Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch Coxiella burnetii Während siRNA Silencing

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, den Einfluss spezifischer Wirtsprozesse auf die Fähigkeit bakterieller Krankheitserreger zur Translokation von Effektorproteinen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der zellulären Mikrobiologie zu beantworten. Insbesondere, wie der Wirt daran beteiligt ist, die Abgabe von bakteriellen Virulenzeffektoren in die Wirtszelle entweder zu blockieren oder zu fördern.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zwei etablierte Techniken kombiniert. Nämlich siRNA-Gen-Silencing und Reporter-Essay zur Messung der bakteriellen Proteintranslokation. Es sollte das Zusammenspiel zwischen Krankheitserregern und der eukaryotischen Zelle untersucht werden.

Diese Methode bietet Einblicke in die Coxiella-Pathogenese und kann auch zur Untersuchung der Wirts-Erreger-Interaktionen anderer Bakterien angewendet werden, die auf eine effiziente Proteintranslokation angewiesen sind. Zum Beispiel Chlamydien, Salmonellen und anhaftende E.coli. Nach der Kultivierung von C.burnetii, das CBU0077 exprimiert, wird die Betalactamase gemäß dem Textprotokoll in einem 25 cm großen quadratischen Kulturkolben mit belüfteter Kappe fusioniert.

Beimpfen Sie 10 Milliliter vorgewärmtes ACCM2, das drei Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenical enthält, mit 20 Mikrolitern der Bakterien. Lass die Kultur sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid und 2,5 Prozent Sauerstoff wachsen. Um transfektive Hela-Zellen mit siRNA rückgängig zu machen und nach der Vorbereitung der siRNA gemäß dem Textprotokoll, legen Sie DMEM plus 10 % FCS, 05 % Trypsin, EDTA und PBS vor der Verwendung 30 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad, um es zu erwärmen.

Kombinieren Sie für jede experimentelle siRNA-Transfektion 0,4 Mikroliter Transfektionsreagenz und 63,6 Mikroliter reduziertes Serummedium in einem einzelnen Mikrofuge-Röhrchen. Wirbeln Sie alle Mikrofugenröhrchen vor und lassen Sie die Komponenten fünf Minuten lang bei Raumtemperatur komplexieren. Geben Sie 16 Mikroliter jeder experimentellen siRNA in die entsprechenden Mikrofuge-Röhrchen, die den Transfektionskomplex enthalten.

Dann vortexen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während der 20-minütigen Inkubation werden 20 Mikroliter des Transfektionsreagenzes, des reduzierten Serummediums und der siRNA-Mischung in die entsprechenden Vertiefungen eines sterilen schwarzen, flachen 96-Well-Tabletts mit klarem Boden gegeben. Verwenden Sie auch während der 20-minütigen Inkubation 10 Milliliter vorgewärmtes PBS, um eine Monoschicht aus konfluenten oder subkonfluenten Helazellen in einem 75 Zentimeter großen quadratischen Kolben zu waschen.

Geben Sie einen Milliliter 05-prozentige Trypsin-EDTA-Lösung in den Kolben und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid drei bis fünf Minuten lang, um die Zellen zu lösen. Sammeln Sie die Zellen in neun Millilitern vorgewärmtem DMEM mit 10 % FCS. Mit einem Hämozytometer werden die Zellen gezählt.

Bringen Sie dann mit DMEM 10%FCS die Zellen auf eine Enddichte von 4,9 mal 10 auf die vier Zellen pro Milliliter. Unmittelbar nach der 20-minütigen Inkubation pipettieren Sie 80 Mikroliter der Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, die die siRNA-Transfektionsmischung enthält, wodurch die Zelldichte auf das 3,92-fache von 10 zu den dritten Zellen pro Vertiefung gebracht wird. Dies ist der kritischste Schritt in diesem Verfahren.

Es ist sehr wichtig, dass die Helazellen unmittelbar nach der 20-minütigen Inkubation in die siRNA-Transfektionsmischung gegeben werden. Andernfalls kann die Transfektionseffizienz beeinträchtigt werden. Stellen Sie sicher, dass die Blindvertiefungen nur 80 Mikroliter DMEM plus 10 % FCS enthalten.

Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang. Ersetzen Sie dann mit einem Mehrkanaladapter, der an eine Vakuumquelle angeschlossen ist, und einer Pipette das Medium durch 100 Mikroliter frisches DMEM plus 10 % FCS. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 48 Stunden.

Nach siebentägigem Wachstum von ACCM2 zentrifugieren Sie die 10 Milliliter C.burnetii P BlaM CBU0077 Kultur bei 15.000 g und Raumtemperatur für 15 Minuten. Verwenden Sie nach dem Entfernen des Überstands 10 Milliliter vorgewärmtes DMEM FCS, um das Pellet wieder zu suspendieren. Bereiten Sie dann mit Wasser eine von zehn und eine von hundert Verdünnungen in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern der Kultur vor und richten Sie die QPCR gemäß dem Textprotokoll ein.

Nach der Berechnung der Gesamtgenome pro Milliliter in der C.burnetii P BlaM CBU0077 Kultur wird das Volumen der Kultur mit vorgewärmtem FCS auf zwei Milliliter für eine Konzentration von 1,88 mal 10 auf die acht Bakterien pro Milliliter eingestellt. Entfernen Sie anschließend das Medium aus den leeren Zellen und kehren Sie die transfizierten Zellen um. Geben Sie dann 50 Mikroliter der verdünnten Bakterien in die entsprechenden Vertiefungen und geben Sie 50 Mikroliter DMEM FCS in die leeren und nicht infizierten Vertiefungen.

Nach der Vorbereitung der Lösungen für das BlaM-Substrat gemäß dem Textprotokoll wird ein Mastermix hergestellt, indem 1,8 Mikroliter Lösung A und 16,2 Mikroliter Lösung B kombiniert werden. Dann fügen Sie 237 Mikroliter Lösung C und 45 Mikroliter 0,1 molare Probenecid hinzu. Wirbeln Sie die Röhre erneut ein.

Geben Sie 10 Mikroliter der Six X-Ladelösung direkt in alle blinden und rückwärts transfizierten Vertiefungen, ohne das vorhandene Medium zu entfernen. Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Um den Grad der Translokation zu bestimmen, erstellen Sie auf einem Mikroplatten-Reader ein Fluoreszenzintensitätsprotokoll mit Endpunkt als Lesemodus.

Wählen Sie 96-Well-Mikrotiterplatten, wählen Sie dann unter Optikeinstellungen zwei Multichromatika aus und geben Sie für die erste Zahlenvoreinstellung 410-10 Nanometer Anregung und 520-10 Emission ein. Geben Sie für die zweite Zahlenvoreinstellung 410-10 Nanometer Anregung und 450-10 Emission ein. Stellen Sie dann sicher, dass Well-Multichromatik ausgewählt ist.

Wählen Sie als Nächstes Orbital Amitteling mit einem Durchmesser von drei Millimetern aus. Wählen Sie unter Optik die Option Untere Optik aus. Wählen Sie dann unter Geschwindigkeit und Präzision die Option Präzise aus.

Das entspricht acht Regionen pro Well. Passen Sie das Plattenlayout an, indem Sie die entsprechenden Vertiefungen als Leerproben und Probenvertiefungen auswählen. Wählen Sie dann Messung starten aus.

Nehmen Sie den Deckel ab und setzen Sie das Tablett in den Plattenleser ein. Stellen Sie sicher, dass der Verstärkungswert angepasst ist, um das Erreichen maximaler Fluoreszenzwerte zu vermeiden, indem Sie eine Verstärkungsanpassung an einem der infizierten Wells durchführen, das mit OTP-siRNA rückwärtstransfiziert wurde. Wählen Sie Messung starten, um alle entsprechenden Wells mit Bodenfluoreszenz bei einer Anregung von 410 Nanometern und einer Emission von 450 Nanometern bzw. 520 Nanometern für blaue bzw. grüne Fluoreszenz zu messen.

Analysieren Sie die Ergebnisse gemäß dem Textprotokoll. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für den Zyklusschwellenwert, der sowohl von Standards als auch von Proben nach QPCR erwartet wird, um die Gesamtzahl der Genome pro Milliliter in der siebentägigen C.burnetii-Kultur zu bestimmen. Basierend auf diesen Daten gab es 2,31 mal 10 to die acht Genome pro Milliliter in der 10 Milliliter resuspendierten Bakterienkultur.

Das Ergebnis der Stummschaltung von Rab5A oder Rab7A bei der Effektortranslokation aus drei unabhängigen Experimenten nach Inkubation der umgekehrten transfizierten Zellen mit BlaM-Substrat ist hier dargestellt. Eine signifikante Abnahme des BlaM-CBU0077-Translokationsniveaus trat während des Silencings von Rab5A und Rab7A im Vergleich zur OTP-Kontrolle auf. Wie in dieser Grafik gezeigt, führt die Behandlung mit Rab5A oder Rab7A zwar zu einer Verringerung der Zellviabilität im Vergleich zur OTP-Kontrolle, diese Reduktion ist jedoch nicht so schwerwiegend wie die Behandlung mit PLK1, einem Gen, von dem bekannt ist, dass es den Zelltod verursacht, wenn es zum Schweigen gebracht wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie bestimmte Wirtsziele mit siRNA zum Schweigen bringen können, und anschließend die Auswirkungen auf die bakterielle Effektorproteintranslokation mit Hilfe eines FRET-basierten Reporterassays untersuchen. Dieses Protokoll wurde sowohl für das Silencing von Rab-GTPasen bei der Coxieller-Infektion von Hela-Zellen optimiert. Um diese Methode für andere Wirtsproteine zu nutzen, müssen die Transfektionsbedingungen optimiert werden, um ein effizientes Gen-Silencing zu gewährleisten.

Ähnlich wie bei der Anwendung dieser Methode bei anderen bakteriellen Krankheitserregern muss der Infektionszustand optimiert werden.