Isolieren von Mesangiogenic Progenitorzellen (MPL) aus menschlichem Knochenmark

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mesangiogene Vorläuferzellen (MPC) aus dem menschlichen Knochenmark unter selektiven Kulturbedingungen zu isolieren. Wir testen sowohl ihr mesogenes als auch ihr angiogenes Potenzial. Mesangiogene Vorläuferzellen werden zu einem geringen Prozentsatz mit einer für die klinische Anwendung optimierten Mesen-ki-ma-stro-mo-Zellkultur identifiziert.

Wenn FBS durch menschliches Serum ersetzt wird. Diese Technik ist einzigartig, da sie eine sehr konsistente Isolierung einer großen Anzahl von alli-pol-ifizierten NPCs ermöglicht, die für das Keimen der Angiogenese geeignet sind, und die Erzeugung synchronisierter MSC-Kulturen. Wir haben dies herausgefunden, wenn nach Trips bei der Verdauung von MCS-Kulturen in einem Talgrumserum einige gebratene eiförmige Zellen nach der FPS-Behandlung noch angehaftet, aber in MCs differenziert bleiben.

Um mononukleäre Zellen des menschlichen Knochenmarks oder MNC zu isolieren, verdünnen Sie zunächst fünf bis 10 Milliliter frisches Knochenmark bis zu einem Gesamtvolumen von 50 Millilitern mit DPBS und mischen Sie die Zelllösung durch Inversion. Als nächstes verteilen Sie gleichmäßig 25 Milliliter Zellen auf zwei neue konische 50-Milliliter-Röhrchen und geben 25 Milliliter frisches DPBS in jedes Röhrchen für eine zweite Mischung durch Inversion. Lassen Sie die Zellen dann bei Raumtemperatur ruhen, damit sich die mineralischen Knochenfragmente und das Fett von der Lösung trennen können.

Nach 10 Minuten verwenden Sie eine Pastellepipette, um das Schwebefett vorsichtig zu entfernen und die Zellsuspensionen durch einzelne 70-Mikron-Filter zu filtrieren, ohne die Mineralknochenfragmentpellets zu stören. Um die MNC-Schicht zu isolieren, werden 20-25 Milliliter des verdünnten Knochenmarks auf Raumtemperatur 1,007 Gramm pro Milliliter Dichtegradientenmedium in jedes der beiden 50-Milliliter-Röhrchen gegeben und die Zellen durch Zentrifugation getrennt. Verwenden Sie dann eine sterile Pastagere-Pipette, um die weißlichen Zellringe an den Eintrittsflächen in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen zu sammeln.

Die isolierten mononukleären Zellen werden fünf Minuten lang bei 400-facher G-Temperatur und Raumtemperatur mit frischem Kulturmedium gewaschen. Suspendieren Sie das Pellet dann erneut in fünf bis 10 Millilitern frischem Nährmedium. Zur Isolierung des MPC äquilibrieren Sie hydrophobe T75-Kolben mit 15 Millilitern frischem Nährmedium bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.

Nach 30 Minuten säen vier- bis sechsmal 10 bis sieben der mononukleären Zellen des menschlichen Knochenmarks pro Kolben für eine 48-stündige Inkubation. Am zweiten Tag werden das Medium und die nicht adhärenten Zellen aus den Kolben genommen und die Zellen mit 15 ml frischem Nährmedium gefüttert. Legen Sie die Kulturen für sechs bis acht Tage in den Inkubator zurück.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die adhärenten Zellen mit frischem DMEM. Dann inkubieren Sie die Zellen mit zwei Millilitern tierfreier Proteas-Ablösung, die fünf bis 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius ablöst. Wenn sich die Zellen vom Boden des Kolbens abgehoben haben, werden 10 Milliliter frisches Kulturmedium hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen, und die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, wobei das Pellet in ein bis zwei Millilitern frischem Kulturmedium wieder suspendiert wird.

Nach dem Zählen der MPC-Platte werden zwei mal 10 bis vier pro Quadratzentimeter der Zellen in gewebekulturbehandelte T75-Kulturflaschen eingezahlt und die Zellen über Nacht in 15 Milliliter frisches Kulturmedium in den Zellkultur-Inkubator eingeklebt. Am nächsten Morgen ersetzen Sie das kultivierte Medium durch 200 Mikroliter pro Quadratzentimeter Misancolmulstromul-Zelle oder MSC-Expansionsmedium und kultivieren die Zellen für weitere sieben bis 10 Tage. Wenn die Kulturen die Konfluenzsubkultur bei drei bis fünf mal zehn bis drei Zellen pro Quadratzentimeter erreicht haben, bis sie eine neue Konfluenz der Passage zwei bei MSC erreicht haben, führen sie dann eine Proteasverdauung durch, um die Zellen zu sammeln, wie zuvor demonstriert.

Platte zwei mal zehn bis die vierten Zellen pro Quadratzentimeter in Gewebekultur behandelt, sechs Well-Platten und frisches Expansionsmedium. Nachdem Sie die Kulturen wieder zusammenwachsen lassen, markieren Sie zwei Vertiefungen als keine Differenzierung und erfrischen Sie das Expansionsmedium. Markieren Sie zwei Vertiefungen als Osteoblasten und ersetzen Sie das Medium durch 200 Mikroliter pro Quadratzentimeter osteogenes Standardmedium, das speziell für die MSC-Differenzierung entwickelt wurde.

Markieren Sie dann zwei Vertiefungen als Adipo-Standorte und ersetzen Sie das Medium durch 200 Mikroliter pro Quadratzentimeter Standard-Adipo-Genmedium, das speziell für die MSC-Differenzierung entwickelt wurde. Stellen Sie die Zellen für zwei bis drei Wochen wieder in den Zellkultur-Inkubator, bis sich die Zellen differenziert haben. Fahren Sie dann mit der fluoreszierenden Detektion von extrazellulären Kalziumablagerungen und der Ansammlung von intrazellulären Lipidtröpfchen fort.

Um 3D-Sphäroide herzustellen, säen Sie eine große Anzahl von 20 Mikrolitern frisch isolierter MPC-Suspension auf die Innenfläche eines Petrischalendeckels. Wenn alle Tropfen platziert wurden, setzen Sie den Deckel vorsichtig auf einen Petrischalenboden, der DPBS enthält, um eine Verdunstung der hängenden Tropfen zu verhindern, und stellen Sie die Platte über Nacht in den Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Morgen geben Sie 300 Mikroliter Allo-Quats mit extrazellulären Standard-Matrixproteinen in jede Vertiefung einer vier Grad Celsius großen 24-Well-Kulturplatte und gelieren die Matrixproteine 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie 700 Mikroliter Standard-vaskuläres Endo-Thelial-Wachstumsfaktor-reiches Endo-Thelialzell-Wachstumsmedium zu den gelierten EZM-Proteinen. Wenn sich die MPC zu 3D-Sphäroiden aggregiert haben, drehen Sie den Deckel der Petrischale vorsichtig um und verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um die Sphäroide schonend zu ernten. Zum Schluss säen Sie die Sphäroide in die Kulturvertiefungen und geben Sie die Platte wieder in den Inkubator.

Morphiologisch zeichnen sich MPC durch ihre charakteristische Spiegeleiform mit einer dicken Kernregion aus, die von einer flachen, dünnen Peripherie umgeben ist, die viele Philipodien aufweist. Häufig wird auch eine polare Dehnung der äußeren Zellgrenze beobachtet. Die MPC-Kultur im MSC-Expansionsmedium führt zu einer schnellen, aber teilweisen Differenzierung in proliferierende flache und mehrverzweigte Zellen, wobei verbleibende undifferenzierte MPCs noch nachweisbar sind.

Nach einer weiteren Passage ergeben die Kulturen eine Monoschicht aus exponentiell wachsenden MSC-ähnlichen Zellen. Dabei reorganisieren die MPC ihr F-Aktin in Stressfasern, während die Nestin-Expression auf einige wenige seltene Zellen beschränkt bleibt. Die Flussmessung von frisch isolierten MPC zeigt, dass über 95% der Zellen CD31 und CD45 exprimieren, aber die mis-en-com-al assoziierten Antigene CD90 und CD 73 fehlen.

Diese neuesten Antigene werden erst nach einer vollständigen Differenzierung in MSC stark exprimiert. Wenn diese Zellen mindestens zwei Wochen lang mit Differenzierungsmedium gefüttert werden, können diese Zellen leicht zu Osteoblasten induziert werden, wie ihre Kalziumablagerungen oder Adipose zeigen, wie die Ansammlung von Lipidtröpfchen zeigt. Bestätigung der MSC-Natur der vordifferenzierten Zellkulturen.

Die MPC-Typisierung wird weiterhin in einem Keim-Angio-Genesis-Assay bestätigt, wobei die Zellen die Fähigkeit zeigen, nach 24-stündiger Stimulierung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors in ein myrisches extrazelluläres Matrix-Proteingel aus 3D-Sphäroiden einzudringen. Nach einer Woche wandern die eindringenden Zellen über eine noch größere Distanz, eine Invasionskapazität, die bei MSCs der zweiten Passage nach der mesangenen Differenzierung verloren geht. Einmal gemeistert, können die MSC-Kulturen in einer Stunde etabliert werden, wenn dies richtig angegangen wird, wobei zwischen ein und zwei Millionen MPCs in weniger als einer Woche bereitgestellt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, die Leistung menschlicher CR-Chargen zu bewerten, bevor sie in der Kultur verwendet werden. Im Moment ist unser MPC-Isolationsprotokoll das einzige, um eine hochreproduzierbare, nahezu reine MC-Kultur für weitere Downstream-Anwendungen zu erhalten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der zellbasierten Therapien, um die Möglichkeit zu erforschen, MPC bei der Regeneration von Skelettgewebe einzusetzen.