Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel der seriellen Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie besteht darin, die Morphologie, Struktur, Verteilung, das Volumen und die Anzahl der Mitochondrien in einer definierten Region des Mäusegehirns zu analysieren. Diese Methode kann helfen, viele Schlüsselfragen der Neurobiologie zu beantworten, z. B. ob Veränderungen in der Struktur, Anzahl und Verteilung der Mitochondrien im Gehirn wesentlich zu neurodegenerativen und neurologischen Entwicklungsstörungen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den Prozess der Abbildung serieller Schnitte automatisiert, indem ein kundenspezifisches Ultramikrotom in die Kammer des Niedervakuum-Rasterelektronenmikroskops integriert wird.

Um das Experiment zu beginnen, waschen Sie das zuvor vorbereitete Glutaraldehyd-fixierte Gewebe dreimal für jeweils fünf Minuten in 0,1 molaren Cacodylatpuffer. Nach der Fixierung des Gewebes mit 1 Milliliter Cacodylat gepufferter 0,1%iger Gerbsäure für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Tücher nach der Fixierung in Cacodylatpuffer.

Lösen Sie 0,3 Gramm Kaliumferrocyanid und 0,86 Gramm Natriumcacodylat in 10 Millilitern destilliertem Wasser. Geben Sie kurz vor dem Gebrauch 10 Milliliter 4%Osmiumtetroxid hinzu und färben Sie das Gewebe 90 Minuten lang mit 2%iger Osmiumferrocyanidlösung auf Eis. Waschen Sie das Tuch nach dem Färben in destilliertem Wasser.

Behandeln Sie die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit frisch zubereitetem 1%igem Thiocarbohydrazid oder TCH-Lösung. Waschen Sie dann die Proben. Färben Sie anschließend das Gewebe eine Stunde lang mit 2% wässrigem Osmiumtetroxid.

Waschen Sie die Taschentücher nach dem Färben mit destilliertem Wasser. Inkubieren Sie die Proben über Nacht in 1%Uranylacetat in destilliertem Wasser bei 4 Grad Celsius. Spülen Sie das Gewebe am nächsten Tag in destilliertem Wasser ab und inkubieren Sie es mit dem Blei-Aspartat-Fleck von Welton in einem Ofen.

Die bestmögliche Färbung von Geweben ist für die Bildgebung von entscheidender Bedeutung, da eine schlechte Färbung zu einem Aufladungsphänomen auf der Probe führt, das die Bildgebung erschwert oder unmöglich macht. Waschen Sie das Tuch in destilliertem Wasser. Die Proben werden jeweils fünf Minuten lang durch eine abgestufte Reihe von Alkohol mit gekühlten Ethanollösungen dehydriert, gefolgt von einer dreimal 100%igen Ethanol-Dehydratisierung für jeweils 10 Minuten.

Waschen Sie die Proben zweimal für jeweils 15 Minuten in Propylenoxid. Legen Sie die Gewebe in eine 1:1-Mischung aus Einbettharz und Propylenoxid, verschließen Sie das Fläschchen und inkubieren Sie die Gewebe über Nacht. Öffnen Sie den Deckel des Fläschchens nach zwei Stunden, so dass das Propylenoxid über den Zeitraum von neun Stunden verdampft.

Übertragen Sie die Taschentücher zwei Stunden lang in 100% frisches Einbettungsharz in saubere Fläschchen. Betten Sie die Proben in frisches Einbettharz in flache Formen mit bedruckten Papieretiketten ein und härten Sie sie in einem Ofen aus. Überprüfen Sie nach einer Stunde die Gewebeplatzierung und -ausrichtung und passen Sie sie gegebenenfalls an.

Schneiden Sie die Proben auf den interessierenden Bereich zu und befestigen Sie sie mit gelierendem Cyanacrylat-Sekundenkleber auf einem Aluminiumstift. Beschichten Sie dann die Probe mit kolloidaler Silberpaste an den Seiten des Blocks, um einen leitenden Weg zum Aluminiumstift zu schaffen. Untersuchen Sie die Gewebeproben mit einem Rasterelektronenmikroskopsystem, das mit einem Ultramikrotomtisch in der Kammer und einem Rückstreuelektronendetektor mit niedrigem Kilovolt ausgestattet ist.

Bilden Sie die Proben mit diesen Einstellungen ab. Beginnen Sie mit der Analyse, indem Sie Bild, Typ und dann 8-Bit auswählen, um die Bilder vom ursprünglichen proprietären 16-Bit-Format in das 8-Bit-TIFF-Format zu konvertieren. Wenn die automatische Kontrast- und/oder Helligkeitskonvertierung während dieses Schritts für Bilder nicht ideal ist, öffnen Sie die 16-Bit-Bilder erneut und drücken Sie Bild, Anpassen, Helligkeit/Kontrast.

Wählen Sie einen Bereich aus, der für alle Bilder geeignet ist, und drücken Sie auf Übernehmen. Führen Sie dann die Konvertierung durch. Wenn es zu einer inakzeptablen Bildverschiebung zwischen den Slices gekommen ist, richten Sie die Bildstapel aus, indem Sie Plugins, Registrierung und Lineare Stapelausrichtung mit SIFT auswählen und die Ausrichtung für den reinen Übersetzungsmodus und nicht für den starren Körper festlegen.

Vergrößern Sie die Leinwandgröße vor der Registrierung, indem Sie Bild, Anpassen, Leinwandgröße auswählen. Alternativ können Sie das Bild auf einen interessanten Bereich reduzieren, indem Sie den gewünschten Bereich auswählen und dann zuschneiden. Skalieren Sie bei Bedarf Bilder mit ImageJ auf eine kleinere, besser handhabbare Größe und wählen Sie dann Bild und Skalieren aus.

Konfokale Mikroskopie an neuronalen Kulturen niedriger Dichte zeigte, dass Mitochondrien, die sich in neuronalen Soma befinden, ein retikuläres Netzwerk bilden, während diejenigen, die sich in distalen Neuriten befinden, eine diskrete längliche Morphologie aufweisen. Mit Hilfe der seriellen Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBFSEM-Technik) wurden die Mitochondrien, Dendriten und axonalen Varikositäten im Gehirn der Maus deutlich beobachtet. Dreitägige Rekonstruktionen von Mitochondrien in den Neuriten des Hirngewebes von Mäusen zeigten einen Größenunterschied zwischen dendritischen und axonalen Mitochondrien.

Daten, die aus einem repräsentativen 2-D-SBFSEM-Bild extrahiert wurden, zeigten, dass das Volumen oder die Größe der Mitochondrien, die sich in den neuronalen Präsynapsen befinden, signifikant kleiner ist als die in der extrasynaptischen Region. Die durch die SBFSEM-Analyse aufgenommenen Bilder bieten eine erhöhte Auflösung, um die ultrastrukturellen Eigenschaften einzelner Mitochondrien sichtbar zu machen. Es ist möglich, das zelluläre Kompartiment der Mitochondrien zu klassifizieren, indem seine Nähe zu leicht identifizierbaren Strukturen wie nicht-synaptischen somatischen Mitochondrien und präsynaptischen Mitochondrien bestimmt wird.

Diese Technik kann in etwa sieben Tagen durchgeführt werden, darunter drei Tage Färbung, zwei Tage für die Aushärtung des Harzes, einen Tag Bildgebung, um einen für diese Analyse geeigneten Stapel zu erstellen, und etwa zwei bis vier Stunden für die Bildnachbearbeitung zur Vorbereitung der Analyse. Dieses Verfahren kann auch in Verbindung mit anderen Verfahren zur Bildgebung von Mitochondrien, wie z.B. der Live-Bildgebung mit genetisch markierten Mitochondrien, verwendet werden, um Fragen zum Mitochondrientransport und der Dynamik ihrer Spaltung und Fusion zu beantworten.