Name: Aufzucht der Fruit Fly Drosophila melanogaster Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Lernen Sie die Aufzucht von Drosophila melanogaster unter axenischen und gnotobiotischen Bedingungen. Diese Methode ermöglicht die Kontrolle und Manipulation der Mikrobiota für Studien zu Wirtsmerkmalen.

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Einige Details dieses Protokoll wurden mit Unterstützung von Dr. Adam Dobson optimiert, der auch hilfreiche Kommentare zum Manuskript zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Stiftung für die National Institutes of Health (FNIH) Gewährungsnummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD und AED) unterstützt wurde. FNIH Gewährungsnummer 1F32GM099374-01 (PDN) und Brigham Young University Startfonds (JMC, MLK, MV). Publikationskosten wurden von der Brigham Young University College of Life Sciences und Department of Plant and Wildlife Sciences unterstützt.

1. Kultur Bakterien (Start ~ 1 Woche vor der Eier Picking) <ol><li> Bereiten modifizierten MRS 20 (MMRs) -Platten und Brühe Rohre (Tabelle 1). Gießen Sie 20 ml MMRS Agar in jede 100 mm Petrischale und erlauben / trocken über Nacht abkühlen, oder 5 ml MMRS Brühe in 18 mm-Teströhrchen. </li><li> Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis und L. plantarum auf MMRS Agarplatten. Inkubieren Acetobacter über Nacht bei 30 ° C. Inkubieren Lactobacillus anaerob durch die Platten in einem luftdichten Behälter und Flutung mit Kohlendioxid Platzierung vor dem Versiegeln. über Nacht bei 30 ° C inkubieren. Anmerkung: L. brevis Kolonien kann bis 24-48 h nicht sichtbar sein. Platten können bei 4 ° C gelagert werden, und Kolonien können für bis zu 3 Wochen verwendet werden. </li><li> Zwei bis drei Tage vor dechorionated Eier sterile Ernährung (Abschnitt 5) zu übertragen, wählen Sie eine einzelne Kolonie von der MMRS Platte in ein Reagenzglas conTaining MMRS Brühe. Wachsen Acetobacter unter Schütteln und wachsen Lactobacillus statisch für 24 Stunden oder bis zur Trübung, die beide bei 30 ° C. </li></ol> 2. Bereiten Sie Sterile Diät <ol><li> Bereiten sterile Diät (Tabelle 2) in einem 2 l Erlenmeyerkolben. Mikrowellen die Diät, bis er drei aufeinanderfolgende mal gekocht hat; mischen zwischen jedem Kochen in. </li><li> Der Kolben wird auf einer Rührplatte unter Rühren zu halten, während Ernährung konischen Zentrifugenröhrchen übertragen. Übertragen 7,5 ml Diät zu 50 ml Zentrifugenröhrchen. Kappe lose die Rohre, und in einem überdachten, autoklavierbar Polypropylen-Rack. </li><li> Sterilisieren Fliegendiät einem Autoklaven bei 121 ° C und 15 psi für 25 min verwendet wird. Entfernen Sie Racks von Autoklaven und sofort jedes Rack horizontal schütteln Diät, um sicherzustellen, nicht trennen während der Abkühlung. Seien Sie vorsichtig, um nicht die Racks schütteln vertikal Übertragung der Ernährung auf den Deckel oder Ränder der Rohre zu verhindern. Lassen Sie die Diät auf einem Schüttler abkühlen für genau 45 Minuten undschütteln wieder die Diät horizontal von Hand. Note: Diät für bis zu einer Woche bei 4-15 ° C gelagert werden. </li><li> Als Alternative zur Verwendung abgedeckt autoklavierbar Racks (Schritte 2.1-2.3) oder Fliegen auf Diäten Konservierungsmittel enthalten, Säure zu erhöhen, führen Sie die folgenden Schritte aus: <ol><li> Bereiten Sie 1 L flüssige Nahrung in einem 2-Liter-Kolben mit einem Rührstab in den Kolben. Autoclave die Diät. </li><li> Nach dem Autoklavieren wurden 10 ml Konservierungsmittel hinzufügen und kontinuierlich auf einem beheizten Rührplatte rühren. Wenn der Agar auf 50-60 ° C abgekühlt ist, in einem Bio-Sicherheitsschrank den Kolben mit einem beheizten Rührplatte bewegen und Kolbentemperatur durch Erhitzen auf 50 bis 60 ° C halten. </li><li> Im Biosicherheitsschrank, pipettieren ~ 7,5 ml einzeln in konische Röhrchen. </li></ol></li></ol> 3. Bereiten Sie Eiablage Cages <ol><li> Machen Sie Traubensaftes Agarplatten durch microwaving 100 ml Wasser, 10 g Bierhefe, 10 g Glucose und 1 g Agar-Agar. Zum Kochen bringen 3 mal in Schritt 1.1 und fügen Sie 10 g gefrorene Traubensaft concentrate, um die Sichtbarkeit der Eier auf der Agarplatte erhöhen. </li><li> Wenn Agar auf 55 ° C abgekühlt ist, gieße 20 ml in 100 mm Petrischalen und Erstarren lassen. </li><li> Decken Sie die Oberfläche der Agarplatten mit einer Hefe-Paste durch Mischen von 1 g Bierhefe mit 15 g Wasser. Gießen Sie Hefe Paste auf die Agar-Platte machen, dass die Oberfläche bedeckt ist, dann das überschüssige abgießen, einen dünnen Hefe Rückstände zu hinterlassen hinter. Wenn mehrere Platten verwendet werden, kann die Paste der Reihe nach auf mehrere Platten gegossen werden. </li><li> Übertragen Agarplatten in den Boden eines Käfigs. Hinweis: Ein 32 Unzen deli Behälter ein guter Ersatz für Acrylfliegenkäfigen ist. <ol><li> Machen Deckel für 32 Unzen deli Behälter durch ein Loch in der oberen Schneide- und eine atmungsaktive Mesh über das Loch mit ungiftigen Leim geklebt wird. Wenn der Kleber auf den Deckel der Einwirkung von Wasser wasserlöslich verhindern. </li></ol></li><li> Transfer 200-300 fliegt in den Behälter und Deckel mit Deckel. Decken Sie die Mesh-geschützten Loch mit einer leeren Petrischale Deckel Prevent Verdampfung von der Agar-Oberfläche und fügen Sie ein feuchtes Tissue-Papier im Inneren des Deckels, falls gewünscht. Inkubieren Fliegen bei 25 ° C über Nacht für 16-20 Std. </li></ol> 4. Sammeln Eier <ol><li> Bereiten Sie ein Sieb für Eiersammlung von Nylon-Mesh in eine Kunststoffbuchse platzieren. </li><li> Um die Platte mit Eiern auf sie abrufen, entfernen Sie fliegt aus dem Käfig durch in einen leeren Behälter zu übertragen. Wenn gleiche Fliegen wird am nächsten Tag verwendet werden, unverzüglich in einen neuen Käfig ein frisch yeasted Traubensaftes Agar-Platte enthält. Fliegen können für 3-5 aufeinander folgenden Tagen verwendet werden </li><li> Entfernen Sie tote Fliegen aus dem Agar mit einem sauberen Pinsel, achten Sie darauf, das Agar nicht zerbrechen. </li><li> Sammeln Sie Eier durch die Agar-Platte mit destilliertem Wasser gespült, sanft Eier von der Agar-Oberfläche, und Gießen des Schlamms über die Maschen zu bürsten. Wiederholen 3-4 mal, bis alle oder die meisten der Eier von der Agarplatte entfernt wurden. </li></ol> 5. Dechorionate Eier und Transfer zum Sterile DIET <ol><li> Bereiten Sie die Biosicherheitsschrank durch das Innere Spritzen (einschließlich Seiten) mit 70% Ethanol. Wischen Sie den Boden mit einem Labor Gewebe und sterilisieren Sie die Haube mit UV-Licht für ~ 15 min. Sterilisieren alle nicht-biologische Vorräte (Probenbecher, Pinsel, Pinzetten, Abfallbehälter, 400 ml sterilisiertem Wasser und 100 ml 0,6% Natriumhypochlorit) durch mit Ethanol Spritzen und sofort in der Biosicherheitsschrank platzieren. Sterilisieren mit UV-Licht für 15 min. </li><li> Starten Sie das erste von 2 Natriumhypochlorit wäscht durch die Buchse mit den Eiern Platzierung in ein 120 ml Probenbecher oder einem anderen sterilen Behälter. gießen langsam ~ 90 ml 0,6% iger Natriumhypochloritlösung in die Hülse bis kurz unterhalb des Randes. </li><li> Spülen Sie Eier für 2,5 min. resuspendieren Sie regelmäßig die Eier mit einer Zange mit der Hülse nach oben und unten in der Hypochlorit-Lösung zu bewegen. </li><li> Übertragen Sie die Buchse direkt in eine zweite Probenbecher, vorgefüllt mit 90 ml Bleichmittel, im Inneren des Biosicherheitsschrank. </li><li> WiederholenSchritt 5.3 innerhalb des Biosicherheitsschrank. Am Ende des zweiten Bleichbehandlung sollten die Eier beginnen an den Seiten der Buchse zu halten. </li><li> Führen Sie die Schritte 5,7-5,8 im Biosicherheitsschrank. </li><li> Entsorgen Sie das Bleichmittel und waschen Sie die Buchse mit sterilem Wasser 3 mal. Re-suspend die Eier mehrmals während jeder Wäsche durch die Buchse mit einer Pinzette zu bewegen. Bis zum Ende der dritten Wasch meisten Eier sollte an der Seite der Buchse angebracht werden. </li><li> Mit einem Pinsel in Ethanol sterilisiert, übertragen Eier von der Seite der Buchse in die sterile Ernährung. Übertragen Eier einzeln oder in kleinen Chargen. Ziel ist es für 30 bis 50 Eier pro Fläschchen. Lassen Sie die Kappen lose, damit Sauerstoff in das Rohr einzutreten. Wenn Fläschchen bleiben axenic sind, übertragen auf einen Insekten Inkubator; Andernfalls fügen Sie wie unten Bakterien. </li></ol> 6. Stellen Sie gnotobiotische Fliegen Unter Verwendung von 4 Bakterienart <ol><li> bereiten Bakterien <ol><li> Bereiten Sie eine sterilisierte Biosicherheitsschrank mit notwendigen Materialien (pipettes, Pipettenspitze Boxen, sterilisierte Zentrifugenröhrchen, MRS-Brühe und Reagenzglasständer), wie in Schritt 4.1. Wischen Sie die Außenseite der Reagenzgläser mit einem Ethanol-getränkten Labor wischen, bevor in Biosicherheitswerkbank platzieren. </li><li> Pellet die Bakterien, indem zunächst 500 ul Wachstum über Nacht in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Wenn Bakteriendichte niedrig ist, zu jedem Röhrchen auf 1,5 ml oder sequenziell Überstand entfernen und zusätzliche Kultur das gleiche Rohr hinzuzufügen. Entfernen Proben aus der Biosicherheitsschrank und Zentrifuge für 10 min bei 10.000 x g. Verwenden Filterspitzen Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden. </li><li> Bestimmen Sie die Dichte jeder Kultur von OD 600 gemessen wird . Wenn eine Multi-Well-Platten-Lesegerät verwenden, übertragen 200 ul jeder Kultur auf eine 96-Well-Platte in 1-, 2- und 4-fach-Verdünnungen. </li><li> Bestimmung der Menge an MMRS in dem jede Zellpellet (5.2.2) mit einem Plattenlese-Spektralphotometer und die folgenden Gleichungen zu verdünnen. Planen Sie genug Brühe hinzufügen 50 &amp; zu impfen# 956; l zu jedem Fliegen Fläschchen. <ol><li> Sammeln OD 600 Ablesungen für ein 1: 1, 1: 2 und 1: 4 - Verdünnung jeder Bakterienkultur auf einem Plattenlese - Spektralphotometer. Wählen Sie die Verdünnung für jeden Bakterienstamm, der einen OD 600 - Wert zwischen 0,1 und 0,2 und verwenden diesen Wert und den entsprechenden Verdünnungsfaktor als &quot;O&quot; produziert und &#39;D&#39; in den angegebenen Formeln in 6.1.4.2 oder 6.1.4.3. </li><li> Wenn hier beschrieben mit den 4 Arten, normalisieren Zellen in äquivalente koloniebildende Einheit (CFU) / ml Dichte (OD 600 bis CFU Umwandlung bestimmt vorher 20) mit Hilfe dieser Gleichung: E = ((OB) x V x D) / C wobei E = Volumen Pellet in (ul) zu suspendieren, O = OD 600 Bakterien, B = OD 600 leere Medien, D = fach-Verdünnung, V = &amp; mgr; l Bakterienkultur vor der Zentrifugation, C = OD 600 von vorgegebenen konstant. Siehe Ergänzenden Code Beispiele für Berechnungen Datei diese Gleichungen. Für Spektrophotometers, die automatisch leer, &quot;O&quot; anstelle von &quot;OB&quot; zu verwenden. Anmerkung: Die vorbestimmten Konstanten (units OD 600, normiert auf 10 7 CFU ml -1, abgeleitete Konstanten in 20) sind wie folgt: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077). </li><li> Wenn andere Bakterienarten verwenden (keine CFU / OD 600 konstant zur Verfügung steht), Dichte normalisieren 600 = 0,1 unter Verwendung dieser Gleichung OD: E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600 Anmerkung: Einheiten sind die gleichen wie in Schritt 6.1.4.2. Siehe Ergänzenden Code Beispiele für Berechnungen Datei diese Gleichungen. </li></ol></li><li> Im Biosicherheitsschrank entfernen Überstand mit einer Pipettenspitze und das Pellet in frischem MMRS oder PBS, wie in Schritt 6.1.4.2 berechnet. </li></ol></li><li> Impfen Bakterien <ol><li> Transfer 50 &amp; mgr; l der Bakterien an die konische Röhrchen mit sterilem Diät eined dechorionated Eier in Biosicherheitsschrank. In Bakterien nach Eitransfer Kontamination zwischen den Fläschchen zu verhindern. </li><li> Platzieren inokulierten Röhrchen in einem Inkubator bei 25 ° C </li></ol></li></ol> 7. Messen CFU Last / Test für Sterilitäts <ol><li> Zur Messung der CFU Belastung in ganzen Körper fliegen Homogenate, Transfer 5 Fliegen (5-7 Tage nach dem Schlüpfen) zu einem 1,7-ml-Mikroröhrchen mit 125 ul Keramikperlen und 125 &amp; mgr; l MMRS Brühe. Homogenisieren fliegt ein Gewebe-Homogenisator für 30 Sekunden bei 4,0 m / s verwendet wird. <ol><li> Alternativ auslassen Perlen und Hand in Mikrozentrifugenröhrchen mit Kunststoff Stampfen für 1 min homogenisieren. </li><li> Wenn die Darmflora zu quantifizieren, die Oberfläche , die Fliegen zu sterilisieren , um exogene Mikroben 22 zu entfernen. Transfer fliegt in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 100 &amp; mgr; l 70% Ethanol für 1 min, absaugen Ethanol und Transfer in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen für Homogenisierungen. Wenn der DNA-Gehalt des Darms werden gemessen wird, spülen foder 1 min mit 0,6% Natriumhypochlorit vor dem Ethanol waschen. </li></ol></li><li> Verdünnen Sie das Homogenat mit 875 &amp; mgr; l MMRS, Wirbel für 5 Sekunden, und pipettieren 120 ul Homogenat in die erste Vertiefung einer Mikrotiterplatte. </li><li> Führen Sie zwei aufeinanderfolgenden 1: 8 Verdünnungen unter Verwendung von 10 &amp; mgr; l Homogenat und 70 &amp; mgr; l MRS in den nächsten zwei Brunnen. <ol><li> Entfernen Sie 10 ul aus der ersten Vertiefung und fügen Sie ihn in die zweite Vertiefung mit 70 &amp; mgr; l MRS. Mischen Sie den Inhalt des zweiten und gründlich, Transfer 10 ul aus dem zweiten und dem dritten Vertiefung mit 70 &amp; mgr; l MRS und gründlich mischen. Dies führt zu 3 Gesamtkonzentrationen der ursprünglichen 1000 ul Homogenat: unverdünnt, 1: 8 und 1:64. </li></ol></li><li> Transfer 10 ul jeder Verdünnung auf eine MMRS Platte (ein Mehrkanal-Pipette, wenn gewünscht). Etwas das Gericht neigen die Verdünnung mehrere Millimeter auf der Agar-Oberfläche zu verteilen und Flüssigkeit, bevor die Platte trocknen lassen. Die Flüssigkeit trocknet auf the Platte schnell, wenn die Platten 2 Tage alt sind, von zwei benachbarten Tröpfchen reduziert Mischung. </li><li> Inkubieren bei 30 ° C für 1-2 Tage. Entfernen Platten aus dem Inkubator einmal deutlich, einzelne Kolonien sichtbar sind, und zählen von einer Verdünnung mit 10-100 isolierte Kolonien. </li><li> Berechnen CFU pro Fliege unter Verwendung der Gleichung E = C x D / P x V / F, wobei E = CFU pro Fliege, C = Anzahl der Kolonien gezählt, D = Verdünnungs, P = &amp; mgr; l ausplattiert, V = Volumen des Fliegen Homogenat und F = Anzahl der Fliegen homogenisiert. </li></ol>

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<li>Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+Drosophila+melanogaster+wing+morphology%3A+effects+of+sex%2C+temperature+and+density%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density.</a> Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).</li>
<li>Edward, D. A., Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+effects+of+developmental+environment+on+reproductive+trait+expression+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster.</a> Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).</li>
<li>Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+resident+microbiota+on+the+nutritional+phenotype+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 7 (5), e36765(2012).</li>
<li>Newell, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+function+and+comparative+genomic+analyses+of+the+Drosophila+gut+microbiota+identify+candidate+symbiosis+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors.</a> Front Microbiol. 5, 576(2014).</li>
<li>Dewhirst, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+the+defined+murine+microbiota%3A+altered+Schaedler+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora.</a> Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).</li>
<li>Min, K. T., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia%2C+normally+a+symbiont+of+Drosophila%2C+can+be+virulent%2C+causing+degeneration+and+early+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Das hier beschriebene Verfahren ist eines von mehreren Ansätzen für Embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, zusammen mit alternativen Methoden der axenic Fliegen Aufzucht, einschließlich der seriellen Übertragung von axenic Erwachsene 18,27 oder Antibiotika - Behandlung 13,18. Andere dechorionation Methoden schließen Ethanol wäscht und reduzieren 11,25,26 oder 8 Hypochlorit Behandlung verlängern. Verschiedene Waschschritte helfen können verschiedene Fliegen Ge...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/54219/rearing-fruit-fly-drosophila-melanogaster-under-axenic-gnotobiotic">Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions</a>. The Protocol was updated.
Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation: 
E = ((O-B) x V x D)/C 
where E = volume to resuspend pellet in (&#956;l), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = &#181;l bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use &#34;O&#34; in place of &#34;O-B&#34;. 
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
to:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation: 
E = ((O-B) x V x D)/C 
where E = volume to resuspend pellet in (&#956;l), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = &#181;l bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use &#34;O&#34; in place of &#34;O-B&#34;. 
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/54219/rearing-fruit-fly-drosophila-melanogaster-under-axenic-gnotobiotic">Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions</a>. The Protocol was updated.

Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Die meisten Tiere sind eng mit Bakterien ( &#39;Mikrobiota&#39;) von der Geburt bis zum Tod 1 verbunden. Vergleiche von Mikroorganismen frei ( &#39;axenic&#39;) und Mikroorganismen verbunden sind ( &quot;konventionelle&quot;) Tiere haben Mikroben verschiedene Aspekte der Tiergesundheit beeinflussen gezeigt, einschließlich Stoffwechsel, Ernährung, Kreislauf-, Leber-, Atemwegserkrankungen, immunologische, endokrine und neurologische Funktion 2. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein Schlüsselmodell für 3,4 in Gegenwart von Mikroben viele dieser Prozesse verstehen und Mikrobiota Einfluss auf die Tiergesundheit 5,6 für das Studium. Keine Bakterienarten ist in jedem einzelnen ( &quot;Core&quot;), aber Acetobacter und Lactobacillus - Arten , die Mikrobiota sowohl im Labor aufgezogen und wild gefangenen D. numerisch dominieren melanogaster. Andere Acetobacteraceae (einschließlich Komagataeibacter und Gluconobacter), Firmicutes (wie Enterococcus und Leuconostoc) und Enterobacteriaceae sind häufig entweder in Drosophila Individuen in geringer Menge vorhanden, oder unregelmäßig in hohen Fülle 12.07. Die Mikrobiota von Drosophila und Säugetieren 14,19 innerhalb und zwischen den Generationen inkonstant. Mikrobiota Unbeständigkeit kann zu phänotypischen Rauschen führen, wenn Mikrobiota abhängigen Merkmale zu messen. Zum Beispiel kann der Acetobacteraceae Einfluss Lipid (Triglycerid) Lagerung in Drosophila 15-18. Wenn Acetobacteraceae häufiger in Fliegen eines Fläschchens sind als in einem anderen 19 kann isogenen Fliegen unterschiedlichen Phänotypen 20 haben. Eine Lösung für das Problem der Mikrobiota Unbeständigkeit bei Mäusen 14 hat sich seit den 1960er Jahren in der Praxis gewesen, indem eine definierte Gemeinschaft von 8 dominanten mikrobiellen Spezies Maus Welpen jede neue Generation (veränderte Schädler Flora) die Einführung,sicherzustellen, dass jeder Welpe den gleichen Schlüssel Mitglieder der Maus Mikrobiota ausgesetzt ist. Diese Praxis steuert für microbiota Zusammensetzung selbst wenn der Mikrobioten nicht das primäre Ziel der Studie 32 und setzt Präzedenzfall das Vorhandensein von Schlüssel Mikroben in einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu gewährleisten. Um den Einfluss von Mikroben auf Drosophila Ernährung, verschiedene Protokolle zur Ableitung axenic Fliegenlinien definieren , wurden entwickelt, einschließlich Hypochlorit dechorionation von Embryonen (entweder abgeleitet de novo jeder Generation oder generations durch Übertragung auf sterile Nahrung gehalten) und Antibiotika - Behandlung 13. Es gibt Vorteile für unterschiedliche Ansätze, wie die Leichtigkeit und die Schnelligkeit für die beiden Antibiotika - Behandlung und eine serielle Übertragung, im Vergleich zu mehr Kontrolle über Störvariablen mit de novo dechorionation (zB Eierdichte, Rest kontaminierenden Mikroben, off-target antibiotische Wirkung). Unabhängig von der Methode derVorbereitung, Einführung bestimmter Mikrobenarten Embryonen Axenische erlaubt Kultur von Drosophila mit definierten ( &#39;gnotobiotischer&#39;) Gemeinden. Alternativ imitiert die Verwendung von Schädler Flora könnte diese Gemeinschaft zu konventionell gelegte Eier (entsprechend den Schritten 6-7 nur) geimpft werden, um die Anwesenheit von Charakterzug beeinflussenden Mikroben in jedem Fläschchen und vermeiden Komplikationen der Mikrobiota Unbeständigkeit zu gewährleisten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die durch de novo dechorionation von Embryonen axenischen und gnotobiotischen Drosophila Anheben und zur Bestätigung der Anwesenheit von eingeführt oder kontaminierende mikrobiellen Taxa.

<table><tbody><tr><td>Bierhefe</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>903312</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158968-3KG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher--Lab Scientific</td><td>fly802010</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177</td></tr><tr><td>Welch's 100% Traubensaftkonzentrat</td><td>Walmart oder andere Lebensmittelgeschäfte</td><td>9116196</td><td>http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406</td></tr><tr><td>Käfig: 32 oz. Durchscheinender runder Feinkostbehälter</td><td>Webstaurant Store</td><td>999L5032Y</td><td>http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html</td></tr><tr><td>durchscheinender runder Feinkostbehälterdeckel</td><td>Webstaurant Store</td><td>999YNL500</td><td>http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html</td></tr><tr><td>Lagerflaschen</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130</td></tr><tr><td>Droso-Plugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-101</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101</td></tr><tr><td>Nylon Mesh</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102&nbsp;</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102</td></tr><tr><td>Kunststoff-Buchse</td><td>Home Depot</td><td>100404002</td><td>http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002</td></tr><tr><td>Kunststoff-Buchsenkappe</td><td>Home Depot</td><td>100153897</td><td>http://www.homedepot.com/p/1-1-4-in-starr-Kunststoff-isolierte-Buchse-2-Pack-27529/100153897</td></tr><tr><td>Probenbecher</td><td>MedSupply Partners</td><td>K01-207067</td><td>http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html</td></tr><tr><td>Repeater M4</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html</td></tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>TrueLine Zentrifugenröhrchen</td><td>TR2003</td><td>https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003</td></tr><tr><td>Food Boxen</td><td>USA Wissenschaftlich</td><td>2316-5001</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001</td></tr><tr><td>Lysing Matrix D Bulk</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>116540434</td><td>http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search</td></tr><tr><td>Filter-Pipettenspitzen, 300 &mu; l</td><td>USA Scientific</td><td>1120-9810</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810</td></tr><tr><td>Verkauf von Petrischalen Laborprodukten</td><td>M089303</td><td>https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, INC.</td><td>2701</td><td>http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88</td></tr><tr><td>Pinsel</td><td>Walmart</td><td>5133</td><td>http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fisher</td><td>08-882</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693</td></tr><tr><td>Haushaltsbleiche (6-8% Hypochlorit)</td><td>Walmart</td><td>550646751</td><td>http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295</td></tr><tr><td>Universal Pepton</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-260</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>&nbsp; Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500</td></tr><tr><td>Dikaliumphosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-1KG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&amp; 
N=0& mode=match%20partialmax& lang= 
DE& region=US& focus=product</td></tr><tr><td>Ammonium Citrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>25102-500g</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N 
=0& mode=match%20partialmax& lang= 
DE& region=US& focus=product</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>VWR</td><td>97061-994</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500</td></tr><tr><td>Mangansulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10034-96-5</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match 
%20partimax& lang=de& region =US& focus=product</td></tr><tr><td>MRS Powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69966-500G</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>96 Well Plate Reader</td><td>BioTek (Epoch)&nbsp;</td><td>NA</td><td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_ spectrophotometer.html</td></tr><tr><td>1,7 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500</td></tr><tr><td>Filter-Pipettenspitzen, 1.000 μm; l</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830</td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/ 13243/</td></tr><tr><td>Keramikperlen</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>6540-434</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434</td></tr><tr><td>Gewebe-Homogenisator</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>116004500</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500</td></tr><tr><td>BioSicherheitswerkbank Klasse 1</td><td>Thermo Scientific</td><td>Modell 1395</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html</td></tr></tbody></table>

aufzucht der fruit fly<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; unter axenic und gnotobiotische bedingungen

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Der Einfluss von Mikroben auf unzählige Eigenschaften und Verhaltensweisen von Tieren wurde in den letzten Jahren zunehmend erkannt. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein Modell zum Verständnis mikrobieller Interaktionen mit tierischen Wirten, das durch Ansätze zur Aufzucht großer Stichprobengrößen von Drosophila unter mikroorganismenfreien (axenischen) Bedingungen oder mit definierten mikrobiellen Gemeinschaften (gnotobiotisch) erleichtert wird. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Entnahme von Drosophila-Embryonen, zur Hypochlorit-Dechorionierung und -Sterilisation und zur Überführung in die sterile Nahrung. Sterilisierte Embryonen werden in 50-ml-Zentrifugenröhrchen steril gefüttert, und die sich entwickelnden Larven und erwachsenen Tiere bleiben bis zum Öffnen der Fläschchen frei von exogenen Mikroben. Alternativ können Fliegen mit einer definierten Mikrobiota aufgezogen werden, indem steriles Futter und Embryonen mit mikrobiellen Spezies von Interesse geimpft werden. Wir beschreiben die Einführung von 4 Bakterienarten, um eine repräsentative gnotobiotische Mikrobiota in Drosophila zu etablieren.Schließlich beschreiben wir Ansätze zur Bestätigung der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft, einschließlich der Prüfung, ob axenische Drosophila bis ins Erwachsenenalter bakterienfrei bleiben.

Erfolgreiche Aufzucht von axenic Fliegen wird durch Isolierung ohne KBE von Ganzkörper - Homogenisierungen von D. bestätigt melanogaster Erwachsenen (Abbildung 1). Alternativ, wenn das plattierte Homogenat Kolonien ergibt, werden die Vials kontaminiert und muss entsorgt werden. Für gnotobiotischen Fliegen wurden jeden der vier Bakterien Isolate aus Pools von 5 erwachsenen Männchen getrennt, Unterschiede in Gesamtkeim CFUs demonstrieren mit erwachsenen F...

Verfahren zur Aufzucht von Drosophila melanogaster unter axenic und gnotobiotischer Bedingungen vorgestellt. Fly Embryonen werden in Natriumhypochlorit, aseptisch in sterile Ernährung dechorionated und aufgezogen in geschlossenen Behältern. Impfen Ernährung und Embryonen mit Bakterien führt zu gnotobiotischer Verbänden und bakterielle Präsenz wird durch Plattierung Ganzkörper- Drosophila Homogenate bestätigt.

Aufzucht der Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Fruchtfliegen heranzuziehen, die frei von assoziierten Mikroorganismen sind. Diese Methode kann jedem Forscher im Bereich Drosophila helfen, die Mikrobiota zu kontrollieren, zu manipulieren oder zu untersuchen, einschließlich ihrer Beziehung zu verschiedenen Wirtseigenschaften. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie es Forschern ermöglicht, Fruchtfliegen vollständig ohne äußere Mikroorganismen aufzuziehen.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Sterilisations- und Spülschritte durchgeführt werden müssen, ohne dass kontaminierende Mikroben eingebracht werden. Um das Experiment zu beginnen, werden zuvor hergestellte Kulturen auf modifizierten MRS- oder mMRS-Agarplatten ausgestrichen. Die Platten werden über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubiert.Brüten Sie anaerobe Kulturen in einem luftdichten Behälter und spülen Sie diesen vor dem Verschließen mit Kohlendioxid. Am nächsten Tag entnehmen Sie eine einzelne Kolonie von der mMRS-Platte in ein Reagenzglas mit mMRS-Brühe. Kultivieren Sie Lactobacillus-Arten unter stationären Bedingungen und Acetobacter-Arten unter Schütteln.

rearing-fruit-fly-drosophila-melanogaster-under-axenic-gnotobiotic

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Der Drosophila-Embryo ist von schützenden äußeren Membranen umgeben. Um Zugang zum Embryo zu erhalten, wird oft das Chorion – die äußerste der Membranen – entfernt. Dieses Video beschreibt eine häufig verwendete Methode der Dechorionierung mit Natriumhypochlorit. Das Beispielprotokoll demonstriert das Verfahren unter Anwendung steriler Techniken, die für die axenische oder gnotobiotische Tieraufzucht erforderlich sind.

Drosophila Eizellentnahme und Dechorionierung: Eine Methode zur Entfernung der äußersten Eischicht

Drosophila-Mikrobiota beeinflusst die Entwicklung, Immunität und Physiologie des Tieres. Dieses Video beschreibt eine Methode zur Quantifizierung von Bakterien aus Fliegen durch Bestimmung der koloniebildenden Einheiten aus Ganzkörperpräparaten. Das vorgestellte Protokoll demonstriert die Technik mit Fliegen, die unter gnotobiotischen Bedingungen unter Verwendung von vier Bakterienarten aufgezogen werden.

Zählung von koloniebildenden Einheiten (KBE): Quantifizierung von Bakterien aus Fliegenkörpern

Quelle: Siva-Jothy, J. A., et al. Orale bakterielle Infektion und Ausscheidung bei Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)Das Video zeigt die orale Infektion von Drosophila melanogaster mit pathogenen Bakterien. Dazu gehört die Herstellung von Infektionsfläschchen und der Transfer ausgehungerter Fliegen, um die Bakterienaufnahme zu ermöglichen. Das Verfahren erfasst die Darmbesiedlung, gefolgt von Oberflächensterilisation und Homogenisierung der Fliegen. Schließlich zeigt es die...

Orale Infektion von Drosophila melanogaster mit pathogenen Bakterien

Dieses Manuskript berichtet über ein detailliertes Protokoll für die regelmäßige Kultivierung einer Population von Drosophila melanogaster unter Verwendung eines Käfigs für eine Fliegenpopulation.

Aufrechterhaltung eines<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bevölkerung Cage

Wir stellen ein detailliertes Protokoll für einen Drosophila melanogaster-Assay zur Nahrungssuche zur Verfügung. Wir besprechen die Vorbereitung und Handhabung von Versuchstieren, die Durchführung des Assays und die Analyse der Daten.

Futter suchen Pfad-Länge-Protokoll für<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larvae

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Oral verfügbar zu machen und die Fruchtfliege Drosophila MelanogasteR mit bakteriellen Krankheitserregern zu infizieren und die Anzahl der infektiöse Bakterien Schuppen nach Darm-Infektion zu messen. Wir beschreiben weiter die Wirkung des Immunsystems Mutanten auf Fliege Überleben nach oraler bakterieller Infektion.

Mündliche bakterielle Infektion und Shedding in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster erwachsene Fliegen wurden ausgiebig als Modellorganismen verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die antimikrobiellen angeborenen Immunantworten des Wirts und mikrobiellen Infektionsstrategien zugrunde liegen. Um das Larvenstadium von D. melanogaster als zusätzliches oder alternatives Modellsystem zu fördern, wird eine Larveninjektionstechnik beschrieben.

Drosophila melanogaster Larven-Injektionsprotokoll

Eine Methode zur Reaktivierung ruhender neuraler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen wurde etabliert. Mit dieser Methode kann die Rolle systemischer Signale von gewebeintrinsischen Signalen bei der Regulation der Ruhe, des Eintritts und des Austritts neuronaler Stammzellen entkoppelt werden.

Reaktivierung neuronaler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen

Hier geben wir Details zur Herstellung von Lysaten und zur Durchführung von In-vitro-Übersetzungen mit Drosophila-Embryonen .

Zellfreie in-vitro mRNA-Translation in Drosophila-Lysaten

Drosophila-Blutzellen oder Hämozyten zirkulieren zwischen den ansässigen Stellen und der Zirkulation.  In der Larve sind residente (sitzende) Hämozyten in induktiven Mikroumgebungen, den hämatopoetischen Taschen, lokalisiert, während sich zirkulierende Hämozyten frei in der Hämolymphe bewegen. Das Ziel dieses Protokolls ist die standardisierte Isolierung und Quantifizierung dieser beiden verhaltensverschiedenen, aber sich gegenseitig verändernden Hämozytenpopulationen.

Untersuchung von Blut Zellpopulationen des<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Lernen Sie die Aufzucht von Drosophila melanogaster unter axenischen und gnotobiotischen Bedingungen. Diese Methode ermöglicht die Kontrolle und Manipulation der Mikrobiota für Studien zu Wirtsmerkmalen.

Aufzucht der Fruit Fly

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