Genomweite Reinigung von extrachromosomale zirkuläre DNA aus eukaryotischen Zellen

Genomweite Aufreinigung von extrachromosomaler zirkulärer DNA aus eurkaryotischen Zellen. Hallo, ich bin Rasmus. Hier werde ich die gesamte Übersicht über die Methode zur zirkulären DNA-Aufreinigung vorstellen.

Im ersten Teil werden Hefezellen kultiviert und geerntet. Dann wird die zirkuläre DNA in drei Schritten aufgereinigt und amplifiziert. Zunächst durch Säulentrennung, bei der DNA-Kreise gereinigt und angereichert werden.

Dann durch Behandlung der DNA mit Exonuklease, um die gesamte verbleibende lineare DNA zu verdauen, und schließlich durch Amplifikation von DNA-Kreisen mit der phi-29-Polymerase. Im fünften Teil dieses Protokolls werden DNA-Kreise sequenziert und Reads mit dem Referenzgenom von Saccharomyces cerevisiae kartiert. Am Ende dieses Videos zeigen wir Ihnen einige repräsentative Ergebnisse.

Wir werden die Perspektiven für zukünftige Studien und die Vorteile für den Einsatz dieser Methode diskutieren. Teil eins, die Zellernte. Die Starterkultur wird bei 30 Grad unter Rühren bis zur maximalen Dichte gezüchtet, die etwa 200 Millionen Zellen pro Milliliter beträgt und nach 24 bis 48 Stunden erreicht ist.

Die ausgewachsene Kultur wird in ein Falcon-Röhrchen überführt und durch Zentrifugation drei Minuten lang pelletiert. Der Überstand wird entfernt. Das große Pellet wird in TE-Puffer vortexiert und durch Zentrifugation wieder pelletiert.

Zweiter Teil, Säulenreinigung. In diesem Schritt verwenden wir ein kommerziell erhältliches Säulenaufreinigungskit, das hochreine Plasmide aus genomischer bakterieller DNA liefert. Bevor dieses Kit mit Hefe verwendet wird, muss die Zellwand aufgebrochen werden.

Dies geschieht durch Resuspendieren des gewaschenen Zellpellets in L-1-Puffer aus dem Kit. Die Zellsuspension wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und Glasperlen werden zu einem Drittel des Gesamtvolumens hinzugefügt. Die Probe wird 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit vortexiert und die Kügelchen werden durch Zentrifugation bei 2.000 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden entfernt.

Der Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt. Bei dieser Methode fügen wir dem Überstand stark verdünnte Plasmide in drei verschiedenen Verhältnissen hinzu. Wir schlagen vor, stark verdünntes Plasmid in den Zyklus aufzunehmen.

Diese können als interne Referenzhandbücher dienen. Dies können Sie auch zur Qualitätsprüfung Ihrer DNA-Reinigung und -Amplifikation verwenden, indem Sie eine Semi-Mengenschätzung der nicht-zirkulären DNAs pro Zelle mit diesen Spike-in-Plasmiden durchführen. Es sollten nur stark verdünnte Plasmide hinzugefügt werden, da sie die Sequenzauflösung anderer zirkulärer DNAs beeinflussen.

Die Zellsuspension, die dotierte Plasmide enthält, wird mit L-2-Lösung aus dem Kit behandelt und das Kit-Protokoll wird befolgt. Nach dem Beladen der Säule werden Proteine, Lipide und chromosomale DNA durch zweimaliges Waschen der Säule entfernt. Die extrachromosomale zirkuläre DNA ist in der Eluatfraktion stark angereichert.

Dritter Teil, linearer DNA-Verdau. In diesem Schritt verwenden wir eine Exonuklease, um die verbleibende lineare DNA zu verdauen. Eine ATP-abhängige Exonuklease zielt spezifisch auf lineare doppelsträngige und einzelsträngige DNA ab, ohne zirkuläre DNA zu verdauen.

Die Spezifität der Exonuklease für lineare DNA wurde durch Gelelektrophorese nach 29-stündiger DNase-Behandlung bestätigt. Die Ergebnisse zeigen, dass genomische DNA verdaut wird, während die Plasmid-DNA verbleibt, wie durch den roten Pfeil angezeigt. Hefe enthält 16 Chromosomen mit einer Länge von bis zu 1.500 Kilobasen.

Um die Verdauung der Exonuklease zu erleichtern, wird eine seltene schneidende Endonuklease verwendet, um eine erhöhte Anzahl zugänglicher DNA-Enden zu erhalten. Bei Verwendung des at-basierten Restriktionsenzyms NotI wird jedes Chromosom wie angegeben bis zu siebenmal gespalten. Die säulengereinigte DNA wird über Nacht in einem Heizblock bei 37 Grad mit NotI behandelt.

Nach der Hitzeinaktivierung von NotI wird die gespaltene DNA gemäß dem Herstellerprotokoll bei 37 Grad mit Exonukleasen behandelt. Nach der Exonuklease-Behandlung werden die Enzyme 30 Minuten lang bei 70 Grad hitzeinaktiviert. Es kann mehrere Tage dauern, bis die gesamte lineare chromosomale DNA durch zusätzliches ATP und Exonuklease verdaut ist. Um sicherzustellen, dass die gesamte lineare DNA vollständig verdaut wird, werden die Proben mittels PCR- oder qPCR-Methoden unter Verwendung eines internen Referenzgens wie ACTI analysiert.

Vierter Teil, Amplifikation der DNA. In diesem Schritt reichern wir zirkuläre DNA mit der phi-29-Polymerase an und amplifizieren sie. Die Reaktion findet bei 30 Grad unter Verwendung von zufälligen Hexamer-Oligonukleotiden und phi-29 statt.

Die Polymerase hat eine hohe Wiedergabetreue und Korrekturleseaktivität, wodurch eine unvoreingenommene DNA-Amplifikation gewährleistet wird. Jede Polymerase kann durch die Rollkreisreplikation bis zu 100 Kilobasen DNA synthetisieren. Die Polymerase ist auch hochgradig prozessiv und amplifiziert DNA bis zum 10-fachen bis zur neunten Faltung.

Fünfter Teil, Sequenzierung. Gemäß dem Protokoll für eine Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform der nächsten Generation wird die DNA auf eine durchschnittliche Größe von 300 Basenpaaren beschallt und als 141 Nukleotid-Single-End-Reads sequenziert. Die Sequenzlesevorgänge werden unter Verwendung der kostenlosen Datenbank Galaxy auf das Referenzgenom von Saccharomyces cerevisiae abgebildet.

Sequenzierte Daten werden in Galaxy hochgeladen und mit dem Short-Read-Aligner Bowtie2 kartiert, der das Mapping von partiellen Reads ermöglicht. Sechster Teil, repräsentative Ergebnisse. Nach der Sequenzierung und Kartierung mit dem Referenzgenom von Saccharomyces cerevisiae können die Reads im Genombrowser innerhalb der Galaxy-Software visualisiert werden.

DNA zirkulären Ursprungs kann zum Beispiel als Regionen gezählt werden, die kohärente Lesevorgänge von mehr als einer Kilobase enthalten, wie auf dem Bildschirm angezeigt. Ein Beispiel für eine Region auf Chromosom vier, die kohärente Reads enthält, die sich über mehr als eine Kilobase erstrecken, ist die Region mit den Hexose-Transporter-Genen sechs und sieben. Bei der Anwendung dieser Methode auf eine Population von Hefezellen werden an diesem Locus häufig kartierte Reads gefunden, und die Leseabdeckung deutet eindeutig darauf hin, dass sich ein DNA-Kreis zwischen parralog Hexose-Transporter-Genen gebildet hat.

Aufgrund der hohen Sequenzhomologie zwischen den Hexose-Transporter-Genen vermuten wir, dass eine illegitime homologe Rekombination zu einer Zirkularisierung dieser DNA führt. Ein Modell für zirkuläre DNA-Mutation ist, wenn der DNA-Reparaturprozess nicht perfekt abläuft. Wenn beispielsweise ein Doppelstrangbruch in einem sich wiederholenden Element auftritt, kann die homologe Sequenz auf demselben Chromatiden als Vorlage für die DNA-Reparatur durch homologe Rekombination verwendet werden.

Nach der Resektion, der Stranginvasion, der DNA-Synthese und der Auflösung aller Verfügungen kann ein DNA-Kreis aus dem Genom aufsteigen, der eine DNA-Deletion auf dem Chromosom verursacht. Die Auswirkungen der Behandlung von DNA mit Exonukleasen und Phi-29-Polymerase können mit Hilfe der Propidiumiodid-Färbung visualisiert werden. Die Färbekontrollen der genomischen DNA erscheinen wie im linken Bild, während die Plasmid-DNA wie im rechten Bild erscheint.

Nach 29-stündiger Exonuklease-Behandlung werden 400 Nanogramm genomische DNA verdaut, der Großteil der DNA wird verdaut, wie im linken Bild gezeigt. Dieses Ergebnis wird durch die Gelelektrophorese bestätigt, wie auf dem Gelbild rechts zu sehen ist. Nach 72-stündiger Exonuklease-Behandlung, gefolgt von der DA-Synthese durch die phi-29-Polymerase, können immer noch Millionen von DNA-Kopien identifiziert werden.

Ebenso ist nach 29-stündiger Exonuklease-Behandlung von 400 Nanogramm genomischer DNA plus zusätzlichen 100 Nanogramm Plasmid-DNA der Großteil der genomischen DNA verdaut. Die Plasmid-DNA wird jedoch nicht verdaut, wie auf dem Gelbild zu sehen ist. Nach der phi-29-Polymerase-Behandlung der 72-Stunden-Exonuklease-behandelten Probe erscheint der Großteil der amplifizierten DNA als gefärbte Plasmide.

Also haben wir zuerst Gene auf zirkuläre DNA untersucht und waren wirklich überrascht, mehrere hundert verschiedene Arten von DNA-Proben zu finden. Ja, es war wirklich überrascht herauszufinden, wie häufig DNA-Kreise in der Hefepopulation sind, und wir glauben, dass diese Methode für viele Arten von Studien verwendet werden kann. Eine davon wäre natürlich, sich menschliches Gewebe anzusehen.

Wir wissen, dass ein Gen auf einem zirkulären Element und natürlich Hefe und sogar auf Tumorzellen amplifiziert werden kann. Ich denke, im Allgemeinen wird es interessant sein, sich somatische Zellen anzusehen und zu untersuchen, welche Art von zirkulärer DNA wir dort finden werden und wie wir diesen Effekt haben könnten. Bekanntmachung. In alternden Zellen haben wir Kreise, die sich mit zunehmendem Alter ansammeln, und wir erwarten, dass mehr Gene auf zirkulärer DNA zu finden sind.

Und dann möchten wir uns zusätzlich die molekularen Mechanismen ansehen, die bei der DNA-Zirkularisierung erforderlich sind, und es ist offensichtlich, sich Hefen anzusehen, bei denen wir Mutanten haben, die in der homologen Rekombination defekt und dann nicht homolog sind. Bei der Untersuchung dieser Mutanten erwarten wir, dass die DNA-Zirkularisierung ein Profil erstellt, was sich von den verschiedenen Arten von Mutanten unterscheidet, und hoffentlich werden wir aus Hefestudien in der Lage sein, viel mehr über die DNA-Zirkularisierung zu lernen. Im Vergleich zu anderen Methoden ist diese Methode also viel empfindlicher. Könnte tatsächlich in der Lage sein, den DNA-Kreis in etwa einer von 10.000 Zellen zu finden.

Und soweit ich aus Studien aus dem Prozess weiß, die sehr ausführlich durchgeführt wurden. Mutante Allele müssen normalerweise einen Anteil von einem bis 10% der Population erreichen, bevor sie nachgewiesen werden können. Richtig, und bei dieser Technik muss man keine Vorkenntnisse über die gebildeten DNA-Kreise haben, im Gegensatz zu Techniken. Oder die DNA-Kreise müssen irgendwie gebunden sein und dann kann man sie leicht als Amplifikationen durch Sequenzierung oder durch Chromosomenfärbung nachweisen.

Ja, ich denke, der Hauptvorteil ist die Empfindlichkeit und ich hoffe, dass wir mit dieser Methode viele interessante Dinge tun können.