Name: Wie man Basalmembran Stiffness als biophysikalische Auslöser in Prostatakrebs und andere altersbedingte Pathologien oder Stoffwechselkrankheiten Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Erfahren Sie, wie Basalmembran-Steifigkeit durch AGEs die invasive Zellaktivität in metastasiertem Prostatakrebs moduliert. Diese interdisziplinäre Methode kombiniert Chemie, Physik und Biologie für verbesserte Therapieansätze.

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Wir danken Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) für die BPH-1-Zellen und Thomas Cox und Janine Erler (Biotech Research & Innovation Centre, Universität Kopenhagen) für ihre Unterstützung bei rheologischen Messungen. MR-T wurde finanziert von Worldwide Cancer Research, ehemals The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 an JS), der britischen Botschaft Montevideo und der Agencia Nacional de Investigación e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 an MR-T). MC wurde von Prostate Cancer UK unterstützt (Grant S14-017 an JS und GS). KW wurde vom China Scholarship Council finanziert. MAM wurde vom Saudi Arabian Cultural Bureau finanziert.

<ol><li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+assembly+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li>
<li>Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+collagen+lateral+associations+in+the+EHS+tumor+matrix.+Comparison+with+amniotic+and+in+vitro+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks.</a> Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).</li>
<li>Halfter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+biomechanical+properties+of+in+vivo-derived+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes.</a> Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).</li>
<li>Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+the+structure%2C+composition+and+biophysical+properties+of+a+human+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane.</a> Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).</li>
<li>To, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-induced+morphological%2C+biomechanical%2C+and+compositional+changes+in+ocular+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes.</a> Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+responsive+adult+human+prostatic+epithelial+cell+lines+immortalized+by+human+papillomavirus+18%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18.</a> Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).</li>
<li>Hayward, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+immortalized+but+non-transformed+human+prostate+epithelial+cell+line%3A+BPH-1%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).</li>
<li>Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+prostatic+carcinoma+cell+line+%28PC-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Urol%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).</a> Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%3A+a+10-year+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).</li>
<li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGE-modified+basement+membrane+cooperates+with+Endo180+to+promote+epithelial+cell+invasiveness+and+decrease+prostate+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival.</a> J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).</li>
<li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li>
<li>Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nonlinear+rheology+with+inertio-elastic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheology%22%5BJournal%5D)">Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations.</a> J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).</li>
<li>Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase+enzymatic+function+increases+stiffness+to+drive+colorectal+cancer+progression+through+FAK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK.</a> Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).</li>
<li>Caley, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+Endo180+requires+stromal-derived+LOX+to+promote+metastatic+prostate+cancer+cell+migration+on+human+ECM+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces.</a> Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+uPAR+requires+Endo180+for+rapid+directional+sensing+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis.</a> J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes+generate+localized+Rho-ROCK-MLC2-based+contractile+signals+via+Endo180+to+promote+adhesion+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly.</a> J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).</li>
<li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+Outcome+and+EMT+Suppression+Mediated+by+a+Lectin+Domain+Interaction+of+Endo180+and+CD147%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147.</a> Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Carson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+characterization+of+ex+vivo+prostate+tissue+via+spherical+indentation+in+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Eng+Phys%22%5BJournal%5D)">Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic.</a> Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).</li>
<li>Hoyt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+elasticity+properties+as+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer.</a> Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).</li>
<li>Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+breast+and+prostate+tissues+under+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrason+Imaging%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression.</a> Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+viscoelastic+properties+of+human+prostate+correlated+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology.</a> Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).</li>
<li>Corona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benign+prostatic+hyperplasia%3A+a+new+metabolic+disease+of+the+aging+male+and+its+correlation+with+sexual+dysfunctions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions.</a> Int J Endocrinol. , Article ID:329456 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ein Protokoll für die Erzeugung von 3D - Drüsenacini von MEC in reinen rBM Gele 6 wurde in einer früheren Studie durch die Zugabe von 4 mg / ml Typ I auf der RBM Matrix - Kollagen modifiziert. Die Zugabe von Kollagen resultiert in dem Elastizitätsmodul des Gels rBM Erhöhung von 175 ± 37 bis 1589 ± 380 Pascal. Diese 9,1-fache Erhöhung der Steifigkeit moduliert das Wachstum, Überleben, Migration und Differenzierung von MEC 21. Das Protokoll wurde erneut modifiziert, indem ein Behandlungsschritt mit D einschließlich - (-) - Ribose nichtenzymatische Vernetzung des Typ-I-Kollagen zu fördern, die dem rBM Gel zugesetzt worden war. Die resultierende 15-fachen Anstieg wurde in der Steifigkeit gefunden mit onkogene Transformation von MEC zusammenzuarbeiten , um deren invasive Verhalten 22 zu fördern. Die experimentelle Vorgehensweise der Zugabe von Typ I-Kollagen-Gelen rBM erleichtert die direkte Wechselwirkung von MEC mit Kollagenfasern, die in menschlichem Gewebe erfolgt erst nach der physischen Barriere zwischen dem Stromaund vom BM bereitgestellt Epithel erfährt proteolytischen Abbau. Durch die Erzeugung von 3D - Drüsenacini von PEC in reinen rBM Gelen vorbehandelt mit GLA, öffnet sich das aktuelle Protokoll , um die Art und Weise zu untersuchen , wie BM Steifigkeit per se können ihre invasive Verhalten auslösen (Abbildung 3). Die Niveaus der Steifigkeit BM in diesem Protokoll physiologische Relevanz induziert. Inkubation mit 50 mM GLA 6 h und 14 h erhöht jeweils die Elastizitätsmoduln des reinen rBM Gel auf 175 ± 90 und 322 ± 160 gegenüber 122 ± 55 Pascal in rBM Gelen behandelt mit PBS (Tabelle 1). Diese 1,7-3,2-fache Erhöhung der Steifigkeit rBM rekapituliert die 2,5- bis 3,4-fache Erhöhung der Steifigkeit in malignen beobachtet im Vergleich zu normalen Prostata oder BPH Gewebe 23-26. Wie kürzlich in einer Veröffentlichung 13 die morphologischen Veränderungen durch die Ansammlung von AGE und rBM Steifigkeit in PEC Acini quantifiziert von ar für eine statistisch signifikante Verschiebung werden kann induziert umrissenenounded zu polygonale Form, verringert luminale / total acinar Bereich und vorspringende Zellen aus dem acina in die AGE-reiche rBM (Abbildung 3) zu migrieren. Immunoblotting können auch Marker für EMT zu bewerten verwendet werden (zB Verlust von E-Cadherin 13) und die Kontraktionsverhalten (zB phosphoryliert Myosin Light Chain-2, pMLC2 13) in Pecs in normalen gewachsen im Vergleich zu steifen rBM (Abbildung 3). Frühen endosomalen Antigen 1 und GM130: Eine weitere Bewertung unter Verwendung von Immunfluoreszenzanfärbung und konfokale Mikroskopie kann die BM (zB Laminin, Kollagen IV und AGE Anhäufung 13), zelluläre apikal-to-basale Polarität (zB apikale Lokalisation von EEA1 zu visualisieren angewendet werden 130 kDa cis-Golgi Marker 13) und zelluläre Muster der Adhäsionsmoleküle (zB E-Cadherin - Lokalisierung zu Zell-Zell - Junctions 13) (Abbildung 3). <img alt = &quot;3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3:. Überblick über die verschiedenen Protokolle hier vorgestellten Das Diagramm zeigt , wie die Vorbereitung und versteifen die rekonstituierte Basalmembran (RBM) mit Glykolaldehyd (Maillard - Reaktion), wie Zellen auf Saatgut auf dem steifen rBM, wie das steife rBM zu analysieren ( Ausmaß der Maillard-Reaktion) und Verfahren, die die zellulären und molekularen Veränderungen verwendet werden können, durch AGE-reiche rBM induziert zu analysieren. AGE, Advanced Glycation Endprodukten; BM, Basalmembran; DAPI, 4 &#39;, 6-Diamidino-2-Phenylindol; EEA1, frühe Endosomen Antigen 1; GAPDH, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; GLA, Glykolaldehyd; GEE, glycinethylester; GM130, 130 kDa cis-Golgi-Marker; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), Myosin Light Chain-2 an den Stellen phosphoryliert Threonin 18 und Serin 19; rBM, rekonstituierte Basalmembran; SDS-PAGE, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Für RWPE1 acini Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m; für PC3 TumorzelleSphäroiden Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. Diese Zahl hat sich von der Referenz 13 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Schritte zur Fehlerbehebung wird notwendig sein, wenn D - (-) - Ribose als Vernetzungsmittel für rBM gewählt wird. Während die Protokollentwicklung wurde festgestellt , dass die Behandlung mit 1 M D - (-) - Ribose für 72 Stunden, wie zuvor für RBM / Kollagengelen 22 beschrieben, ergab die Dehydratisierung und Schrumpfung von rBM Gelen. Die Auswertung von geringeren Konzentrationen von D - (-) - Ribose und kürzere Behandlungszeiten können dazu beitragen, diese Einschränkung zu überwinden. Eine mögliche Einschränkung in zukünftigen Anwendungen des Protokolls könnte begegnet werden, bei denen eine höhere rBM Steifigkeit erwünscht sind. Wenn längere Inkubationszeiten und höheren Konzentrationen von GLA induzieren werden verwendet, um höhere rBM Gelsteifheit wird es notwendig sein,<html> beurteilen , ob diese Behandlungsbedingungen einen Einfluss auf das Überleben der Zellen und die Proliferation, wie dies bisher 13 beschrieben. Es sollte auch beachtet werden, dass Inkubation von RWPE-1-Zellen mit Serum eine phänotypische EMT artigen Übergang und Exposition gegenüber Serum oder serumhaltigen Materialien sollten vermieden werden induziert. Wenn beispielsweise die Transfektion von Experimenten short interfering RNA (siRNA) Oligonukleotiden beinhalten, sollte das Verfahren RWPE-1-Zellen in KSFM optimiert werden unter Verwendung gewachsen, ohne die Zellen zu niedrigen Serum Transfektionsmedium Schalt. Dieser Nachteil könnte das Niveau des Gens beeinträchtigen erreicht Silencing bei der Verwendung von transienten siRNA im Modellansätze. Für einige Protein-Targets wäre es ratsam, werden induzierbaren shRNA Vektoren für abstimmbare Gen-Silencing und die gewünschte Verringerung der Protein-Ebene einzusetzen. Adaptionen , die 17 enzymatische Vernetzung durch Stromazellen oder Tumorzelle assoziiert Lysyloxidase (LOX) übernehmen könnte auch in Zukunft Modelle eingebaut werden. jove_content &quot;&gt; Dieses Protokoll wird die künftige Untersuchung von Pro-invasive Mechanismen ausgelöst durch altersabhängige BM Steifigkeit in Pecs (RWPE-1, BPH-1) und Bewertung von anti-metastatischen Ziele in invasive PTCs (PC3) erleichtern. Da BPH wird als eine Stoffwechselstörung , 27, dieses Protokoll zu sein ebnet auch den Weg zu unserem verbesserten Verständnis des Zusammenhangs zwischen Stoffwechselstörungen und einem erhöhten Risiko von Prostatakrebs. Da durch die Einwirkung von AGEs induzierte BM Steifigkeit in anderen Krebs ein Auslöser für Invasivität sein kann Arten, wird es interessant sein , um das Protokoll zu verwenden , ähnliche Modelle zu schaffen , die normalen Epithelzellen und Tumorzellen von anderen Organen (zB Brust-, Dickdarm-, Ovarien, Pankreas) integrieren. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls zusammen mit ihren Zeitpunkten, sind in 4 zusammengefasst. In der ersten Stufe ist es wichtig , die Stammlösung von rBM bei 4 ° C zu halten , während es auftaut seine pol zu verhindernymerization. Pipettenspitzen sollten nicht in die rM Stammlösung gelegt werden, bis sie auf 4 ° C gekühlt wurden. Für den nächsten Schritt ist es auch wichtig, die chamber slides äquilibriert auf 4 ° C haben, um sicherzustellen, bevor sie mit der rBM Lösung beschichtet sind. Sobald die Temperatur der Lösung rBM über 4 ° C erhöht wird, wird es irreversible polymerisieren unter Bildung eines Gels. Es ist wichtig, dass die rBM nicht während der Polymerisationsstufe gestört, um sicherzustellen, dass es sich um eine selbst bildet für die Zellkultur und mikroskopische Analyse geeignete Oberfläche. Die Dauer der Inkubation mit GLA mit oder ohne Inhibitoren der Maillard-Reaktion (Natriumcyanoborhydrid und amingoguanidine) wird bestimmen, wie steif RBM Gel wird. Es wird empfohlen , einen 6 - stündigen Inkubation mit GLA ​​zu verwenden , wenn halbsteifen Bedingungen erforderlich sind, und 14 Stunden Inkubation , wenn steife Bedingungen erforderlich sind (Tabelle 1). Alternative Inkubationszeiten oder Konzentrationen von GLA können, wenn verschiedene Ebenen verwendet werdenSteifigkeit erwünscht. In diesem Fall rheologische Analyse der rBM Gelen benötigen als einen wesentlichen Schritt eingebaut werden. Nach dem Schritt der Maillard-Reaktion durch Inkubation mit GEE und die nachfolgenden Waschschritte mit PBS Abschrecken können die rBM Gele bei 4 ° C gelagert oder sofort verwendet werden, für bis zu 48 Stunden vor ihrer Verwendung für die Zellkultur. Sobald Zellkulturen eingerichtet sind ist es wichtig, die Kulturmedium zu ändern (einschließlich aller Behandlungen) alle zwei Tage. Es wird empfohlen, die 3D-Zellkulturen für 3-12 Tage zu halten nach den Parametern untersucht. Für die 3D-PEC acini empfiehlt es sich, die Kulturen nach 6 Tagen zu analysieren und für die 3D-PTC-Analyse Sphäroide nach 3 Tagen der Kultur in erster Linie empfohlen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Einfache Übersicht des Protokolls mit kritischen Schritte und Timings zeigte die flow Diagramm zeigt, wie die Vorbereitung und die rekonstituierte Basalmembran (RBM) mit Glykolaldehyd (Maillard-Reaktion) mit kritischen Schritte und Zeiten angegeben versteifen. Punkte, wo das Protokoll kann angehalten werden, und Gele rBM gespeichert sind ebenfalls angegeben. rBM, rekonstituierte Basalmembran; GLA, Glykolaldehyd; GEE, glycinethylester; ON, über Nacht; PBS, Phosphat-gepufferte Salzlösung; RT, Raumtemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die Basalmembran (BM) ist eine Schicht aus spezialisierter extrazellulärer Matrix (EZM), die stabile Gewebegrenzen aufrechterhält, indem sie Schichten von Epithelzellen vom Stromatrennt 1. Die kovalente Vernetzung zwischen benachbarten Dreifachhelices von Kollagen IV im BM stabilisiert ihre laterale Assoziation, indem sie ein unregelmäßiges Netzwerk von superverdrillten Helicesetabliert 2. Diese Kollagen-IV-Gitter dienen als Gerüst für seine Wechselwirkung mit Laminin und anderen BM-Komponenten1. Die strukturelle Anordnung des BM verleiht ihm die mechanische Festigkeit und Steifigkeit, die für die normale Entwicklung der Drüsenepithelien erforderlich sind3. 
Während des Alterns und der Krankheit verdickt und versteift sich der BMallmählich 3,4. So kommt es in der Normalbevölkerung zwischen dem 50. und 80. Lebensjahr zu einer 3-fachen Erhöhung des Elastizitätsmoduls (E) des Augen-BM und bei Stoffwechselstörungen wie Diabetes5 zu einer weiteren Versteifung. Die strukturellen und biomechanischen Veränderungen im BM, die zu seiner erhöhten Steifigkeit führen, treten auf, wenn seine EZM-Komponenten, Kollagen IV und Laminin, nach Exposition gegenüber fortgeschrittenen Glykationsendprodukten (AGEs) nicht-enzymatisch vernetzt werden.
Der Zweck der hier beschriebenen Methode war es, ein Modell für die Untersuchung zu etablieren, wie die BM-Steifigkeit aufgrund der AGE-Exposition die Invasivität von Prostataepithelzellen (PEC) und Prostatatumorzellen (PTC) im Zusammenhang mit dem Wechsel zu metastasiertem Prostatakrebs (PCa) fördert. Zu diesem Zweck wurde ein bisheriges Verfahren zur Erzeugung von 3D-Drüsenacini aus Brustepithelzellen (MECs) in rekonstituierten rBM-Gelen6 um einen zusätzlichen Schritt erweitert, bei dem die rBM-Gele mit Glykolaldehyd (GLA) vorbehandelt werden. Es werden verschiedene Techniken zur Beurteilung der GLA-induzierten Vernetzung und Versteifung von vorbehandelten rBM-Gelen beschrieben, darunter photometrische Analyse, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS PAGE), konfokale Mikroskopie und rheometrische Analyse. Zu den Prostatazelltypen, die für die Kultivierung auf dem vorversteiften rBM ausgewählt wurden, gehören: RWPE-1, PECs, die von einer normalen Prostata abgeleitet wurden7; BPH-1, PECs, die von einer von BPH8 betroffenen Prostata stammen; und PC3, metastasierende PTCs, die von einem Sekundärtumor stammen, der sich im Wirbelknochen eines Patienten mit Prostatakrebs (PCa) befindet9. 
Neben der Weiterentwicklung der Erforschung der Prostatapathologie kann das Protokoll zur Versteifung von rBM-Gelen durch ihre Behandlung mit GLA angepasst werden, um zu untersuchen, wie die BM-Steifigkeit zu anderen altersbedingten Pathologien und Stoffwechselstörungen beiträgt. So kann das Modell beispielsweise direkt angewendet werden, um zu untersuchen, wie metastasierender Krebs durch BM-Steifigkeit in Organen wie Brust, Dickdarm, Eierstock und Bauchspeicheldrüse durch den Einbau geeigneter Zelltypen induziert wird. Darüber hinaus kann das Protokoll angepasst werden, um zu untersuchen, wie die steife BM die biomechanischen Mechanismen des Fortschreitens der Erkrankung bei diabetesbedingten mikrovaskulären Erkrankungen, Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie fördert.

<table><tbody><tr><td>I - Material für Monolayer-Kultur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BPH-1</td><td>CaP Zelllinien-Datenbank</td><td>PCaCL-132</td><td>Kontakt: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td></tr><tr><td>Vollständiges keratinozytenserumfreies Medium&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-075</td><td>Nicht bei 37 °C erwärmen; C vor der Anwendung</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum&nbsp;</td><td>First Link UK Ltd</td><td>02-00-850</td><td>Store at -20 &ordm; C in Aliquoten</td></tr><tr><td>PC3&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1435</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (Dulbecco A) Tabletten</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td>warm in 37 &ordm; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>RWPE-1&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11609</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>><Kommentare</td></tr><tr><td>II - Material für 3D-Kultur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Aminoguanidinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>396494</td><td>Reizt Augen, Atemwege und Haut</td></tr><tr><td>Kammer-Objektträger, 8-Well&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td><td>TKT-210-816M</td><td></td></tr><tr><td>Kulturmatrix mit rekonstituierter Basalmembran (rBM) Extrakt aus reduziertem Wachstumsfaktor&nbsp;</td><td>AMS Biotechnology</td><td>3445-005-01</td><td>Lagern Sie die Basalmembran (BM) bei -80 &ordm; C in Aliquoten</td></tr><tr><td>Cyanogenbromid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C91492</td><td>Giftig bei Berührung mit der Haut und Inhalation</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>Glycinethylesterhydrochlorid (GEE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50060</td><td>Reizt die Augen</td></tr><tr><td>Glykolaldehyd-Dimer (GLA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6805</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcyanoborohydrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>Leicht entflammbar; Giftig durch Kontakt mit der Haut und Inhalation</td></tr><tr><td>Spritzenfilter 0,22 Mikrometer</td><td>Appleton Woods</td><td>BC680</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>III - Material zur Quantifizierung der Maillard-Reaktion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>D3571</td><td>lichtempfindlich und lagerbar bei -20 &ordm; C in Aliquoten</td></tr><tr><td>Klonierungszylinder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>lichtempfindlich</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>lichtempfindliches</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td>Bei -20 &ordm; C in aliquoten</td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedien&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Pentosidin-Klon PEN-12 mAb</td><td>TransGenic Inc</td><td>KH012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Lagern bei -20 &ordm; C in Aliquoten</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Human-Kollagen IV polyklonaler Antikörper&nbsp; &nbsp;</td><td>Acris Antikörper</td><td>R1041</td><td>Lagern bei -20 &ordm; C in aliquots</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Laminin A/C pAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-7292</td><td>Lagern bei -20 &ordm; C in Aliquoten</td></tr><tr><td>Polyethylenglykol tert-octylphenylether (Triton-X100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol-Sorbitanmonolaurat (Tween-20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Dialysekassette Slide-A-Lyzer</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>66333<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>IV - Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARG2 Rotationsrheometer mit kontrollierter Dehnung</td><td>T.A. Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert S100 (20-fache Vergrößerung)</td><td>Mikroskop Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-gesteuerte befeuchtete Inkubationskammer für Zeiss Axio S100 Mikroskop</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Axiovert 200M (40-fache, 63-fache Vergrößerung)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus LH50A Mikroskop mit einer Digitalkamera mit Phasenkontrast&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar Plus Plattenleser Spektralphotometer</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>V - Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 1.47v</td><td>Nationales Institut für Gesundheit, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress</td><td>Molekulare</td><td></td><td></td> Produkte</tr></tbody></table>

wie man basalmembran stiffness als biophysikalische auslöser in prostatakrebs und andere altersbedingte pathologien oder stoffwechselkrankheiten studie

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Hier beschreiben wir ein Protokoll , das verwendet werden kann , die biophysikalischen Mikroumgebung zu studieren im Zusammenhang mit erhöhter Dicke und Steifigkeit der Basalmembran (BM) während der altersbedingten Erkrankungen und Stoffwechselstörungen (wie Krebs, Diabetes, der mikrovaskulären Krankheit, Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie) . Die Prämisse des Modells ist nicht enzymatische Vernetzung von rekonstituierten BM (RBM) -Matrix durch Behandlung mit Glykolaldehyd (GLA) Advanced Glycation-Endprodukt (AGE) Erzeugung über die Maillard-Reaktion zu fördern. Beispiele von Labortechniken, die verwendet werden können, um AGE Erzeugung nichtenzymatische Vernetzungs- und erhöhte Steifigkeit in GLA behandelten rBM skizziert bestätigen. Dazu gehören Herstellung von nativem rBM (behandelt mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, PBS) und steif rBM (behandelt mit GLA) zur Bestimmung von: sein AGE-Gehalt mittels photometrischer Analyse und Immunfluoreszenz-Mikroskopie, seine nicht-enzymatische Vernetzung durch Natriumdodecylsulfat-PolyacrylamidGelelektrophorese (SDS-PAGE) sowie konfokale Mikroskopie und ihre erhöhte Steifigkeit mit rheometry. Das hier beschriebene Verfahren kann die Steifigkeit (Elastizitätsmodul, E) von rBM bis zu 3,2-fache, im Einklang mit Messungen in gesunden gegenüber erkrankten menschlichen Prostatagewebe zu erhöhen, verwendet werden. Um die biophysikalischen Mikro neu mit der Alterung und erkrankten Prostata Drüse drei Prostata-Zelltypen wurden auf nativen rBM eingeführt und steif rBM: RWPE-1, Prostata-Epithelzellen (PEC), die von einer normalen Prostata; BPH-1, Pecs von einer Prostata durch gutartige Prostata-Hyperplasie (BPH) betroffen abgeleitet; und PC3, metastatischen Zellen aus einem sekundären Knochentumor abgeleitet von Prostatakrebs stammt. Mehrere Parameter können gemessen werden, einschließlich der Größe, Form und invasive Eigenschaften des 3D-Drüsenacini von RWPE-1 gebildet und BPH-1 auf nativen im Vergleich zu steifen rBM und mittlere Zelllänge, Migrationsgeschwindigkeit und die Persistenz der Zellbewegung von 3D spheroids von PC3-Zellen unter den gleichen Bedingungen gebildet. Zell-Signalwege und die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen kann auch beurteilt werden.

3D Prostata Acini Cultured auf Stiff rBM Nach 6 Tagen in Kultur von normalen Prostatagewebe abgeleitet PEC (RWPE-1) (Abbildung 1A) und BPH Gewebe (BPH-1) (Abbildung 1B) Form acini auf nativen (PBS) behandelt rBM , die in einheitliche Sphäroiden von epithelialen organisiert Zellen. Diese acini haben auch die Eigenschaften von hochorganisierten PEC mit apikal-to-basale Polarität und ein sichtbares luminalen Raum 13,20. Die durch PECs gebildet Acini abgeleitet von normalem Prostatagewebe (RWPE-1) , (1A) und BPH Gewebe (BPH-1) , (1B) auf versteift (AGE-rich) rBM (behandelt mit GLA) eine gestört Architektur (Verschiebung von rundliche Form und Zellen polygonal vorstehende / von der Acini in die AGE-reiche rBM) (Abbildung 1A Migration). Diese<html> Azini werden auch durch stark desorganisiert PECs gekennzeichnet , daß die apikale-to-basal Polarität mit einem geringen oder nicht vorhandenen luminalen Raum 13 verloren haben. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> Abb . 1: Prostata - Epithelzellen gewachsen als 3D Drüsenacini auf Einheimische und Stiff rekonstituierte Basalmembran (RBM) (A) Hell Bilder von RWPE-1 - Zellen für 12 Stunden bis zu 6 Tagen auf rBM Gele mit PBS (nativ) behandelt gewachsen oder 50 mM Glykolaldehyd 14 Stunden (AGE-reich; steif); Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. (B) BPH-1 - Zellen, gezüchtet , wie in Feld A beschrieben; Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m; Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> Tabelle 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; Tabelle 1:. Eigenschaften von epithelialen Prostata RWPE-1 acini gewachsen auf Ureinwohner, Halbsteife und Stiff rekonstituierte Basalmembran (RBM) RWPE-1 Acini wurden auf rBM gewachsen vorbehandelt mit PBS für 14 h (nativ), Glykolaldehyd (GLA ) für 6 Stunden (halbsteifen) oder GLA für 14 Stunden (steif). Für acinar Form ist der Anteil (%) ± Standardabweichung (SD) von rund, halb polygonal und polygonal Acini wurden von 5 unabhängigen Experimenten berechnet (50 acini pro Bedingung quantifiziert). Relative acinar Größe berechnet (native rBM = 100%) von 3 unabhängigen Experimenten. Für Invasivität% ± SD Acini mit einem oder mehreren vorstehenden Zellen wurden aus drei unabhängigen Experimenten berechnet. Falten Änderung wird durch Division des Mittelwerts erhalten unter halbsteifen oder steifen Bedingungen durch den entsprechenden Wert für nativen Bedingungen berechnet. P-Werte berechnet unter Verwendung des Student-t-Test (α = 0,05). ontent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; AGE erhöht abhängige rBM Steifigkeit fördert Migration PC3 Prostata Tumorzelle PC3 - Zellen auf nativen rBM gewachsen wandern durch kontinuierliche Zell-Zell - Kontakte zu pflegen hält, während PC3 Zellen auf AGE-reichen (steif) gewachsen rBM bewegen sich unabhängig voneinander (2A). Nach 72 Stunden in Zellen Kultur PC3 Brennpunkte (Sphäroiden) auf nativer Form (PBS) behandelt rBM, während PC3 Zellen auf steif (AGE-reichen) rBM von Sphäroiden nicht und wandern unabhängig (2B). PC3 - Zellen auf steif (AGE-reichen) rBM sind länglicher als PC3 - Zellen gezüchtet auf nativen rBM (Abbildung 2C). PC3 - Zellen auf steifen rBM wandern schneller als PC3 - Zellen gezüchtet auf nativen rBM (2D). PC3 - Zellen auf steifen rBM zeigen eine Abnahme der Persistenz im Vergleich zu PC3 - Zellen gezüchtet auf nativen rBM (Abbildung 2E). <img alt = &quot;2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2:. Prostata - Tumor - Zellmigration auf Einheimische und Stiff rekonstituierte Basalmembran (RBM) (A) Hellfeld- Bilder von PC3 - Zellen auf rBM Gele mit PBS (nativ) oder 50 mM Glykolaldehyd 14 Stunden (AGE-reichen, steif) behandelt gewachsen . Die Zellen wurden für 12 Stunden durch Zellbahnen zu erzeugen Tracking gefolgt mit einem Hellfeldmikroskop (10X-Objektiv) und eine Erfassungsrate von 1 Bild pro Stunde abgebildet. Gezeigten Bilder entsprechen den Zeitpunkten nach 0, 3, 6, 9 und 12 Stunden. Trajektorien einzelner Zellen werden für die 12 Stunden Zeitpunkt gezeigt. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. (B) PC3 - Zellen, die auf nativen oder steif rBM für 72 Stunden, und abgebildet wie in Tafel (A) beschrieben. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. Detail zeigt ausgewählte Bereich bei 2-facher Vergrößerung. (C) Mittelwert ± SD Zellenlänge (um); signifikanter Unterschied zwischen einheimischen rBM und steifen rBM (p = 1,2 × 10 -23). ( <strOng&gt; D) Mittelwert ± SD Geschwindigkeit (um / h von der Zelle Trajektorien berechnet); signifikanter Unterschied zwischen einheimischen rBM und steif rBM (p = 0,004). (E) Mittelwert ± SD Persistenz der Zellbewegung (Verhältnis D / T, wobei D = Abstand vom Anfang bis zum Ende der Zelle Bahn, T = Gesamtlänge der Zelle Bahn); signifikanter Unterschied zwischen einheimischen rBM und steifen rBM (p = 0,0007). Für Platten CE&gt; 10 Zellen analysiert wurden, werden die Daten repräsentativ für drei unabhängige Experimente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier erklären wir ein Protokoll für die Modellierung der biophysikalischen Mikroumgebung, wo die Vernetzung und eine erhöhte Steifigkeit der Basalmembran (BM), induziert durch Advanced Glycation Endprodukten (AGEs) pathologische Relevanz hat.

Wie man Basalmembran Stiffness als biophysikalische Auslöser in Prostatakrebs und andere altersbedingte Pathologien oder Stoffwechselkrankheiten Studie

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Das übergeordnete Ziel dieses Modells besteht darin zu untersuchen, wie die Steifigkeit und Dicke der Basalmembran infolge fortgeschrittener Glykation und Produktaussetzung das invasive Zellverhalten beeinflussen kann, das den frühen und fortgeschrittenen Stadien des metastasierenden Prostatakarzinoms entspricht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich altersbedingter Krankheiten zu beantworten, beispielsweise wie eine erhöhte Steifigkeit und Dicke der Basalmembran zur Krebsprogression sowie zu Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes beiträgt.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache Methode bietet, um die in klinischen Untersuchungen an menschlichen Prostatatumoren gemessene Steifigkeit nachzuahmen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie und Diagnose von Prostatakrebs hinein, da sie unser Verständnis dafür verbessert, wie die Steifheit der Basalmembran molekulare und zelluläre Veränderungen fördert. Personen, die neu in dieser Methode sind, könnten Schwierigkeiten haben, da das Modell multidisziplinär ist.Kombination von Techniken aus den Bereichen Chemie, Physik und Biologie. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir die Hypothese aufstellten, dass die Steifheit der Basalmembran in der Prostata das neuartige invasive Verhalten bekannter transformierter epithelialer Zellen fördern kann. Eine Videodemonstration dieser Methode ist entscheidend, da interdisziplinäre Schritte beschrieben werden müssen.Einschließlich der Vernetzung der Basalmembran, gefolgt von einer 3D-Zellkultur. Beginnen Sie damit, eine ebene Eisoberfläche vorzubereiten, und kühlen Sie eine acht-Loch-Kammer-Glaskammer darauf auf vier Grad Celsius ab. Schneiden Sie anschließend das Ende einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab und kühlen Sie die Spitze ebenfalls auf vier Grad Celsius ab.Nach dem Abkühlen den Tipp auf eine Pipettierhilfe mit 200 Mikroliter Kapazität setzen und damit jeweils 40 Mikroliter eiskalte BM-Matrix-Lösung in jedes Loch der gekühlten 8-Loch-Kammer-Glaskammer überführen. Anschließend die Kammerplatte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius platzieren, um die Polymerisation der Basalmembran zu fördern.Schließen Sie die Inkubatortür sehr vorsichtig, um das flüssige rekonstituierte Basalmembran nicht zu stören. Fügen Sie nach genau 30 Minuten 250 Mikroliter einer hergestellten Glykonaldehydlösung hinzu, um die polymerisierte, rekonstituierte Basalmembran zu bedecken. Bereiten Sie anschließend eine Negativkontrolle vor, indem Sie 250 Mikroliter sterile PDS zu einem nativen, rekonstituierten Basalmembrangel hinzufügen.Bereiten Sie außerdem zwei zus&auml;tzliche Kontrollen vor, indem Sie entweder 50 Millimolar Natriumcyanoborhydrid oder 250 Millimolar Aminoguanidin zu der Glykonaldehydl&ouml;sung hinzuf&uuml;gen, bevor Sie diese der Basalmembrangel hinzuf&uuml;gen. Inkubieren Sie die Gele anschlie&szlig;end bei 37 Grad Celsius f&uuml;r sechs Stunden, um ein halbstarres Gel zu erhalten, oder f&uuml;r 14 Stunden, um ein starres Gel herzustellen.Nach der Inkubation die Lösungen vorsichtig von den Gele entfernen und 250 Mikroliter einer einmolarigen Glycinethylester-Lösung zu jedem Gel hinzufügen. Die Gele anschließend eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Jedes Gel zehnmal mit jeweils 500 Mikrolitern PBS waschen, um alle Rückstände der Glyoxaldehydlösung und des Glycinethylesters zu entfernen.Anschießend 400 µL PBS hinzufügen, um Austrocknung zu verhindern, und die rekonstituierten Basalmembran-Gele über Nacht bei 37 °C inkubieren. Wenn die Weiterarbeit erfolgen soll, das PBS von den rekonstituierten Basalmembran-Gelen entfernen und 250 µL eiskaltes, doppelt destilliertes Wasser in jede Vertiefung geben. Die Gele bei 4 °C 16 bis 24 Stunden lang inkubieren, um sicherzustellen, dass die Matrix vollständig verflüssigt ist.Überführen Sie dann die verflüssigte Basalmembran in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und messen Sie die fluoreszierende Emission der Lösung mit einem Spektrophotometer. Zentrifugieren Sie danach die Lösung und entfernen Sie den entstandenen Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern einer Lösung, die 20 Milligramm pro Milliliter Cyanbromid und 70 % Ameisensäure enthält.Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur. Verwenden Sie anschließend eine Einweg-Spritze mit einem Volumen von einem Milliliter, um das erneut suspendierte Basalmembran-Gel in eine Dialysiskassette mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 3,5 Kilodalton zu überführen. Tauchen Sie die Kassette in einen Glasbecher mit einem Fassungsvermögen von 500 Millilitern, der 500 Milliliter zweifach destilliertes Wasser enthält.Und rühren Sie das Wasser mit einem magnetischen Rührstab um. Stellen Sie diese Ansammlung über Nacht bei vier Grad Celsius, um alle Spuren von Cyanbromid und Ameisensäure zu entfernen. Verwenden Sie eine Einweg-Spritze mit einem Milliliter Volumen, um die dialysierte Lösung aus der Kassette in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen zu überführen.Analysieren Sie anschließend die Lösung, indem Sie sie auf einem 12 %igen Polyacrylamidgel laufen lassen. Färben Sie das Gel mit Silberfärbung, um das elektrophoretische Muster der Cyanogenbromid-Matrixpeptide sichtbar zu machen. Beginnen Sie mit den Basalmembran-Gelen, die mit PBS bedeckt sind, und spülen Sie die Gele zwei weitere Male mit jeweils 300 Mikrolitern PBS, der 0,1 Millimol Calciumchlorid enthält.Und 0,5 Millimol Magnesiumchlorid. Fünf Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend das PBS entfernen und 300 µL 4 % Paraformaldehyd hinzufügen, um jedes rekonstituierte Basalmembrangel zu bedecken.Die Gele 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die rekonstituierten Bestandteile der Basalmembran zu fixieren. Anschließend das Fixierungsmittel entfernen und 300 Mikroliter einer Spüllösung hinzufügen, die 75 Millimol Ammoniumchlorid und 0,5 Millimol Magnesiumchlorid enthält. Die Lösung fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und danach entfernen; den Spülvorgang anschließend noch viermal wiederholen.Nach dem letzten Spülschritt 300 Mikroliter Immunfluoreszenz-Puffer zu den rekonstituierten Basalmembran-Gelen hinzufügen, um unspezifische Reaktionen zu verhindern. Die Gele zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem schüttelnden Plattforminkubator inkubieren. Anschließend den Immunfluoreszenz-Blockierpuffer entfernen.Und 300 Mikroliter Primärantikörper, der in dem Blockierpuffer verdünnt ist, hinzufügen. Die rekonstituierten Basalmembran-Gele bei vier Grad Celsius für 16 Stunden inkubieren. Am nächsten Tag den Primärantikörper entfernen und die Gele dreimal mit jeweils 300 Mikrolitern Immunfluoreszenzpuffer waschen.Schütteln Sie die Gele nach jeder Pufferzugabe 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einer Schüttelplattform. Anschließend entfernen Sie den Puffer und geben 300 Mikroliter des fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers, in Blockierpuffer verdünnt, hinzu. Stellen Sie die Proben auf eine Schüttelplattform und inkubieren Sie die Gele zwei Stunden bei Raumtemperatur.Entfernen Sie den sekundären Antikörper. Spülen Sie die Probe in einem Immunfluoreszenz-Puffer, gefolgt von PBS, und fixieren und quenchen Sie die Proben anschließend ein zweites Mal. Schließlich montieren Sie die Gele und analysieren mithilfe eines Mikroskops die Bildung dichter Bündel.Um Prostata-Drüsenazini zu bilden, verdünnen Sie 5.000 RWPE-1-Zellen in 300 Mikrolitern komplettem KSFM, ergänzt mit 2 % der Basalmembranlösung. Für Prostata-Tumorzellaggregate verdünnen Sie 2.500 PC3-Zellen in 300 Mikrolitern RPMI-1640-Kulturmedium, ergänzt mit 2 % der Basalmembranlösung. Nach einer Übernacht-Inkubation der rekonstituierten Basalmembrangele in PBS spülen Sie diese zweimal mit jeweils 500 Mikrolitern Kulturmedium ab.Bevor Sie die Zellen aussäen. Säen Sie die Zellen vorsichtig auf die nativen und durch fortgeschrittene glykatische Endprodukte versteiften rekonstituierten Basalmembranen aus und stellen Sie die Kulturen sorgfältig in einen Inkubator, um eine gleichmäßige Verteilung der wachsenden Akini und Sphäroide sicherzustellen.Bei den azinusbildenden Zellen alle zwei Tage das Medium wechseln und frisches Kulturmedium zugeben, das 2 % der Basalmembranlösung enthält, um sicherzustellen, dass die Zellen die für die normale Azinus-Homöostase erforderlichen Wachstumsfaktoren erhalten. Nach sechs Tagen in Kultur bilden Prostataepithelzellen Azini auf nativ rekonstituierter Basalmembran.Und sind in einheitliche Sphäroide aus epithelialen Zellen organisiert. Diese Acini weisen auch die Merkmale stark organisierter PECs mit apikaler zu basaler Polarität sowie einen sichtbaren luminalen Raum auf. Bei Kultivierung für sechs Tage auf der versteiften Membran weisen die Zellen eine gestörte Architektur auf.Und verändern ihre Form von sphäroidal zu polygonal. Außerdem sind diese Azini stark desorganisiert und haben ihre apikal-basale Polarität verloren, wobei der luminalen Raum klein oder nicht vorhanden ist.Dies gilt ebenfalls für Zellen, die aus einer Prostata stammen, die von einer benignen Prostatahyperplasie betroffen ist. Bei der Messung der Prostatatumorzellen zeigte sich, dass die Zellen auf der steifen, rekonstituierten Basalmembran länger waren, zudem schneller migrierten und eine erhöhte Zellpersistenz aufwiesen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Auswirkungen der Steifigkeit der Basalmembran auf das Verhalten epithelialer und tumoröser Zellen modellieren kann.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass der gewünschte Grad der Steifigkeit der Basalmembran induziert wird und einzelne Acini oder s-Sphäroide korrekt gebildet sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Onkologie, um die Invasion von Krebszellen durch die Steifigkeit der Basalmembran in der Prostata zu untersuchen. Mithilfe dieses Protokolls können anschließend weitere Methoden wie das Immunoblotting von Zelllysaten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der durch die Steifigkeit der Basalmembran modulierten Signalwege zu beantworten.Beachten Sie, dass das Arbeiten mit Natriumcyanoborhydrid, Cyanbromid und Ameisensäure äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels, von Handschuhen, einer Gesichtsschutzscheibe und eines Atemschutzgeräts im Abzug stets eingehalten werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Forschung

JoVE Journal

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Die Wirkung von Substraten Steifigkeit auf die zelluläre Funktion modelliert werden...

Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Zellen Steifigkeit zu messen. Das allgemeine Prinzip dieser Methode besteht darin, Membranverformung in Reaktion auf wohldefinierte negativen Druck durch eine Mikropipette an die Zelloberfläche aufgebracht messen. Diese Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur biomechanischen Eigenschaften von Substrat-anhaftenden Zellen zu studieren.

Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

Partikel-Tracking Mikrorheologie können zerstörungs quantifizieren und räumlich zuordnen Veränderungen in der extrazellulären Matrix mechanische Eigenschaften im 3D-Tumormodelle verwendet werden.

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Isolierung von Aorten aus der Maus und die Messung ihres Elastizitätsmoduls mittels Rasterkraftmikroskopie.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Mechanische Kräfte sind wichtig für die Steuerung der Zellmigration. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von elastischen Hydrogelen, die mit einer Glasmikropipette und einem Mikromanipulator verformt werden können, um Zellen mit einem lokalen Steifigkeitsgradienten zu stimulieren, um Veränderungen in der Zellstruktur und Migration hervorzurufen.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Hier wird das Protokoll der Conpokal-Technik vorgestellt, das konfokale und atomare Kraftmikroskopie zu einer einzigen Instrumentenplattform vereint. Conpokal bietet die gleiche Zelle, die gleiche Region, fast gleichzeitige konfokale Bildgebung und mechanische Charakterisierung von lebenden biologischen Proben.

Nahezu simultanes Laserscanning Konfokal- und Atomkraftmikroskopie (Conpokal) auf lebenden Zellen

Vor kurzem haben wir die retinale Kapillarversteifung als neues Paradigma für retinale Dysfunktion im Zusammenhang mit Diabetes identifiziert. In diesem Protokoll werden die Schritte zur Isolierung von retinalen Kapillaren und der subendothelialen Matrix aus retinalen Endothelkulturen erläutert, gefolgt von einer Beschreibung der Steifigkeitsmesstechnik mittels Rasterkraftmikroskopie.

Isolierung von retinalen Kapillaren und subendothelialer Matrix der Maus zur Steifigkeitsmessung mittels Rasterkraftmikroskopie

Dieses Protokoll visualisiert, wie Kryoschnitte von murinem Lungengewebe vorbereitet, Rasterkraftmikroskopie-Kraftkartenexperimente durchgeführt und die Daten analysiert werden, um den Elastizitätsmodul der nativen pulmonalen Basalmembran der Maus zu bestimmen.

Extraktion des Elastizitätsmoduls nativer pulmonaler Basalmembranen von Mäusen aus der Rasterkraftmikroskopie abgeleiteten Kraftkarten

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Erfahren Sie, wie Basalmembran-Steifigkeit durch AGEs die invasive Zellaktivität in metastasiertem Prostatakrebs moduliert. Diese interdisziplinäre Methode kombiniert Chemie, Physik und Biologie für verbesserte Therapieansätze.

Wie man Basalmembran Stiffness als biophysikalische Auslöser in Prostatakrebs und andere altersbedingte Pathologien oder Stoffwechselkrankheiten Studie (Video) | JoVE Journal

Wie man Basalmembran Stiffness als biophysikalische Auslöser in Prostatakrebs und andere altersbedingte Pathologien oder Stoffwechselkrankheiten Studie

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