>Für das Wachstum von HeLa 229 Zellen</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td></td><td></td><td>Zur Quantifizierung von HeLa 229 Zellen</td></tr><tr><td>Tear-A-Way 96 Well PCR Platten</td><td>4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td>Für qPCR Reaktion</td></tr><tr><td>8-Deckel-Kette, flach</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>Für qPCR-Reaktion</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare<</td></tr><tr><td>strong>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Mikrofuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Wirbelmischer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitalmischer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Für die Pelletierung von Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td>Für die gDNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Mx3005P QPCR-Maschine</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>Für die Quantifizierung von Coxiella-Genomen in 7-Tage-Kultur</td></tr><tr><td>ClarioSTAR Mikroplatte Reader</td><td>BMG LabTech</td><td></td><td>Zur Messung der Fluoreszenz</td></tr></tbody></table>

anwenden von fluorescence resonance energy transfer (fret) zu untersuchen effektor translokation effizienz durch<em&gt; coxiella burnetii</em&gt; während sirna silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, der Erreger des Q - Fiebers, ist ein intrazelluläres Pathogen , das IV Dot / Icm Sekretionssystem auf einer Art setzt eine replikative Nische zu etablieren. Eine Kohorte von Effektoren werden durch dieses System in die Wirtszelle Host-Prozesse transloziert und ermöglichen die Schaffung eines einzigartigen Lysosom abgeleiteten Vakuole für die Replikation zu manipulieren. Die hier vorgestellte Methode beinhaltet die Kombination von zwei gut etablierte Techniken: spezifische Silencing Gen siRNA und Messung der Effektor-Translokation mit einem FRET-basierten Substrat verwenden, die auf β-Lactamase-Aktivität beruht. Die Anwendung dieser beiden Ansätze können wir damit beginnen, die Rolle von Wirtsfaktoren in bakteriellen Sekretionssystem Funktion und Effektor-Translokation zu verstehen. In dieser Studie untersuchten wir die Rolle der RAB5A und Rab7A, die beide wichtige Regulatoren des endocytic Handel Weg. Wir zeigen, dass eine Abnahme der Effektor translocatio die Expression von Protein Ergebnisse Silencingn Effizienz. Diese Verfahren können leicht modifiziert werden, um andere intra- und extrazellulären Krankheitserregern zu untersuchen, die auch die Sekretion Systeme nutzen. Auf diese Weise kann aufgedeckt werden ein globales Bild Faktoren Wirt in bakteriellen Effektor-Translokation beteiligt.

Für diese Studie wurden die C. burnetii pBlaM-CBU0077 Stamm wurde ausgewählt als CBU0077 wurde zuvor ein transloziert Effektor des Coxiella Dot / Icm Sekretionssystem 17 gezeigt ist. Vor der Infektion, die Gesamtzahl der Genome / ml in der 7 Tage C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur aufgezählt wurde qPCR unter Verwendung dar. 4 zeigt ein Beispiel des Zyklus Schwellenwert (Ct) -Werte von beiden Standards erwartet und Proben nach qPCR. Die...

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Erregern und ihren Wirten ist ein wichtiger Bereich der biologischen Forschung. Hier beschreiben wir die notwendigen Techniken Effektor - Translokation durch Coxiella burnetii während siRNA Gen - Silencing mit BlaM Substrat zu messen.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, die Auswirkungen bestimmter Wirtsvorgänge auf die Fähigkeit bakterieller Krankheitserreger zu untersuchen, Effektorproteine zu translozieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der zellulären Mikrobiologie zu beantworten. Insbesondere, wie der Wirt an der Blockierung oder Förderung der Abgabe bakterieller Virulenzeffektoren in die Wirtszelle beteiligt ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zwei etablierte Methoden kombiniert, nämlich die siRNA-vermittelte Gen-Silenzierung und den Reportergen-Assay zur Messung der bakteriellen Proteintranslokation, um die Wechselwirkungen zwischen Pathogenen und der eukaryotischen Zelle zu untersuchen.Diese Methode liefert Erkenntnisse über die Pathogenese von Coxiella und kann ebenfalls zur Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktionen anderer Bakterien angewendet werden, die von einem effizienten Proteintransport abhängen. Zum Beispiel Chlamydia, Salmonella und attachierende interfaziale E. coli. Nach dem Kultivieren von C. burnetii, das CBU0077 exprimiert, fusionieren Sie die Betalactamase gemäß dem schriftlichen Protokoll in einem 25

applying-fluorescence-resonance-energy-transfer-fret-to-examine

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

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