Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel der seriellen Blockflächen-Scanning-Elektronenmikroskopie besteht darin, die Morphologie, Struktur, Verteilung, das Volumen und die Anzahl von Mitochondrien in einem definierten Bereich des Maushirns zu analysieren. Diese Methode kann helfen, viele zentrale Fragen der Neurobiologie zu beantworten, beispielsweise, ob Veränderungen in der Struktur, Anzahl und Verteilung von Mitochondrien im Gehirn wesentlich zu neurodegenerativen und neurodevelopmentellen Erkrankungen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie den Prozess der Abbildung serieller Schnitte automatisiert, indem ein speziell angefertigtes Ultramikrotom in die Vakuumkammer des Rasterelektronenmikroskops integriert wird.

Um das Experiment zu beginnen, waschen Sie das zuvor präparierte, mit Glutaraldehyd fixierte Gewebe dreimal für jeweils fünf Minuten in 0,1-molarer Cacodylat-Pufferlösung. Fixieren Sie das Gewebe anschließend mit 1 Milliliter Cacodylat-gepuffertem 0,1 %igen Tannin-Säure für 30 Minuten bei Raumtemperatur nach. Nach der Nachfixierung waschen Sie das Gewebe in Cacodylat-Puffer.

Lösen Sie 0,3 Gramm Kaliumferrocyanid und 0,86 Gramm Natriumcacodylat in 10 Milliliter destilliertem Wasser auf. Unmittelbar vor der Verwendung 10 Milliliter 4 %iger Osmiumtetroxidlösung hinzufügen und die Gewebe 90 Minuten lang auf Eis mit einer 2 %igen Osmiumferrocyanidlösung anfärben. Nach der Färbung das Gewebe mit destilliertem Wasser waschen.

Behandeln Sie die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit frisch zubereiteter 1%igen Thiocarbohydrazid- (TCH-)Lösung. Anschließend spülen Sie die Proben. Färben Sie danach das Gewebe eine Stunde lang mit 2%iger wässriger Osmiumtetroxidlösung.

Nach der Färbung die Gewebe mit destilliertem Wasser waschen. Die Proben über Nacht bei 4 Grad Celsius in 1 % Uranylacetat in destilliertem Wasser inkubieren. Am nächsten Tag die Gewebe mit destilliertem Wasser abspülen und sie anschließend mit Welton's Blei-Aspartat-Färbung im Ofen inkubieren.

Die bestmögliche Färbung von Geweben ist für die Bildgebung entscheidend, da eine schlechte Färbung zu einem Ladungsphänomen auf der Probe führt, das die Bildgebung erschwert oder unmöglich macht. Waschen Sie das Gewebe in destilliertem Wasser. Entwässern Sie die Proben durch eine abgestufte Alkoholreihe, indem Sie gekühlte Ethanol-Lösungen jeweils fünf Minuten lang verwenden, gefolgt von einer Dehydrierung mit 100 % Ethanol, die dreimal jeweils zehn Minuten durchgeführt wird.

Die Proben zwei Mal jeweils 15 Minuten in Propylenoxid waschen. Die Gewebe in eine 1:1-Mischung aus Einbettungsharz und Propylenoxid geben, das Gefäß verschließen und die Gewebe über Nacht inkubieren. Nach zwei Stunden das Gefäß öffnen, sodass das Propylenoxid über einen Zeitraum von neun Stunden verdunstet.

Überführen Sie die Gewebe in frisches Einbettungsharz (100 %) in sauberen Gefäßen für zwei Stunden. Einbetten Sie die Proben in frischem Einbettungsharz in flachen Formen mit bedruckten Papierschildern und härten Sie sie im Ofen aus. Nach einer Stunde überprüfen Sie die Positionierung und Ausrichtung des Gewebes und korrigieren Sie gegebenenfalls.

Schneiden Sie die Proben auf den gewünschten Bereich zu und befestigen Sie sie mit einem gelartigen Cyanoacrylat-Superkleber auf einer Aluminiumnadel. Beschichten Sie anschließend die Probe rings um den Block mit kolloidalem Silberlack, um einen leitfähigen Pfad zur Aluminiumnadel herzustellen. Untersuchen Sie die Gewebeproben mithilfe eines Rasterelektronenmikroskops, das mit einer Ultramikrotomstufe im Probekammerbereich und einem Detektor für rückgestreute Elektronen bei niedriger Kilovoltspannung ausgestattet ist.

Bilden Sie die Proben mit diesen Einstellungen ab. Beginnen Sie die Analyse, indem Sie nacheinander Bild, Typ und dann 8-Bit auswählen, um die Bilder vom ursprünglichen proprietären 16-Bit- in das 8-Bit-TIFF-Format umzuwandeln. Falls die automatische Kontrast- und/oder Helligkeitsumwandlung während dieses Schritts für die Bilder nicht ideal ist, öffnen Sie die 16-Bit-Bilder erneut und drücken Sie Bild, Anpassen, Helligkeit/Kontrast.

Wählen Sie einen Bereich aus, der für alle Bilder geeignet ist, und klicken Sie auf „Apply“. Führen Sie anschließend die Konvertierung durch. Falls zwischen den Schichten eine inakzeptable Bildbewegung aufgetreten ist, richten Sie die Bildstapel aus, indem Sie nacheinander Plugins, Registration und Linear Stack Alignment with SIFT auswählen, und stellen Sie die Ausrichtung auf den „translation-only“-Modus statt auf „rigid body“ ein.

Vergrößern Sie die Leinwandgröße vor der Registrierung, indem Sie Bild, Anpassen, Leinwandgröße auswählen. Alternativ können Sie das Bild auf einen Bereich von Interesse verkleinern, indem Sie den gewünschten Bereich auswählen und anschließend zuschneiden. Falls erforderlich, skalieren Sie die Bilder mit ImageJ auf eine kleinere, überschaubarere Größe und wählen dann Bild und Skalieren.

Mittels konfokaler Mikroskopie an neuronalen Kulturen mit geringer Dichte zeigte sich, dass Mitochondrien im neuronalen Soma ein retikuläres Netzwerk bilden, während jene in distalen Neuriten eine diskrete, gestreckte Morphologie aufweisen. Mithilfe der seriellen Blockflächen-Scanning-Elektronenmikroskopie, oder SBFSEM-Technik, konnten Mitochondrien, Dendriten und axonale Varikositäten im Maushirn eindeutig beobachtet werden. Dreitägige Rekonstruktionen von Mitochondrien in den Neuriten von Maushirngewebe zeigten einen Größenunterschied zwischen dendritischen und axonalen Mitochondrien.

Die aus einem repräsentativen 2-D-SBFSEM-Bild extrahierten Daten zeigten, dass das Volumen oder die Größe von Mitochondrien in den neuronalen präsynaptischen Bereichen signifikant kleiner war als diejenige von Mitochondrien im extrasynaptischen Bereich. Die mittels SBFSEM-Analyse gewonnenen Bilder bieten eine verbesserte Auflösung, um die ultrastrukturellen Merkmale einzelner Mitochondrien sichtbar zu machen. Es ist möglich, den zellulären Kompartimenttyp von Mitochondrien zu klassifizieren, indem man deren räumliche Nähe zu leicht erkennbaren Strukturen bestimmt, wie beispielsweise nicht-synaptischen somatischen Mitochondrien und präsynaptischen Mitochondrien.

Diese Technik kann in etwa sieben Tagen durchgeführt werden, wozu drei Tage Färbung, zwei Tage für das Aushärten des Harzes, ein Tag für die Bildaufnahme zur Erzeugung eines für diese Analyse geeigneten Stapels und etwa zwei bis vier Stunden für die Bildnachbearbeitung zur Vorbereitung der Analyse gehören. Dieses Verfahren kann auch in Kombination mit anderen Methoden zur Abbildung von Mitochondrien verwendet werden, beispielsweise Live-Abbildung mit genetisch markierten Mitochondrien, um Fragen zur mitochondrialen Transportbewegung sowie zu den Dynamiken ihrer Teilung und Fusion zu beantworten.