Name: Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Lernen Sie die serielle Block-Gesicht-Rasterelektronenmikroskopie zur Analyse der Mitochondrienmorphologie in Maus-Hirngewebe. Diese Methode ermöglicht 3D-Rekonstruktionen und liefert Einblicke in neurodegenerative Erkrankungen.

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Wir danken Sidney Walker für die technische Hilfe. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Zuschuss des National Institute of Health (1R01EY024712-01A1) unterstützt.

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech genehmigt. Achtung: Extreme Vorkehrungen müssen getroffen werden, wenn der Handhabung und Entsorgung mehrerer Komponenten in diesem Protokoll verwendet. Vor Gebrauch muss der lokale institutionellen Richtlinien und die Gesundheits- und Sicherheitsmaßnahmen eingerichtet werden und anschließend, insbesondere für Osmiumtetroxid, die flüchtig und sehr giftig ist, Uranylacetat, die beide ist ein Schwermetall und die Quelle der Radioaktivität und Bleinitrat, das ist ein Schwermetall Gift. Thiocarbohydrazid (TCH) können sich zersetzen explosive und giftige Gase zu erzeugen, wenn sie falsch gehandhabt. Viele Institutionen wird eine EM-Core Facility, in dem haben diese Reagenzien routinemäßig eingesetzt werden und Unterstützung bieten kann. 1. Herstellung von Hirngewebe und SBFSEM Imaging <ol><li> Anesthetize eine junge (~ 2-4 Monate alt) C57 schwarze Maus (C57BL / 6J-Stamm) mit 4 - 5% isoflurane nach den Richtlinien des Instituts. Bestätigen anesthetization durch den Verlust des Muskeltonus Überwachung, Mangel an willkürlichen Bewegungen und Reaktionen auf aversiven Reizen wie ein Schwanz kneifen. </li><li> Pin der Maus auf eine Dissektion Tablett und machen einen Schnitt auf der Haut entlang ventralen Mittellinie. Machen Sie weitere Einschnitte in der Haut den Brustkorb der Maus zu belichten. Inzision der Membran und vorsichtig die Brusthöhle entlang der Peripherie sezieren heraus das schlagende Herz, zu entlarven und dann auf den rechten Vorhof einen Einschnitt zu machen. </li><li> Mit einer Flügelkanüle, kanülieren den linken Ventrikel. Perfundieren transkardial mit der Maus 10 - 20 ml Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS), pH 7,2, bis zum Ausbluten durch eine Änderung in der Farbe der Leber bestätigt wird. Hinweis: Eine Änderung in der Farbe der Leber ist als Leitfaden verwendet, um das Ausmaß der Ausbluten zu bestimmen. Bestätigen Sie, dass die Leber Farbe von rötlich-braun rosa bis hellrot. </li><li> Perfuse transcardial mit der Maus 10 - 20 ml 2% GlutarAldehyd und 4% Paraformaldehyd in 0,10 M Cacodylatpuffer (pH 7,2) handelt, das Gehirngewebe schnell von innen zu befestigen. Die Fixierung erfolgt durch die Beobachtung der Schwanz Versteifung überwacht. Anmerkung: Bereiten 0,10 M Cacodylatpuffer (pH 7,2) durch Auflösen von 2,14 g Natrium-Cacodylat in 80 ml Wasser, fügt Salzsäure den pH-Wert einzustellen, und das Volumen auf 100 ml mit Wasser zu machen. </li><li> Im Anschluss an die Perfusion, köpfen die Maus, um das Gehirn zu sezieren, gefolgt von der Fixierung in 0,10 M Natriumkakodylat - Puffer (pH 7,2), der 2% Glutaraldehyd und 4% Paraformaldehyd für 48 Stunden bei 4 o C. </li><li> Nach 48 Stunden machen 400 um Koronalschnitte ein Vibratom und anschließend vorsichtig den interessierenden Bereich im Gehirn (beispielsweise der Hippocampus) unter dem Dissektionsmikroskop 42 sezieren. Sorgfältig das Gewebe schneiden und nehmen Sie ein Bild Orientierung für die Konservierung. Hinweis: Die Nachbearbeitung Methoden der Gewebefärbung in SBFSEM kombiniert eine Vielzahl von Schwermetall Färbemethoden inUm die Auflösung zu verbessern und werden auf der Grundlage des Verfahrens entwickelt , die zuvor von Deerinck et al 40. </li><li> Waschen Sie die Glutaraldehyd-fixierten Gewebe 3 mal, jeweils 5 min in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,2). </li><li> Bereiten 0,1% Gerbsäure-Lösung durch Auflösen von Gerbsäure in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer (pH 7,2). Swirl, bis sie gelöst und filtriert durch 0,45 um Filter, falls erforderlich. </li><li> Postfix die Gewebe mit Cacodylat gepufferte 0,1% Gerbsäure durch 30 in 1 ml Reagenz Inkubation - 60 min bei RT. Hinweis: Die Inkubationszeit hängt von Gewebegröße, aber 30 min am besten für die meisten Gewebe. </li><li> Waschen Gewebe 3 mal, jeweils 5 min in Kakodylat-Puffer (pH 7,2). </li><li> Man löst 0,3 g Kaliumferrocyanid und 0,86 g Natriumcacodylat in 10 ml destilliertem H 2 O (dH 2 O). Halten Sie die Kaliumferrocyanidlösung auf Eis. Unmittelbar vor der Verwendung wurden 10 ml 4% Osmiumtetroxid (OsO 4) hinzuzufügen. </li><li> Stain das Gewebe mit 2% osmium-Ferrocyanidlösung für 90 Minuten auf Eis. 3 x waschen, jeweils 5 min in dH 2 O. </li><li> Vorbereitung 1% Thiocarbohydrazid (TCH) Lösung von 0,1 g TCH Auflösen in 10 ml dH 2 O. Man löst bei 60 ° C durch alle 10 min wirbelnden, bis sie vollständig gelöst. Sicherheitshinweise beachten während TCH Handhabung, vor allem darauf achten, Verwendung von Metallen, Erhitzen auf hohe Temperatur zu vermeiden, oder ermöglicht Lösung austrocknen. </li><li> Behandlung der Proben mit frisch hergestellten 1% TCH für 20 min bei RT. 3 x waschen, jeweils 5 min in dH 2 O. </li><li> Verdünne 4% OsO 4 bis 2% mit dH 2 O, stain Gewebe mit 2% iger wäßriger Osmiumtetroxid durch 1 h Inkubation. Waschen Sie Gewebe 3 - mal, jeweils 5 min mit dH 2 O. </li><li> Inkubieren der Proben O / N in 1% Uranylacetat in dH 2 O bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie Waltons Blei Aspartat - Lösung (wie von Deerinck et al 40). <ol><li> Man löst 0,998 g L-Aspartat in 250 ml dH 2 Ound fügen Sie dann 10 N Kaliumhydroxid (KOH) in tropfenweise, bis der pH-Wert 5,5 erreicht. Nach pH-Einstellung in 10 ml Asparaginsäure Lager und Wärme auf 60 ° C für 30 min 0.066 g Bleinitrat hinzu. </li></ol></li><li> Spülen Gewebe in dH 2 O und Inkubation mit der Walton stain Blei Aspartat für 30 min in einem 60 ° C - Ofen. 3 x waschen, jeweils 5 min in dH 2 O. </li><li> Dehydratisieren Proben durch eine abgestufte Reihe von Alkohol gekühlten Lösungen von 20% unter Verwendung von 50%, 75%, 85% und 95% Ethanol jeweils 5 Minuten, gefolgt von 100% Ethanol 3 mal, jeweils 10 Minuten. Hinweis: Verwenden Sie 100% Ethanol aus frisch geöffneten Flasche, wie geöffnet Ethanol Wasser aus der Luft absorbiert und verursachen Einbettung zum Scheitern verurteilt. Längere Inkubationen werden bei größeren Gewebeproben erforderlich sein. </li><li> Waschproben 2-mal, jeweils 15 min in Propylenoxid. </li><li> Machen Kunststoff Einbettung Harz unter Verwendung von 25 ml Harz, 10,5 ml DDSA (Dodecenylbernsteinsäureanhydrid), 15,5 ml NMA (nadic Methyl Anhydrid) und 1 mlDMP-30 (2,4,6-Tris dimethylaminomethyl phenol). Mischen Sie das Harz durch Schütteln. Spin und lassen Sie das Harz bis Blasen Entschlossenheit zu stehen. Hinweis: Dies ist die Standard mittlerer Härte Rezept. Andere Arten der Elektronenmikroskopie (EM) Kunstharz kann verwendet werden, sollten aber mit einem nicht-essentiellen Kontrollprobe im Voraus überprüft werden, da nicht alle Harze für SBFSEM arbeiten. </li><li> Inkubieren Sie das Gewebe O / N in einer 50: 50 Mischung aus Einbettungsharz und Propylenoxid in einer Phiole, die zunächst mit einer Kappe bedeckt wird, dann uncapped nach 2 h, so daß das Propylenoxid im Zeitraum von etwa 8 verdampft über - 10 hr. </li><li> Übertragen Sie die Gewebe zu 100% frisch Einbettungsharz in saubere Fläschchen für 2 Std. </li><li> Einbetten von Proben in frischem Einbettungsharz, in flache Formen bedruckten Papieretiketten enthalten, und heile sie in einem Ofen bei 60 ° C für 48 Stunden. Nach ca. 1 Stunde, überprüfen Sie die Gewebe Platzierung und Ausrichtung wieder, und bei Bedarf einstellen. </li><li> Trim Proben auf den Bereich von Interesse und Montage auf einem Aluminiumstift Gellin mitg Cyanacrylat superglue oder ein leitfähiges Epoxydharz, dann Mantel mit kolloidalem Silber an den Seiten des Blocks Paste einen leitenden Pfad zu der Aluminiumstift bereitzustellen. </li><li> Untersuchen von Gewebeproben eines Rasterelektronenmikroskops - System ausgestattet mit einer in-Kammer Ultramikrotom Bühne und niedrige kV Rückstreuelektronendetektor 32. Hinweis: Erhalten Instrument- und Website-Ausbildung in der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) verwenden und zu einem autorisierten Benutzer. Alternativ Zusammenarbeit mit einem Forscher oder Core Facility für kleine Projekte möglich sein. Radiation Ausbildung kann auch erforderlich sein, wie REMs Röntgenstrahlen erzeugen. </li><li> Um das Bild zu den Proben, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 2,25 kV, mit einem 5 - 10 nm / Pixel Auflösung, mit Feldgrößen zwischen 80 bis 250 &amp; mgr; m in x, y (andere Feldgrößen möglich) und Schichtdicke von 50 bis 100 nm, mit insgesamt 250 bis 600 Scheiben in einer 16 bis 20 Stunden Zeit. Hinweis: Die Einstellungen variieren erheblich zwischen den verschiedenen Mikroskopen, indiduellen Proben und die gewünschte Auflösung. Diese Einstellungen sollten Bilder zu erzeugen, die leicht interpretierbar für viele Proben sind. </li></ol> 2. Die Analyse der Imaging-Dataset Hinweis: Das Bild J / Fidschi-Software verwendet wird, den Datensatz zu analysieren und stützt sich auf die TrakEM2 Plugin. Vorverarbeitungsschritten können unter Verwendung einer Vielzahl von Software durchgeführt werden und können auch umfangreiche oder klein sein, je nach Erfahrungsgrad und die Stapel erhalten. Die wichtigsten Transformationen, die Open-Source-Software (ImageJ ver 1.50b herunterladen FIJI 1. Oktober 2015) werden hier beschrieben. <ol><li> Umwandeln von Bildern in 8-Bit-TIFF-Format von den ursprünglichen proprietären 16-Bit-Bilder von in der Software öffnen und Auswählen von Menüoptionen Bild → Typ → 8 Bit. <ol><li> Wenn die automatische Kontrast / Helligkeitsumwandlung während dieses Schrittes für Bilder nicht ideal ist, öffnen Sie die 16-Bit-Bilder, und drücken Sie Bild → Anpassen → Helligkeit / Kontrast. Wählen Sie einen Bereich, der für alle Bilder funktioniert, und drücken Sie Apply. Dann c durchführenonversion. Hinweis: Bei einigen REMs kann dieser Schritt Mikroskophersteller-Software. </li><li> Bei Bedarf aufgrund inakzeptablen Bildbewegung zwischen den Schichten (z. B. Drift aufgrund des Ladens), registrieren / align Bildstapel (Menüpunkte Plugins → Registrierung → Lineare StackAlignmentWithSIFT). In den meisten Registrierungssoftware, die für &quot;Übersetzung-only&quot; -Modus und nicht als &quot;starrer Körper&quot;. Hinweis: Viele Ansätze und Software arbeiten können: die SIFT Registrierung Plugin funktioniert für viele Anwendungen und es gibt einen virtuellen Stack-Version. <ol><li> Bei Bedarf vergrößern die Größe der Leinwand vor der Registrierung (Bild → → Leinwandgröße anpassen) oder es von Interesse (Bild → Crop) auf einen Bereich zu reduzieren. Hinweis: Einige Drift oder Spreizen auftreten können, und versuchen, andere Plugins oder Software kann zu besseren Ergebnissen führen. Manuelle Optionen sind ebenfalls verfügbar (zB. ImageJ / FIDSCHI, Plugins → Registrierung → ManualLandmarkSelection). </li></ol></li><li> Wenn desired, Stufenbilder zu kleineren, überschaubaren Größe (z. B. 25%) mit ImageJ (Bild → Scale). </li></ol></li><li> Starten Sie die Software, wählen Sie Datei → Import → Bildfolge und dann die TIFF-Dateien auswählen. </li><li> Starten Sie das Plugin von Datei → Neu → TrakEM2 (Blank) auswählen. Zwei Fenster wird geöffnet; ein leitet das Projekt und area_lists und die andere Verfolgung verwaltet, und ist als &quot;Leinwand&quot; bezeichnet. </li><li> Legen Sie das Bildstapel in das Plugin, indem ein Rechtsklick auf die Leinwand importieren. Wählen Sie importieren, und klicken Sie auf Import-Stack. In der Pop-up-Optionen, markieren Sie das Kästchen für virtuelle Stacks. Anmerkung: Obwohl die Bildstapel bereits in der Software geöffnet werden, müssen sie auch in dem Plugin geöffnet werden. Der Computer kann mehr reibungslos laufen, wenn die virtuelle Stapel Kästchen aktiviert ist. </li><li> Nachdem die mipmaps erstellt werden und der Stapel wird geladen, klicken Sie rechts das Projekt unter dem Plugin-Fenster zu nennen. Klicken Sie rechts auf &quot;neues Projekt&quot; in der Vorlage colUMN, und wählen Sie &quot;Hinzufügen neuer Kind &#39;für das Projekt. Rechts klicken Sie erneut auf, um &#39;area_list&#39;. </li><li> Stellen Sie die Z-Achse Umfang des Projekts mit den ursprünglichen elektronenmikroskopische Aufnahme-Einstellungen mit der rechten Maustaste auf die Leinwand zu einigen, dann klicken Sie auf Anzeige und wählen Sie Kalibrierung. Außerdem sind die Z-Skala durch alle Ebenen im Plugin-Fenster Auswahl der rechten Maustaste auf Skala Z und Dicke wählen. </li><li> Klicken Sie auf und ziehen Sie das &quot;Projekt&quot; und alle &quot;Kinder&quot; in den Projektteil Objekte, die &quot;Bereich Listen &#39;unter dem&#39; Z Raum &#39;Seite in der Leinwand-Fenster zu erstellen. </li><li> Wählen Sie die &quot;Bereichsliste&quot; und der rechten Maustaste auf eine Farbe auszuwählen und einzustellen. Verwenden Sie nun den Pinsel-Werkzeug Objekte zu verfolgen, wie Mitochondrien, in der elektronenmikroskopischen Aufnahme Bilder. Verwenden Sie &#39;Shift + Klick &quot;in einem geschlossenen Kreis zu füllen,&quot; Strg + blättern&#39; zu vergrößern und aus, und &quot;Alt + klicken Sie auf&quot; Pinsel Cursor in einen Radiergummi zu machen. </li><li> Wählen Sie zwei Bereiche von ~ 10 bis 15 &amp; mgr; mvon 10 bis 15 &amp; mgr; m in der oberen linken Ecke und die untere rechte Ecke des Bildes und zu identifizieren alle Mitochondrien innerhalb dieser Bereiche in jeden Datensatz unvoreingenommene Probenahme von Mitochondrien zu ermöglichen. </li><li> Auf der &quot;Leinwand&quot;, beobachten und Spuren Mitochondrien in den Sektionen. Hinweis: Die Mitochondrien sind ziemlich dunkel / dicht erscheinen, Organellen, von ähnlicher Größe im Durchmesser und locker zylindrisch. Die einzigartige cristae durch die innere Membran gebildet sind in diesem Organell leicht zu unterscheiden. </li><li> Wenn mit Tracing fertig sind, klicken rechts auf dem area_list unter dem Reiter Z Raum, wählen Sie &quot;Show in 3D &#39;. Dadurch wird der 3D-Viewer-Plugin starten Sie eine 3D-Rekonstruktion des verfolgt Bild anzuzeigen. <ol><li> Um mitochondrialen Volumenmessungen, wählen Sie Objekt in 3D-Viewer ausführen, klicken Sie auf &quot;Bearbeiten&quot; Registerkarte und wählen Sie &quot;Objekteigenschaften&quot;. Die mitochondriale Volumenschätzung wird zusammen mit mehreren anderen Messungen aufgeführt. </li></ol></li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben. Emily K Benson ist eine bezahlte Mitarbeiterin von Renovo Neural Inc., und Grahame J Kidd ist wissenschaftlicher Direktor für 3DEM bei Renovo Neural Inc., einem kommerziellen Anbieter von seriellen Block-Face-SEM-Diensten und -Analysen.

Die Komplexität des Nervensystems stellt eine erhebliche Herausforderung große Gewebevolumina in Rekonstruieren und die Morphologie und Verteilung von Organellen wie Mitochondrien mit ausreichender Auflösung zu analysieren. Mehrere Zellen , einschließlich Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten mit zahlreichen Prozessen in drei Dimensionen erweitert interagieren innerhalb des Hirngewebes 43. Da Mitochondrien sowohl im Soma von Zellen und fernen Prozesse liegt, ist mitochondrialen Morphologie extrem pleomorp...

Mitochondrien sind Organellen , die dynamisch ihre Form und Lage an die zellulären Cues und je nach Bedarf zu ändern, in enge Wechselwirkung mit Zell Zytoskeletts, und in Reaktion auf zelluläre Ereignisse , wie beispielsweise Calciumströme in Neuronen 1. Mitochondria auch Wechselwirkungen mit anderen Zellorganellen endoplasmatischen Retikulum zB die wiederum 2 ihre Dynamik und Stoffwechsel reguliert. Mitochondrial Morphologie zeigt Heterogenität in verschiedenen Zelltypen , dh. die Form des Organell variiert von rohrförmigen dieser bestehend aus Folien, Säcke und Ovalen 3. Es hat sich gezeigt , dass die mitochondriale Fusion und Spaltung Zyklusproteine ​​können die Position, Größe, Form und Verteilung der Mitochondrien 4 regulieren. Darüber hinaus Veränderungen in der mitochondrialen Form sind mit Neurodegeneration, neuronale Plastizität, Muskelatrophie, Calcium-Signalgebung, reaktive Sauerstoffspezies Generation sowie Lebensdauer und Zelltod Verwicklung tha assoziiertT - Zell-spezifische mitochondriale Morphologie ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der normalen Zellfunktion 5-11. Ein Haupt bioenergetischen Funktion der Mitochondrien ist Adenosintriphosphat (ATP) durch eine Reihe von Stoffwechselreaktionen ausführen , die umfassen vollständigen Abbau von Nährstoffen (zB Glucose,-Fettsäuren oder Aminosäuren) über den TCA - Zyklus und OXPHOS Pfade 12 zu erzeugen. Das menschliche Gehirn macht nur 2% des Körpergewichts jedoch verbraucht er ~ 20% der Gesamtenergie erzeugt es eine extrem Energie machen Organ anspruchsvolle 13. Es ist daher nicht verwunderlich , dass mitochondriale Dysfunktion beim Menschen zu einer großen Anzahl von neurologischen Auffälligkeiten führt 14-17. Genetische Mutationen in OXPHOS Komponenten , die ATP - Generation führt zu mitochondrialen Erkrankungen 17,18, beeinträchtigen die klinisch heterogene Gruppe von Erkrankungen mit einer Prävalenz von ~ 1 sind: 5000 Personen, und eine der häufigsten Ursache von metabolic Störungen bei Kindern und Erwachsenen. Defizit von Mitochondrien stamm ATP wirkt multiple Organsysteme mit hoher Energie anspruchsvollen Organen, wie Gehirn, Herz und Skelettmuskulatur überwiegend in diesen Patienten 14,17,18 beeinflusst zu werden. In den letzten Jahren haben mehrere Studien gezeigt , dass 15-17,19,20 für mitochondriale Dysfunktion sowohl in der neurologischen Entwicklung und neurodegenerativen Erkrankungen zur Verfügung gestellt. Da Mitochondrien essentiell und von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung des Gehirns und Funktion sind, ist es zwingend notwendig, Protokolle zu entwickeln, die Veränderungen in der Hirn mitochondrialen Morphologie, Struktur, Größe, Anzahl und Verteilung unter den beiden gesunden und kranken Zustand zu analysieren. Mausmodelle mit mitochondrial-bezogene grün fluoreszierende Protein (GFP) wurden hergestellt , um die mitochondriale Bewegungen und Lokalisation im Gehirn 21,22 visualisieren. Dies ist zwar ein äußerst nützliches Werkzeug ist mitochondriale Motilität und allgemeine Verteilung zu untersuchen, gibt es einige Nachteile includ diee begrenzte Auflösung und Empfindlichkeit der Fluoreszenzmikroskopie. Diese Eigenschaften machen es schwierig, die relativ kleine Größe Mitochondrien zu verfolgen. In ähnlicher Weise wurde serielle Transmissions - Elektronenmikroskopie erfolgreich anzuzeigen synaptic Mitochondrien 23, jedoch ist dieses Verfahren sehr zeitraubend verwendet. Die mitochondriale Morphologie ist bekannt , sehr dynamisch, da sie kontinuierlich Spaltungs- und Fusionszyklen durchlaufen, und in den meisten Zellen Mitochondrien pflegen ein sehr verbundenes Netzwerk 24-26. Neuronen sind Zellen mit mehreren Dendriten und Axone erweitert stark polarisiert, und Mitochondrien , die einen angeschlossenen retikulären Netzwerk im Zellkörper bilden können , haben zu trennen , wie sie sich ihren Weg durch diese Neuriten (Abbildung 1). Dies macht Gehirn Mitochondrien sehr unterschiedlich in Größe und Form. Zum Beispiel haben wir serielle Block-face Rasterelektronenmikroskopie (SBFSEM) Technik, die zuvor beobachtet, daß die Differenz im Volumen oder die Größe der extrasynaptischen mitochondria an die Mitochondrien in den Nervenenden können so viel wie sechzehn 27 falten. Es gibt mehrere Ansätze für die Volumen Durchführung von Analysen 28, die TEM - Serien Abschnitt 30 29, automatisierte Band sammeln Ultramikrotom SEM umfasst, fokussierten Ionenstrahl SEM 31 und SBFSEM 32. Die SBFSEM Analyse hat Vorteile, dass es die Auflösung hat quantitative Daten über die morphologische Form, Größe, Verteilung und Anzahl von Organellen wie Mitochondrien in Bereichen von bis zu 1 mm des Gehirns zu ermöglichen. Der technische Betrieb ist auch die am wenigsten anspruchsvoll, mit Datenerfassung und Analyse innerhalb Fähigkeiten vieler biologischer Labors, die früheren EM Erfahrung fehlt. Das Aufkommen von kommerziellen Instrumenten für die serielle schnittartige Bilder zu erzeugen hat 3D ultrastrukturelle Analyse von Geweben aus einer Routine - Technik, die erlaubt weiterhin eine unvoreingenommene volumetrische Analyse in einer schnellen und wiederholbaren Weise 28 </sup&gt;. Die SBFSEM wurde zum ersten Mal mit dieser Technik auf dem Gebiet der Neurobiologie im Jahr 2004 32, basierend auf einer Idee , eingeführt durch Leighton seitdem etabliert haben als wichtiges Instrument bei der Rekonstruktion Analyse der neuronalen Schaltkreise 34 1981 33. Mehrere Studien beschrieben und verwendet. Darüber hinaus für viele kleinere Projekte, bietet es Rekonstruktionsanalyse Zellorganellen 27,35-39 zu identifizieren. Da werden die aufgenommenen Bilder von der Niederspannung zurück gestreute Elektronen abgeleitet, neue Färbeprotokollen , die unterschiedliche bekannte Schwermetall Färbetechniken kombinieren wurden die Auflösung 40 zu erhöhen , entwickelt. In diesem Beitrag stellen wir ein Protokoll für die 3D - Elektronenmikroskopie Bildgebung und volumetrische Analyse von Gehirn Mitochondrien Verwendung basierend auf Methoden, die von uns und haben andere 38,39,41 zuvor. Die Gewebenachbearbeitungsverfahren verwendet wurden , wie früher von Deerinck et al40.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J Mäuse</td><td>Jackson Labor&nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>VETone, Handelsname Fluriso</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Präpariertablett</td><td>Fisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td>Nr. S65105&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sezierschere</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Schmetterlingskanüle</td><td>Exel International</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Filter (0,45 Mikron)</td><td>EMD Millipore</td><td>NC0813356</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Schnittsystem</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Vibratome 3000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacodylat</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Gerbsäure</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanid</td><td>J.T. Baker</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid 4% Lösung</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazid</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>Bleinitrat</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 EMBEDDING KIT</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>Enthält Embed 812&nbsp; Harz, DDSA, NMA und DMP-30.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd 25% EM Grade Polysciences</td><td>Inc.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Propylenoxid</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Einbettungsform</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumprobenstift</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>Kolloidales Silber Flüssiger</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Rasierer</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber (Loctite Gel Control)</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Bau- und Bastelgeschäfte führen diesen Artikel</td></tr><tr><td>Leitfähiges Epoxidharz</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr><td>In-Kammer-Ultramikrotom für SEM</td><td>Gatan Inc.</td><td>3View2</td><td>Kann für andere REM ausgelegt werden</td></tr><tr><td>Trimmmikroskop für die Pin-Vorbereitung</td><td>Gatan Inc.</td><td>geliefert als Teil des 3View-Systems</td><td></td></tr><tr><td>Nieder-kV-Rückstreuelektronendetektor</td><td>von Gatan Inc.</td><td>3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/ Fidschi-Verarbeitungspaket&nbsp;</td><td>ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015<</td><td>a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/<</td></tr><tr>td colspan="4"><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a> </td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td></tr></tbody></table>

analyse mitochondrien von hirnzellen verwenden der seriellen block gesicht rasterelektronenmikroskopie



Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Das menschliche Gehirn ist ein hochenergieverbrauchende Organ, das in erster Linie auf Glucose als Energiequelle angewiesen ist. Glukose wird durch Gehirn Mitochondrien über Glykolyse, Tricarbonsäure (TCA) -Zyklus und oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Wege zu erzeugen zelluläre Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) abgebaut. Beeinträchtigung der mitochondrialen ATP-Produktion verursacht mitochondrialen Erkrankungen, die klinisch mit prominenten neurologischen und myopathischen Symptome präsentieren. Mitochondriale Defekte sind auch in der Entwicklung des Nervenstörungen (zB Autismus - Spektrum - Störung) und neurodegenerative Erkrankungen (zB Amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer und Parkinson-Erkrankungen). Somit besteht auf dem Gebiet ein erhöhtes Interesse für die Durchführung von 3D-Analyse von Mitochondrien-Morphologie, Struktur und Verteilung unter gesunden und Krankheitszuständen. Das Gehirn der mitochondrialen Morphologie ist äußerst vielfältig, mit einigen Mitochondrien vor allem inwobei die synaptische Region im Bereich von &lt;200 nm Durchmesser, die unterhalb der Auflösungsgrenze der herkömmlichen Lichtmikroskopie ist. Exprimieren eines mitochondrial-bezogene grün fluoreszierendes Protein (GFP) im Gehirn steigert signifikant die organellären Nachweis durch konfokale Mikroskopie. Allerdings ist es nicht überwinden die Einschränkungen auf die Empfindlichkeit der Detektion von relativ kleiner Größe Mitochondrien ohne die Bilder von großformatigen Mitochondrien Übersättigung. Während serielle Transmissions-Elektronenmikroskopie wurde erfolgreich auf neuronaler Synapsen zu charakterisieren Mitochondrien verwendet wurde, ist diese Technik sehr zeitaufwendig insbesondere, wenn mehrere Proben zu vergleichen. Die serielle Block-face Rasterelektronenmikroskopie (SBFSEM) Technik umfasst einen automatisierten Prozess der Schneiden, Bildgebungsblöcken von Gewebe und Datenerfassung. Hier stellen wir ein Protokoll SBFSEM einer definierten Region von Nagetier Gehirn durchzuführen, um schnell zu rekonstruieren und mitochondriale Morphologie visualisieren. Diese Technique könnte auch genaue Informationen zu liefern auf die mitochondriale Zahl, Volumen, Größe und Verteilung in einer definierten Region des Gehirns verwendet werden. Da die erhaltene Bildauflösung hoch ist (in der Regel unter 10 nm) jede grobe mitochondriale morphologische Defekte auch nachgewiesen werden können.

Wir zeigen, dass das Gehirn der mitochondrialen Morphologie und Größe in verschiedenen neuronalen Unterfächer heterogen ist. Die konfokale Mikroskopie auf niedriger Dichte neuronalen Kulturen transduziert mit Lentiviren mitochondrial-bezogene grün fluoreszierende Protein exprimieren , zeigten , dass die Mitochondrien in neuronalen soma Wohnsitz eines retikulären Netzwerk bilden, während diejenigen , die eine diskrete längliche Morphologie in distalen Neuriten zeigen Wohnsitz (Abb...

Mitochondriale Visualisierung und Analyse aus Säugetier-Hirngewebe ist eine herausfordernde Aufgabe. Hier beschreiben wir, wie die dreidimensionale (3D) Rekonstruktionsanalyse aus der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBFSEM) genutzt werden kann, um Einblicke in die morphologische und volumetrische Analyse dieser kritischen energieerzeugenden Organelle zu gewinnen.

Analyse Mitochondrien von Hirnzellen Verwenden der seriellen Block Gesicht Rasterelektronenmikroskopie

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Das übergeordnete Ziel der seriellen Blockflächen-Scanning-Elektronenmikroskopie besteht darin, die Morphologie, Struktur, Verteilung, das Volumen und die Anzahl von Mitochondrien in einem definierten Bereich des Maushirns zu analysieren. Diese Methode kann helfen, viele zentrale Fragen der Neurobiologie zu beantworten, beispielsweise, ob Veränderungen in der Struktur, Anzahl und Verteilung von Mitochondrien im Gehirn wesentlich zu neurodegenerativen und neurodevelopmentellen Erkrankungen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie den Prozess der Abbildung serieller Schnitte automatisiert, indem ein speziell angefertigtes Ultramikrotom in die Vakuumkammer des Rasterelektronenmikroskops integriert wird. Um das Experiment zu beginnen, waschen Sie das zuvor präparierte, mit Glutaraldehyd fixierte Gewebe dreimal für jeweils fünf Minuten in 0,1-molarer Cacodylat-Pufferlösung. Fixieren Sie das Gewebe anschließend mit 1 Milliliter Cacodylat-gepuffertem 0,1 %igen Tannin-Säure für 30 Minuten bei Raumtemperatur nach. Nach der Nachfixierung waschen Sie das Gewebe in Cacodylat-Puffer. Lösen Sie 0,3 Gramm Kaliumferrocyanid und 0,86 Gramm Natriumcacodylat in 10 Milliliter destilliertem Wasser auf. Unmittelbar vor der Verwendung 10 Milliliter 4 %iger Osmiumtetroxidlösung hinzufügen und die Gewebe 90 Minuten lang auf Eis mit einer 2 %igen Osmiumferrocyanidlösung anfärben. Nach der Färbung das Gewebe mit destilliertem Wasser waschen.Behandeln Sie die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit frisch zubereiteter 1%igen Thiocarbohydrazid- (TCH-)Lösung. Anschließend spülen Sie die Proben. Färben Sie danach das Gewebe eine Stunde lang mit 2%iger wässriger Osmiumtetroxidlösung.Nach der Färbung die Gewebe mit destilliertem Wasser waschen. Die Proben über Nacht bei 4 Grad Celsius in 1 % Uranylacetat in destilliertem Wasser inkubieren. Am nächsten Tag die Gewebe mit destilliertem Wasser abspülen und sie anschließend mit Welton's Blei-Aspartat-Färbung im Ofen inkubieren.Die bestmögliche Färbung von Geweben ist für die Bildgebung entscheidend, da eine schlechte Färbung zu einem Ladungsphänomen auf der Probe führt, das die Bildgebung erschwert oder unmöglich macht. Waschen Sie das Gewebe in destilliertem Wasser. Entwässern Sie die Proben durch eine abgestufte Alkoholreihe, indem Sie gekühlte Ethanol-Lösungen jeweils fünf Minuten lang verwenden, gefolgt von einer Dehydrierung mit 100 % Ethanol, die dreimal jeweils zehn Minuten durchgeführt wird.Die Proben zwei Mal jeweils 15 Minuten in Propylenoxid waschen. Die Gewebe in eine 1:1-Mischung aus Einbettungsharz und Propylenoxid geben, das Gefäß verschließen und die Gewebe über Nacht inkubieren. Nach zwei Stunden das Gefäß öffnen, sodass das Propylenoxid über einen Zeitraum von neun Stunden verdunstet.Überführen Sie die Gewebe in frisches Einbettungsharz (100 %) in sauberen Gefäßen für zwei Stunden. Einbetten Sie die Proben in frischem Einbettungsharz in flachen Formen mit bedruckten Papierschildern und härten Sie sie im Ofen aus. Nach einer Stunde überprüfen Sie die Positionierung und Ausrichtung des Gewebes und korrigieren Sie gegebenenfalls.Schneiden Sie die Proben auf den gewünschten Bereich zu und befestigen Sie sie mit einem gelartigen Cyanoacrylat-Superkleber auf einer Aluminiumnadel. Beschichten Sie anschließend die Probe rings um den Block mit kolloidalem Silberlack, um einen leitfähigen Pfad zur Aluminiumnadel herzustellen. Untersuchen Sie die Gewebeproben mithilfe eines Rasterelektronenmikroskops, das mit einer Ultramikrotomstufe im Probekammerbereich und einem Detektor für rückgestreute Elektronen bei niedriger Kilovoltspannung ausgestattet ist.Bilden Sie die Proben mit diesen Einstellungen ab. Beginnen Sie die Analyse, indem Sie nacheinander Bild, Typ und dann 8-Bit auswählen, um die Bilder vom ursprünglichen proprietären 16-Bit- in das 8-Bit-TIFF-Format umzuwandeln. Falls die automatische Kontrast- und/oder Helligkeitsumwandlung während dieses Schritts für die Bilder nicht ideal ist, öffnen Sie die 16-Bit-Bilder erneut und drücken Sie Bild, Anpassen, Helligkeit/Kontrast.Wählen Sie einen Bereich aus, der für alle Bilder geeignet ist, und klicken Sie auf „Apply“. Führen Sie anschließend die Konvertierung durch. Falls zwischen den Schichten eine inakzeptable Bildbewegung aufgetreten ist, richten Sie die Bildstapel aus, indem Sie nacheinander Plugins, Registration und Linear Stack Alignment with SIFT auswählen, und stellen Sie die Ausrichtung auf den „translation-only“-Modus statt auf „rigid body“ ein.Vergrößern Sie die Leinwandgröße vor der Registrierung, indem Sie Bild, Anpassen, Leinwandgröße auswählen. Alternativ können Sie das Bild auf einen Bereich von Interesse verkleinern, indem Sie den gewünschten Bereich auswählen und anschließend zuschneiden. Falls erforderlich, skalieren Sie die Bilder mit ImageJ auf eine kleinere, überschaubarere Größe und wählen dann Bild und Skalieren.Mittels konfokaler Mikroskopie an neuronalen Kulturen mit geringer Dichte zeigte sich, dass Mitochondrien im neuronalen Soma ein retikuläres Netzwerk bilden, während jene in distalen Neuriten eine diskrete, gestreckte Morphologie aufweisen. Mithilfe der seriellen Blockflächen-Scanning-Elektronenmikroskopie, oder SBFSEM-Technik, konnten Mitochondrien, Dendriten und axonale Varikositäten im Maushirn eindeutig beobachtet werden. Dreitägige Rekonstruktionen von Mitochondrien in den Neuriten von Maushirngewebe zeigten einen Größenunterschied zwischen dendritischen und axonalen Mitochondrien. Die aus einem repräsentativen 2-D-SBFSEM-Bild extrahierten Daten zeigten, dass das Volumen oder die Größe von Mitochondrien in den neuronalen präsynaptischen Bereichen signifikant kleiner war als diejenige von Mitochondrien im extrasynaptischen Bereich. Die mittels SBFSEM-Analyse gewonnenen Bilder bieten eine verbesserte Auflösung, um die ultrastrukturellen Merkmale einzelner Mitochondrien sichtbar zu machen. Es ist möglich, den zellulären Kompartimenttyp von Mitochondrien zu klassifizieren, indem man deren räumliche Nähe zu leicht erkennbaren Strukturen bestimmt, wie beispielsweise nicht-synaptischen somatischen Mitochondrien und präsynaptischen Mitochondrien.Diese Technik kann in etwa sieben Tagen durchgeführt werden, wozu drei Tage Färbung, zwei Tage für das Aushärten des Harzes, ein Tag für die Bildaufnahme zur Erzeugung eines für diese Analyse geeigneten Stapels und etwa zwei bis vier Stunden für die Bildnachbearbeitung zur Vorbereitung der Analyse gehören. Dieses Verfahren kann auch in Kombination mit anderen Methoden zur Abbildung von Mitochondrien verwendet werden, beispielsweise Live-Abbildung mit genetisch markierten Mitochondrien, um Fragen zur mitochondrialen Transportbewegung sowie zu den Dynamiken ihrer Teilung und Fusion zu beantworten.

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Quelle: Mukherjee, K., et. al. Analyse von Hirnmitochondrien mittels serieller Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie. J. Vis. exp. (2016)Dieses Video zeigt die Vorbereitung,  Bildgebung und Analyse von Hirngewebe von Mäusen mit einem seriellen Block-Face-Rasterelektronenmikroskop (SBFSEM) zur Visualisierung der mitochondrialen Ultrastruktur, die eine präzise Kartierung ihrer Morphologie und räumlichen Verteilung in axonalen und dendritischen neuronalen Kompartimenten ermöglicht.

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