Wie man Basalmembran Stiffness als biophysikalische Auslöser in Prostatakrebs und andere altersbedingte Pathologien oder Stoffwechselkrankheiten Studie

Das übergeordnete Ziel dieses Modells ist es, zu untersuchen, wie die Steifigkeit und Dicke der Basalmembran aufgrund der fortgeschrittenen Glykation und Produktexposition das invasive Zellverhalten entsprechend den frühen und fortgeschrittenen Stadien des metastasierten Prostatakarzinoms modulieren kann. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der altersbedingten Pathologien zu beantworten. Zum Beispiel, wie eine erhöhte Steifigkeit und Dicke der Basalmembran zum Fortschreiten von Krebs und auch zu Stoffwechselstörungen wie Diabetes beiträgt.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache Methode zur Nachahmung des Steifigkeitsgrades bietet, der bei menschlichen Prostatatumoren im klinischen Umfeld gemessen wird. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf unsere Therapie und Diagnose von Prostatakrebs, indem sie unser Verständnis dafür verbessert, wie die Steifheit der Basalmembran molekulare und zelluläre Veränderungen fördert. Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können Schwierigkeiten haben, da das Modell multidisziplinär ist.

Kombination von Techniken aus den Bereichen Chemie, Physik und Biologie. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir die Hypothese aufstellten, dass die Steifigkeit der Basalmembran in der Prostata de novo invasives Verhalten in bekannten transformierten Epithelzellen fördern kann. Die Videodemonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da interdisziplinäre Schritte beschrieben werden müssen.

Inklusive Vernetzung der Basalmembran, gefolgt von 3D-Zellkultur. Beginnen Sie damit, eine ebene Eisoberfläche vorzubereiten und damit einen Glasobjektträger mit acht Vertiefungen auf vier Grad Celsius zu kühlen. Schneiden Sie dann das Ende einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab und kühlen Sie die Spitze ebenfalls auf vier Grad Celsius ab.

Legen Sie die Spitze nach dem Abkühlen auf eine Pipettierhilfe mit einem Fassungsvermögen von 200 Mikrolitern. Und verwenden Sie es, um 40 Mikroliter eiskalte BM-Matrixlösung in jede Vertiefung des gekühlten Glasobjektträgers mit acht Vertiefungen zu übertragen. Platzieren Sie dann den Objektträger der Kammer 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Polymerisation der Basalmembran zu fördern.

Schließen Sie die Inkubatortür sehr vorsichtig, um die flüssig rekonstituierte Basenmembran nicht zu stören. Nach genau 30 Minuten fügen Sie 250 Mikroliter einer vorbereiteten Glykolaldehydlösung hinzu, um die polymerisierte, rekonstituierte Basalmembran zu bedecken. Bereiten Sie als Nächstes eine Negativkontrolle vor, indem Sie 250 Mikroliter steriles PDS zu einem nativen, rekonstituierten Basalmembrangel hinzufügen.

Bereiten Sie außerdem zwei zusätzliche Kontrollen vor, indem Sie entweder 50 millimolare Natriumcyanoborohydrid oder 250 millimolare Aminoguanidin zu Glykolaldehydlösung hinzufügen, bevor Sie es dem Basalmembrangel hinzufügen. Inkubieren Sie die Gele dann sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um ein halbsteifes Gel herzustellen. Oder für 14 Stunden, um ein steifes Gel herzustellen.

Entfernen Sie nach der Inkubation vorsichtig die Lösungen aus den Gelen und fügen Sie jedem Gel 250 Mikroliter eines molaren Glycinethylesters hinzu. Und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie jedes Gel 10 Mal in 500 Mikrolitern PBS, um alle Spuren der Glykolaldehydlösung und des Glycinethylesters zu entfernen.

Fügen Sie dann 400 Mikroliter PBS hinzu, um eine Dehydrierung zu verhindern, und inkubieren Sie die rekonstituierten Basalmembrangele über Nacht bei 37 Grad Celsius. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, entfernen Sie das PBS aus den rekonstituierten Basalmembrangelen und geben Sie 250 Mikroliter eiskaltes, doppelt destilliertes Wasser in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Gele 16 bis 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass die Matrix vollständig verflüssigt ist.

Übertragen Sie dann die verflüssigte Basalmembran in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und messen Sie die Fluoreszenzemission der Lösung mit einem Spektralphotometer. Zentrifugieren Sie dann die Lösung und entfernen Sie den entstandenen Überstand. Das Pellet wird in 500 Mikrolitern einer Lösung, die 20 Milligramm pro Milliliter Cyanogenbromid und 70 % Ameisensäure enthält, wieder suspendiert.

Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur. Verwenden Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Einwegspritze, um das resuspendierte Basalmembrangel in eine Dialysekassette mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 3,5 Kilodalton zu übertragen. Tauchen Sie die Kassette in ein 500-Milliliter-Becherglas mit 500 Millilitern doppelt destilliertem Wasser.

Und rühren Sie das Wasser mit einem magnetischen Rührstäbchen um. Stellen Sie dieses Setup über Nacht bei vier Grad Celsius auf, um alle Spuren von Cyanogenbromid und Ameisensäure zu entfernen. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Einwegspritze, um die gewählte Lösung aus der Kassette in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.

Analysieren Sie dann die Lösung, indem Sie sie auf ein 12%iges Polyacrylamid-Gel laufen lassen. Färben Sie das Gel mit Silberfleck, um das elektrophoretische Muster der Cyanogenbromid-Matrixpeptide sichtbar zu machen. Beginnend mit den Basalmembrangelen, die mit PBS bedeckt sind, spülen Sie die Gele zwei weitere Male, wobei 300 Mikroliter PBS 0,1 Millimol Calciumchlorid enthalten.

Und 0,5 Millimol Magnesiumchlorid. Fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann das PBS und fügen Sie 300 Mikroliter 4%-Paraformaldehyd hinzu, um jedes rekonstituierte Basalmembrangel zu bedecken.

Inkubieren Sie die Gele 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die rekonstituierten Komponenten der Basalmembran zu fixieren. Entfernen Sie anschließend das Fixiermittel und fügen Sie 300 Mikroliter einer Abschrecklösung hinzu, die 75 Millimol Ammoniumchlorid und 0,5 Millimol Magnesiumchlorid enthält. Inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, entfernen Sie dann die Lösung und wiederholen Sie das Spülen noch viermal.

Nach der letzten Spülung fügen Sie den rekonstituierten Basalmembrangelen 300 Mikroliter Immunfluoreszenzpuffer hinzu, um unspezifische Reaktionen zu verhindern. Inkubieren Sie die Gele in der Lösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einer Schüttelplattform. Entfernen Sie dann den Immunfluoreszenz-Blockierungspuffer.

Und fügen Sie 300 Mikroliter Primärantikörper hinzu, der im Blockierungspuffer verdünnt ist. Inkubieren Sie die rekonstituierten Basalmembrangele 16 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag entfernen Sie den primären Antikörper und waschen die Gele dreimal mit 300 Mikrolitern Immunfluoreszenzpuffer

Schütteln Sie die Gele bei Raumtemperatur auf einer Schüttelplattform für 10 Minuten nach jeder Pufferzugabe. Entfernen Sie dann den Puffer und fügen Sie 300 Mikroliter des fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpers hinzu, verdünnt im Blockierungspuffer. Legen Sie die Proben auf eine Schüttelplattform und inkubieren Sie die Gele zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie den Sekundärantikörper. Spülen Sie die Probe in einem Immunfluoreszenzpuffer, gefolgt von PBS, und fixieren und schrecken Sie die Proben ein zweites Mal ab. Montieren Sie abschließend die Gele und verwenden Sie ein Mikroskop, um die Bildung dichter Bündel zu analysieren.

Um Prostata-Acini zu bilden, verdünnen Sie 5.000 RWPE-1-Zellen in 300 Mikrolitern vollständigem KSFM, ergänzt mit 2% der Basalmembranlösung. Für Prostatatumorzellaggregate verdünnen Sie 2.500 PC3-Zellen in 300 Mikrolitern RPMI-1640 Kulturmedium, ergänzt mit 2% der Basalmembranlösung. Nach der nächtlichen Inkubation der rekonstituierten Basalmembrangele in PBS spülen Sie sie zweimal mit 500 Mikrolitern Nährmedium aus.

Vor dem Aussäen der Zellen. Säen Sie die Zellen sanft auf die nativen und durch fortgeschrittene Glykation versteiften rekonstituierten Basalmembranen aus. Und legen Sie die Kulturen vorsichtig in einen Inkubator, um eine gleichmäßige Verteilung der wachsenden Acini und Sphäroide zu gewährleisten.

Bei den Acini-bildenden Zellen ist das Medium alle zwei Tage durch frisches Kulturmedium zu wechseln, das 2 % der Basalmembranlösung enthält. Um sicherzustellen, dass die Zellen über die Wachstumsfaktoren verfügen, die für eine normale Acini-Homöostase erforderlich sind. Nach sechs Tagen in Kultur bilden Prostata-Epithelzellen Acini auf der nativen rekonstituierten Basalmembran.

Und sind in uniformierten Sphäroiden von Epithelzellen organisiert. Diese Acini haben auch die Eigenschaften von hochorganisierten PECs mit apikaler bis basaler Polarität und einem sichtbaren luminalen Raum. Wenn die Zellen sechs Tage lang auf der versteiften Membran kultiviert werden, haben sie eine gestörte Architektur.

Und wechseln Sie von kugelförmig zu polygonal. Darüber hinaus sind diese Acini sehr unorganisiert. Und haben ihre apikale bis basale Polarität verloren, mit einem kleinen oder nicht vorhandenen luminalen Raum.

Dies gilt auch für die Zellen, die aus einer Prostata stammen, die von einer gutartigen Prostatahyperplasie betroffen ist. Bei der Messung der Prostatatumorzellen wurde festgestellt, dass die Zellen länger auf der steifen, rekonstituierten Basalmembran lagen und auch schneller migrierten und eine erhöhte Zellpersistenz aufwiesen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Auswirkungen der Basalmembransteifigkeit auf das Verhalten von Epithel- und Tumorzellen modellieren können.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das gewünschte Maß an Basalmembransteifigkeit induziert wird und einzelne Acini oder s-Sphäroide richtig gebildet werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Onkologie, um die Induktion der Invasion von Krebszellen durch die Steifheit der Basalmembran in der Prostata zu erforschen. Nach diesem Protokoll können andere Methoden, wie das Immunblotting von Zelllysat, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich des Signalwegs zu beantworten, der durch die Steifigkeit der Basalmembran moduliert wird.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumcyanoborohydrid, Cyanogenbromid und Ameisensäure äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels, Handschuhe, eines Gesichtsschutzes und einer Atemschutzmaske während der Arbeit im Abzug sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.