Genomweite Reinigung von extrachromosomale zirkuläre DNA aus eukaryotischen Zellen

Genomweite Aufreinigung von extrachromosomaler zirkulärer DNA aus eukaryotischen Zellen. Hallo, ich bin Rasmus. Hier werde ich den gesamten Ablauf der Methode zur Aufreinigung zirkulärer DNA vorstellen.

Im ersten Teil werden Hefe-Zellen kultiviert und geerntet. Anschließend wird kreisförmige DNA in drei Schritten gereinigt und amplifiziert. Zuerst durch Säulenseparation, bei der DNA-Kreise gereinigt und angereichert werden.

Anschließend erfolgt die Behandlung der DNA mit einer Exonuklease, um alle verbleibenden linearen DNA-Moleküle abzubauen, und schließlich die Amplifikation der DNA-Kreise mittels des Phi-29-Polymerase. Im fünften Teil dieses Protokolls werden die DNA-Kreise sequenziert und die Reads gegen das Referenzgenom von Saccharomyces cerevisiae abgebildet. Am Ende dieses Videos zeigen wir Ihnen einige repräsentative Ergebnisse.

Wir werden die Perspektiven für zukünftige Studien sowie die Vorteile der Anwendung dieser Methode erörtern. Teil eins, Zellernte. Die Startkultur wird bei 30 Grad unter Schütteln bis zur maximalen Dichte angezogen, die etwa 200 Millionen Zellen pro Milliliter beträgt und nach 24 bis 48 Stunden erreicht wird.

Die überwachsene Kultur wird in ein Falcon-Röhrchen überführt und durch Zentrifugation drei Minuten lang pelletiert. Der Überstand wird entfernt. Das große Pellet wird in TE-Puffer vortexiert und erneut durch Zentrifugation pelletiert.

Teil zwei, Säulenchromatographie. In diesem Schritt verwenden wir ein im Handel erhältliches Kit zur Säulenchromatographie, das hochreine Plasmide aus genomischer bakterieller DNA liefert. Vor der Verwendung dieses Kits bei Hefe muss die Zellwand aufgebrochen werden.

Dies erfolgt, indem das gewaschene Zellpellet in L-1-Puffer aus dem Kit resuspendiert wird. Die Zellsuspension wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und Glasperlen bis zu einem Drittel des Gesamtvolumens zugegeben. Die Probe wird 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit verwirbelt und die Perlen werden durch Zentrifugation bei 2.000 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden entfernt.

Der Überstand wird in ein neues Gefäß übertragen. Bei dieser Methode fügen wir hochverdünnte Plasmide in drei verschiedenen Verhältnissen zum Überstand hinzu. Wir schlagen vor, hochverdünnte Plasmide in den Zyklus einzubeziehen.

Dies kann als interne Referenz dienen. Damit können Sie die Qualität Ihrer DNA-Reinigung und -Amplifikation überprüfen und außerdem eine halbquantitative Abschätzung der Menge an nicht-kreisförmigen DNA-Molekülen pro Zelle anhand dieser Spike-in-Plasmide durchführen. Es sollten nur stark verdünnte Plasmide hinzugefügt werden, da sie die Sequenzauflösung anderer kreisförmiger DNA-Moleküle beeinträchtigen könnten.

Die Zellsuspension, die gespikte Plasmide enthält, wird mit der L-2-Lösung aus dem Kit behandelt, und dem Kit-Protokoll wird gefolgt. Nach dem Beladen der Säule werden Proteine, Lipide und chromosomale DNA durch zweimaliges Waschen der Säule entfernt. Extrachromosomale zirkuläre DNA ist in der Eluatfraktion stark angereichert.

Teil drei, Verdauung linearer DNA. In diesem Schritt verwenden wir ein Exonuklease, um verbleibende lineare DNA abzubauen. Eine ATP-abhängige Exonuklease zielt gezielt auf lineare doppelsträngige und einfachsträngige DNA ab, ohne zirkuläre DNA zu verdauen.

Die Spezifität der Exonuklease für lineare DNA wurde durch Gelelektrophorese nach 29 Stunden DNase-Behandlung bestätigt. Die Ergebnisse zeigen, dass genomische DNA abgebaut wird, während ringförmige Plasmid-DNA erhalten bleibt, wie durch den roten Pfeil angezeigt. Hefe enthält 16 Chromosomen mit einer Länge von bis zu 1.500 Kilobasen.

Um die Exonuklease-Digestion zu erleichtern, wird ein seltenschnittiges Endonuklease verwendet, um eine erhöhte Anzahl zugänglicher DNA-Enden zu erhalten. Bei Verwendung des auf Ate basierenden Restriktionsenzyms NotI wird jedes Chromosom bis zu sieben Mal geschnitten, wie angegeben. Die säulengereinigte DNA wird über Nacht bei 37 Grad in einem Heizblock mit NotI behandelt.

Nach der Hitzeinaktivierung von NotI wird die geschnittene DNA gemäß Herstellervorschrift bei 37 Grad mit Exonukleasen behandelt. Nach der Exonuklease-Behandlung werden die Enzyme 30 Minuten bei 70 Grad hitzeinaktiviert. Die vollständige Verdauung der gesamten linearen chromosomalen DNA kann mehrere Tage erfordern und wird durch zusätzliche Zugabe von ATP und Exonuklease unterstützt. Um sicherzustellen, dass sämtliche lineare DNA vollständig verdaut ist, werden die Proben mittels PCR- oder qPCR-Methoden unter Verwendung eines internen Referenzgens wie ACTI analysiert.

Teil vier, Amplifikation von DNA. In diesem Schritt bereichern und amplifizieren wir zirkuläre DNA unter Verwendung der Phi-29-Polymerase. Die Reaktion findet bei 30 Grad unter Verwendung von zufälligen Hexamer-Oligonukleotiden und Phi-29 statt.

Die Polymerase weist eine hohe Fidelity und eine Korrekturleseaktivität auf, wodurch eine unverzerrte DNA-Amplifikation gewährleistet ist. Jede Polymerase kann durch Replikation im Rolling-Circle-Mechanismus bis zu 100 Kilobasen DNA synthetisieren. Die Polymerase ist außerdem äußerst prozessiv und kann DNA um den Faktor bis zu 109 amplifizieren.

Teil fünf, Sequenzierung. Gemäß der Anleitung für eine Hochdurchsatz-Sequenzierung der nächsten Generation wird die DNA auf eine durchschnittliche Größe von 300 Basenpaaren sonifiziert und als 141 Nukleotide lange Einzel-End-Reads sequenziert. Die Sequenz-Reads werden mittels der kostenlosen Datenbank Galaxy auf das Referenzgenom von Saccharomyces cerevisiae abgebildet.

Die sequenzierten Daten werden in Galaxy hochgeladen, und die Reads werden mithilfe des Short-Read-Aligners Bowtie2, der die Zuordnung von Teil-Reads ermöglicht, abgebild�t. Teil sechs, repräsentative Ergebnisse. Nach der Sequenzierung und der Abbildung auf das Referenzgenom von Saccharomyces cerevisiae können die Reads im Genombrowser innerhalb der Galaxy-Software visualisiert werden.

DNA kreisförmigen Ursprungs kann beispielsweise als Region gezählt werden, die kohärente Reads umfasst, die länger als ein Kilobase sind, wie auf dem Bildschirm angezeigt. Ein Beispiel für eine Region auf Chromosom vier, die kohärente Reads enthält, die sich über mehr als eine Kilobase erstrecken, ist die Region mit den Hexosetransporter-Genen sechs und sieben. Bei Anwendung dieser Methode auf eine Population von Hefezellen werden häufig abgebildete Reads an diesem Locus gefunden, und die Read-Abdeckung deutet eindeutig darauf hin, dass sich ein DNA-Kreis zwischen paralogen Hexosetransporter-Genen gebildet hat.

Aufgrund der hohen Sequenzhomologie zwischen den Hexosetransporter-Genen schlagen wir vor, dass eine illegitime homologe Rekombination zur Zirkularisierung dieser DNA führt. Ein Modell für die Mutation zirkulärer DNA liegt vor, wenn der DNA-Reparaturprozess unvollständig abläuft. Wenn beispielsweise ein Doppelstrangbruch in einem repetitiven Element auftritt, kann die homologe Sequenz auf demselben Chromatid als Vorlage für die DNA-Reparatur mittels homologer Rekombination verwendet werden.

Nach Resektion, Stranginvasion, DNA-Synthese und Auflösung aller Verbindungen kann ein DNA-Kreis aus dem Genom herausschleifen und so eine DNA-Deletion auf dem Chromosom verursachen. Die Auswirkungen der Behandlung von DNA mit Exonukleasen und Phi-29-Polymerase können mittels Propidiumiodid-Färbung sichtbar gemacht werden. Kontrollen der genomischen DNA färben sich wie im linken Bild dargestellt, während sich Plasmid-DNA wie im rechten Bild zeigt.

Nach 29 Stunden Exonukleasebehandlung von 400 Nanogramm genomischer DNA wird der Großteil der DNA abgebaut, wie im linken Bild dargestellt. Dieses Ergebnis wird durch Gelelektrophorese bestätigt, wie auf dem Gelebild rechts gezeigt. Nach 72 Stunden Exonukleasebehandlung, gefolgt von DA-Synthese durch die Phi-29-Polymerase, können dennoch Millionen von DNA-Kopien nachgewiesen werden.

Ebenso wird nach 29 Stunden Exonuklease-Behandlung von 400 Nanogramm genomischer DNA sowie zusätzlichen 100 Nanogramm Plasmid-DNA der Großteil der genomischen DNA abgebaut. Die Plasmid-DNA hingegen wird, wie das Gelelektrophoresebild zeigt, nicht abgebaut. Nach der Behandlung mit Phi-29-Polymerase des 72 Stunden exonukleasebehandelten Probenmaterials erscheint der Großteil der amplifizierten DNA als angefärbte Plasmide.

Wir untersuchten zunächst Gene auf zirkuläre DNA und waren überrascht, mehrere hundert verschiedene Arten von DNA-Proben zu finden. Ja, es war wirklich überraschend, wie häufig DNA-Kreise in der Hefe-Population vorkommen, und wir sind der Ansicht, dass diese Methode für viele Arten von Studien genutzt werden kann. Offensichtlich wäre eine Anwendung die Untersuchung menschlichen Gewebes.

Wir wissen, dass Gene auf kreisförmigen Elementen amplifiziert werden können, und zwar in Hefe natürlich, aber auch in Tumorzellen. Ich denke, im Allgemeinen wird es interessant sein, somatische Zellen zu untersuchen und herauszufinden, welche Arten von zirkulärer DNA dort vorkommen und wie wir diesen Effekt beeinflussen könnten. Bei der Zirkularisierung beobachten wir in alternden Zellen eine Anhäufung von Zirkulären DNA-Strukturen mit zunehmendem Alter, und wir erwarten, dass mehr Gene auf zirkulärer DNA zu finden sein werden.

Des Weiteren möchten wir die molekularen Mechanismen der DNA-Zirkularisierung untersuchen, und es liegt nahe, Hefe zu analysieren, in der wir Mutanten mit Defekten in der homologen Rekombination vorliegen haben, sowie in der nicht-homologen Rekombination. Bei der Untersuchung dieser Mutanten erwarten wir, dass sich die DNA-Zirkularisierungsprofile zwischen den verschiedenen Mutantentypen unterscheiden, und hoffentlich werden wir aus Studien an Hefe viel über die DNA-Zirkularisierung lernen können. Im Vergleich zu anderen Methoden ist diese Methode deutlich empfindlicher und könnte tatsächlich in der Lage sein, den DNA-Kreis in etwa einer von 10.000 Zellen nachzuweisen.

Und soweit ich aus Studien weiß, die ausführlich durchgeführt wurden, müssen mutierte Allele normalerweise einen Anteil von einem bis 10 % der Population erreichen, bevor sie nachgewiesen werden können. Richtig, und bei dieser Technik benötigt man im Gegensatz zu anderen Verfahren keinerlei Vorwissen über die gebildeten DNA-Kreise. Solange die DNA-Kreise etwas gebunden sind, können sie leicht als Amplifikationen durch Sequenzierung oder Chromosomenfärbung detektiert werden.

Ja, ich denke, der eigentliche Hauptvorteil liegt in der Empfindlichkeit, und ich hoffe, dass wir mit dieser Methode viele interessante Dinge durchführen können.