Name: Erstellung von Einzel-Kohorte Kolonien und Hormonbehandlung von Arbeitshonigbienen Physiologie Assoziierte Analysieren mit Rolle und / oder endokrine System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Lernen Sie die Erstellung von Einzel-Kohorten-Kolonien bei Honigbienen, um die Physiologie von Arbeiterinnen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht Hormonbehandlungen mit Juvenilhormon und Ecdyson zur Analyse endokriner Regulation.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss für wissenschaftliche Forschung (B) und einen Zuschuss für wissenschaftliche Forschung in innovativen Bereichen 'Systemmolekulare Ethologie' vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) unterstützt. T.U. erhielt einen Zuschuss von der Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.

1. Herstellung von Einzel-Kohorte Kolonien <ol><li> Bereiten Sie drei Bienenvölker zu schaffen zwei Single-Kohorte Kolonien und eine ausreichende Anzahl von neu entstandenen Arbeiter zu erhalten. <ol><li> Überprüfen Sie, dass einige Puppen in den verkappten peripheren Zellen in den Waben haben braune Augen und ein pigmentiertes Kutikula durch die verkappten Kämme mit einer Pinzette zu öffnen. Wenn diese pupae in Umfangskammzellen vorhanden sind, werden die meisten Puppen in den ganzen Kämme entstehen in etwa 1-3 Tagen. </li><li> Anschließend sammeln die Kämme haben diese enthalten Puppen nach allen anhaftenden erwachsenen Bienen mit einer Bürste entfernt worden ist, und von den drei Kolonien Kämme mischen Variabilität unter Kolonien zu minimieren. </li></ol></li><li> Legen Sie die gesammelten Kämme in einem leeren Feld Struktur und Inkubation bei 33 ° C unter feuchten Bedingungen (&gt; 60% relative Luftfeuchtigkeit). Sammeln Sie rund 6.000 neu entstandenen Arbeiter über 3 Tage (3.000 Arbeiter pro Kolonie) aus den gesammelten Kämme. </li><li> Bestimmen Sie die Menge von workers bezogen auf das Gewicht von fünf neu entstandenen Arbeiter aus unmanipulated Kolonien zufällig gesammelt. <ol><li> Wiegen fünf neu entstandenen Arbeiter aus unmanipulated Kolonien mit einem Gewicht von Maschinen zufällig gesammelt. Hinweis: Das Gewicht von fünf neu entstandenen Arbeiter im Allgemeinen 500-600 mg ist. </li><li> Schätzen Sie die Menge der gesammelten Arbeiter durch das Gewicht der gesammelten Arbeiter durch das durchschnittliche Gewicht von fünf neu entstandenen Arbeiter geteilt wird. </li></ol></li><li> Bewerben Farbmarkierungen auf den thoraces von rund 1.800 Arbeiter (900 Arbeiter pro Kolonie) mit wasserbasierenden Plakatfarbe Marker. Hinweis: Waschbar Marker, der verwendet wird , um die Farbe aufzutragen ist in der Tabelle der Materialien aufgeführt. </li><li> Einführung einer Königin und etwa 3.000 der 0-2 Tage alten Arbeiter zu einem neuen Feld Struktur, die zwei Kämme enthält, ein Kamm aus Honig und Pollen als Konserven und andere leer Kamm für die Eiablage durch die Königin. Sammeln Sie den Kamm aus Honig und Pollen from eine andere unmanipulated Kolonie, nachdem alle anhaftenden Bienen werden entfernt. Hinweis: Die Nutzung der Kern hive Box (klein hive-Box) wird empfohlen. </li><li> Sammeln Krankenschwester Bienen und altklug foragers mit Farbmarkierungen 6 bis 8 Tage nach dem Single-Kohorte Kolonien zu schaffen. <ol><li> So sammeln Krankenschwester Bienen holen Arbeiter, die ihre Köpfe in Kamm Zellen gelegt kümmern sich um die Brut. Verwenden einer Pinzette die Krankenschwester Bienen Waben zu sammeln, die viele Brut und erwachsene Arbeitnehmer enthalten. Hinweis: Wenn HPGs der gesammelten Arbeiter entwickelt werden, wenn seziert als 1,7 in Schritt beschrieben, werden diese Arbeiter als Krankenschwester Bienen definiert. die thoraces durch Pinzette halten wird empfohlen, Arbeiter aus den Waben zu holen. </li><li> So sammeln foragers, verwenden Sie ein Insektennetz Arbeiter zu erfassen, die mit Pollen Lasten auf die Hinterbeine, um ihre Bienenstöcke zurück. Hinweis: Wenn HPGs der gefangenen Arbeiter geschrumpften erscheinen, wenn seziert als 1,7 in Schritt beschrieben, werden diese Arbeitnehmer als foragers definiert. </li></ol></li><li> Classifizieren die HPG in drei Gruppen, &quot;entwickelt&quot;, &quot;Intermediate&quot; und &quot;geschrumpfte&quot; durch die Präparation unter einem Stereomikroskop. <ol><li> Anesthetize 10-15 Bienen in einem Insekt Käfig in einem Kühlschrank für 10-15 Minuten, bis die Bienen fliegen oder kann nicht gehen. Dann Bienen auf Eis bewegen und die Anästhesie auf Eis für 5 min ab. Hinweis: Es dauert etwa 15-20 Minuten insgesamt zu Anästhesie erreichen. Wenn der Narkosezeit verkürzt werden muss, sollte die Anzahl der Bienen in einem Käfig auf 1-3 Bienen pro Käfig reduziert werden. </li><li> Präparieren Sie den Kopf vom Körper mit einer Schere und Pinzette. Befestigen Sie den Kopf auf Dentalwachs auf eine Petrischale gelegt mit Stiften. Legen Sie zwei Stifte in die Basen der Antennen den Kopf zu fixieren. Einweichen feste Köpfe in Insektensalzlösung (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2). </li><li> Entfernen Sie den vorderen Aspekt der Kutikula des Kopfes mit einer feinen Pinzette und einem chirurgischen Messer unter dem Binokular. Hinweis: Die HPGs kann leicht in den Kopf nach der Entfernung von c gefunden werdenuticle. Die HPG ist ein botryoid Organ, das rund um das Gehirn im Kopf existiert. </li><li> Entfernen Sie die Luftröhrengewebe, die eine weiße membranartige Gewebe unter der Oberhaut ist. Dann sezieren die HPGs vom Kopf, indem sie langsam mit einer Pinzette herausziehen. </li><li> Klassifizieren HPGs mit großen und Kreis acini als &quot;entwickelt&quot;. Klassifizieren HPGs mit kleinen und verzerrt acini als &quot;geschrumpfte&quot;. Klassifizieren HPGs entsprechend weder &quot;entwickelt&quot; noch &quot;geschrumpfte&quot; als &quot;Intermediate&quot;. Hinweis: Repräsentative Fotografien , die diese drei Klassen von HPG Staaten zeigen sind in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Betreff &quot;entwickelt&quot; und &quot;geschrumpfte&quot; HPGs zu RNA-Extraktion als &quot;Krankenschwester Biene HPGs &#39;und&#39; forager HPGs &#39;bezeichnet und die Genexpression in den HPGs zwischen Ammen und foragers (Abschnitt 4) zu vergleichen. </li></ol></li></ol> 2. Injektion von 20E <ol><li> Sammeln Krankenschwester Bienen aus typischen Kolonien als Beschribed in dem Verfahren 1.6.1. Hinweis: HPGs kann nicht in diesen Bienen untersucht werden, wie die Bienen gezüchtet werden. </li><li> Anesthetize die Bienen bei 4 ° C im Kühlschrank (nicht auf Eis). Hinweis: Es dauert etwa 30 min Anästhesie zu erreichen. Wenn die Anästhesiezeit verkürzt wird, sollte die Anzahl der Bienen im Käfig 1-3 Bienen pro Käfig reduziert werden. </li><li> Mit einer Pinzette zu immobilisieren, die Bienen auf Dentalwachs auf einem Teller Petri gelegt. </li><li> Injizieren Sie 1 ul 20E-Lösung in die Vorderseite des Kopfes eine Injektionsspitze aus einem kalibrierten Kapillare Mikro hergestellt unter Verwendung einer Glas Nadel Abzieher. <ol><li> Auflösen 20E in Ethanol-Insektensalzlösung (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2) Gemisch (1: 4) bei 2,5 ug / ul. </li><li> Verbinden Sie die Injektionsspitze an einem Gummischlauch, und eine Verbindung zu der gegenüberliegenden Seite des Rohres einen gelben Mikropipettenspitze. </li><li> Platz 1 ul 20E Lösung auf Parafilm mit einer Mikropipette, halten Sie die gelbe Mikropipettenspitze im Mund, eind die Lösung in die Injektionsspitze ziehen. </li><li> Legen Sie die Injektionsspitze in die Basis der Antennen, und die Lösung zu injizieren, indem sie durch die gelbe Mikropipettenspitze bläst. Hinweis: Das Protokoll in diesem Schritt gezeigt wird , ist der repräsentative Einspritzverfahren, aber die Verwendung der automatischen Injektionsmaschine ist aus Sicherheitsgründen als notwendig 20 empfohlen. </li></ol></li><li> Hinten die injizierten Bienen in Insekten Käfigen bei 33-36 ° C (die ideale Temperatur liegt bei 35 ° C) unter dunklen und feuchten Bedingungen (&gt; 60% relative Luftfeuchtigkeit) für 1 oder 3 Tage. Versorgungs Honig-Wasser-Gemisch (1: 1) an die Bienen. Bei Bedarf zählen Bienen nach der Injektion zu überleben. </li></ol> 3. Anwendung von Methoprene <ol><li> Sammeln Sie die Kämme, die Puppen aus typischen Kolonien nach allen anhaftenden erwachsenen Bienen entfernt werden mit einem Pinsel enthalten. Inkubieren der Kämme bei 33-36 ° C (die optimale Temperatur beträgt 35 ° C) unter feuchten Bedingungen (&gt; 60% relative Luftfeuchtigkeit) für bis zu 1 Tag. </li><li&gt; Sammeln frisch geschlüpfte Bienen aus den gesammelten Kämme und Farbmarkierungen auf ihre thoraces mit Plakatfarbe gelten wie für die Vorbereitung Single-Kohorte Kolonien im Protokoll beschrieben. Bringen Sie die markierten Bienen in ihre Kolonien. </li><li> Nach 6 Tagen bemalten Arbeiter (6 Tage alt) aus den Kolonien zu sammeln. Pick-up gemalt Arbeiter aus den Waben durch ihre thoraces mit einer Pinzette zu halten. </li><li> Anesthetize die Bienen bei 4 ° C im Kühlschrank (nicht auf dem Eis), wie in dem Verfahren 2.2. Mit einer Pinzette zu immobilisieren, die Bienen auf Dentalwachs auf einem Teller Petri gegeben und gelten 1-5 ul Methopren Lösung (50-250 ug / ul), gelöst in Aceton, um ihre Köpfe mit einer Mikropipette. Verwenden Sie eine Filterspitze, die Aceton beständig ist. Hinweis: Aceton können die schädlichen Auswirkungen auf Bienen haben zum Tod führt. Wenn die hohe Sterblichkeit der Bienen beobachtet wird, wird die Verringerung des Volumens von Aceton zu 1 &amp; mgr; l bei der minimalen empfohlen. </li><li> Hinten die Bienen in Insekten Käfigen bei 33-36 ° C (ideal temperaturbereich ist 35 ° C) für 7 Tage unter dunklen und feuchten Bedingungen (&gt; 60% relative Luftfeuchtigkeit). Versorgungs Honig-Wasser-Gemisch (1: 1) an die Bienen. Bei Bedarf zählen Bienen nach der topischen Anwendung zu überleben. Hinweis: In diesem Artikel werden überlebenden Bienen 7 Tage nach der Anwendung gezählt (Tabelle 3). </li></ol> 4. RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR <ol><li> Anesthetize Bienen und sezieren HPGs wie in den Schritten 1.7.1 bis 1.7.4 beschrieben. </li><li> Sammeln Sie die seziert HPGs in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis und bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li><li> In 400 ul des Reagenz zur Denaturierung von Proteinen. Hinweis: Dieses Reagenz im Handel erhältlich ist (siehe die Tabelle der Materialien). </li><li> Homogenisieren HPG Gewebe eine Hand elektrischen Mixer mit einer Homogenisierung zerstoßen, die in einem Mikrozentrifugenröhrchen passt. Homogenisieren für 1 min auf Eis bei einer Rotationsgeschwindigkeit von ungefähr 300 rpm zu brechen und lysieren Gewebezellen. Tabelle der Materialien sehen). </li><li> In 80 ul Chloroform und gut mischen. Inkubieren für 5 min bei RT. </li><li> Zentrifugieren der Mikrozentrifugenröhrchen bei 14.170 xg für 15 min bei 4 ° C. Die wäßrige Phase in ein neues Röhrchen. Hinzufügen eines gleichen Volumens an Isopropanol und 1 ul Glycogen (5 mg / ml). Inkubieren bei -20 ° C für mindestens 20 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße bei 14170 × g für 10 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> In 400 ul 75% Ethanol zu dem Pellet und gut mischen, Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße bei 14170 × g für 15 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diese Verfahren noch einmal. </li><li> Der Luft trocknen das Pellet für 5-10 min und dann in 10 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser auflösen. Hinweis: Die vollständige Trocknung des Pellets Unlöslichmachen des RNA-Pellet in Wasser führen kann. Somit wird das Pellet leicht feucht ist, ist geeignet fürAuflösung. </li><li> Messen Sie die RNA-Konzentration ein Spektrophotometer wie Nanodrop oder ähnliches verwendet wird. </li><li> Behandlung von 500 ng Gesamt-RNA mit 2,0 U DNase I für 30 min bei 37 ° C inkubiert vorhandene kontaminierende genomische DNA zu degradieren. </li><li> Rückwärts-transkribieren 200 ng DNase I behandelten RNA und führen PCR Echtzeit im Handel erhältlichen Kits (siehe die Liste in der Tabelle der Materialien und Reagenzien) und Gen-spezifischen Primer (mrjp2; 5&#39;-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 &#39;und 5 &#39;-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3&#39;, Hbg3; 5&#39;-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 &#39;und 5&#39;-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3&#39;). Führen Sie die PCR wie folgt: [95 ° C x 30 sec + (95 ° C x 5 sec + 60 ° C x 15 s + 72 ° C x 20 sec) x 45-55 Zyklen]. </li><li> Normalisieren der Menge an Transkript mit der Elongationsfaktor 1α-F2 (EF1α˗F2) oder ribosomale Protein 49 (rp49) 9,16,21,22. Diese Gene sind zuverlässige Kontrolle genen für die Genexpression in den HPGs mit qRT-PCR-Analyse. </li><li> Führen Sie two-tailed t-Test, um die signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen (Ammenbienen vs. altklug foragers, 20E behandelten Bienen vs. Kontrolle Bienen und Methopren behandelten Bienen vs. Kontrolle Bienen) mit Hilfe statistischer Software zu erkennen. Hinweis: Wenn F-Test, um die Homogenität der Varianz, Student-t-Test verwendet werden können, übernimmt. Wenn nicht, kann Welch t-Test verwendet werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Herstellung von Single-Kohorte Kolonien Hier haben wir beschrieben , das Protokoll in unserer früheren Studie 16 verwendet , um Single-Kohorte Kolonien für die Analyse von HPG Physiologie vorzubereiten im Zusammenhang mit der Verschiebung der Rolle der Arbeiterbienen. Krankenschwester Bienen und altklug foragers, die die Kriterien in den Verfahren beschrieben erfüllt 1,6-1,7 und 2 wurden in den Single-Kohorte Kolonien (Tabelle 1) beobachtet. Die A...

Die Europäische Honigbiene, Apis mellifera, ist ein eusocial Insekt mit einer hoch organisierten Gesellschaft 1. Arbeiter Honigbienen (Arbeits Kaste) sind in verschiedener Aufgaben Kolonie Aktivität zu erhalten, und diese Aufgaben ändern sich je nach dem Alter des Arbeitnehmers Honigbiene nach dem Schlüpfen, die als altersbedingte Arbeitsteilung bezeichnet wird 2-4. Junge Arbeitnehmer (&lt;13 Tage alt) kümmern sich um die Brut in den Bienenstock von Gelée Royale sezer (Ammen), während ältere Arbeitnehmer (&gt; 15 Tage alt) sammeln Nektar und Pollen außerhalb des Bienenstocks (foragers) 2-4. Die Physiologie der Arbeiter ändert sich in Verbindung mit dieser Rolle Verschiebung. Zum Beispiel kann die Funktion der Hypopharynxdrüsen (HPGs), gepaart im Kopf befindet exokrinen Drüsen, Änderungen im Zusammenhang mit der Rolle Verschiebung von Pflege bis 2,5 Nahrungssuche. Krankenschwester Biene HPGs synthetisieren hauptsächlich großen Gelee royale Proteine, die wichtigsten Komponenten der Bienenmilch sind. Auf der anderen Seite, forager HPGs hauptsächlichKohlenhydrat-metabolisierende Enzyme wie α-Glucosidase III synthetisieren Nektar in Honig zu verarbeiten, indem Saccharose in Glucose und Fructose umwandelt. Unseren früheren Studien zeigten , dass die Expression von mrjp2, die einen Haupt Gelée royale - Protein kodiert, und Hbg3, die während der Rolle Verschiebung 6-9 α-Glucosidase III, Änderungen kodiert. Um zu bestimmen, ob die physiologischen Veränderungen in den Arbeiter Geweben, einschließlich der HPGs, mit der Rolle Verschiebung oder mit dem Alter der Arbeiter verbunden ist, wäre es nützlich, die Population Zusammensetzung eines Bienenvolk zu manipulieren, beispielsweise single-Kohorte vorzubereiten Kolonien , in denen Arbeiter fast im gleichen Alter führen verschiedene Aufgaben 10,11. Robinson et al. (1989) beschrieben , ein Verfahren zur Herstellung einer Einzelkolonie Kohorten 10 herzustellen. Einzel-Kohorte Kolonien umfassen zunächst eine Königin und 0-2 Tage alten Arbeiter. Einige Tage nach der Kolonien Gründung, Arbeiter von almost im gleichen Alter übernehmen verschiedene Aufgaben. Einige Arbeiter verrichten Pflegeaufgaben wie in typischen Kolonien, während andere Arbeiter Nahrungssuche Aufgaben früher als üblich und werden so altklug foragers genannt. Die Genexpression Vergleiche zwischen Ammen und altklug foragers würde nützliche Informationen über die Rolle assoziierte Physiologie der Arbeiter Gewebe 16.12. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für 16 Single-Kohorte Kolonien für die Analyse der rollen- und / oder altersassoziierte Physiologie der HPGs vorbereitet. Wir beschreiben auch kurz , wie die Genexpression von mrjp2 und Hbg3 durch quantitative reverse Transkription-Polymerase - Kettenreaktion (RT-PCR) zu untersuchen HPG Physiologie zu untersuchen. Neben der Analyse der Arbeiter Physiologie im Einzel Kohorte Kolonien, Prüfung des endokrinen Systems ist wichtig für die Regulationsmechanismen der Rolle assoziierten Arbeiter Physiologie zu analysieren. Juvenile Hormon (JH), die kno istwn als in Insektenlarven Hormon &#39;Status quo&#39;, beschleunigt den Wandel in der Rolle von Pflege in Arbeitshonigbienen 11 bis Nahrungssuche. Weiterhin Ecdyson, das als Häutungshormons während der Metamorphose bekannt ist, könnte in der Rolle Verschiebung als Gene , die für Ecdyson Signalmoleküle in den Pilzkörpern, ein höheres Zentrum des Arbeiters brain 17-19 exprimiert werden beteiligt sein. Deshalb beschreiben wir auch das detaillierte Protokoll in unserer früheren Studie 16 verwendet , um Arbeitnehmer mit 20E behandeln, die eine aktive Form von Ecdyson ist, und Methopren, ein JH analog zur Analyse der Wirkung des endokrinen Systems auf HPG Physiologie (Expression von mrjp2 und Hbg3).

<table><tbody><tr><td>UNIPOSCA</td><td>Mitsubishi Bleistift</td><td>PC-5M</td><td>Marker zum Aufbringen von Markierungen auf Bienen&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>20-Hydroxyecdyson</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Methopren</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33375</td><td></td></tr><tr><td>Zuchtfall Insekt</td><td>IRIS OHYAMA</td><td>CP-SS</td><td></td></tr><tr><td>Electromotion mixier&nbsp;</td><td>ISO</td><td>23M-R25</td><td>Homogenisierung von Gewebe</td></tr><tr><td>TRIZol Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>das Reagenz für die Gesamt-RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Takara</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Reagenzienkit</td><td>Takara</td><td>RR037A</td><td>das Reagenz für die reverse Transkription</td></tr><tr><td>SYBR Premix ExTaq II</td><td>Takara</td><td>RR820A</td><td>das Reagenz für die real-time PCR</td></tr><tr><td>LightCycle 1.2 Instrument</td><td>Roche</td><td>12011468001</td><td>das Instrument für real-time</td></tr><tr><td>PCR LightCycle Kapillaren (20&mu; l)</td><td>Roche</td><td>4929292001</td><td>das Material für die real-time PCR</td></tr></tbody></table>

erstellung von einzel-kohorte kolonien und hormonbehandlung von arbeitshonigbienen physiologie assoziierte analysieren mit rolle und / oder endokrine system

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Honigbienenarbeiter sind mit verschiedenen Aufgaben beschäftigt, die mit der Aufrechterhaltung der Kolonieaktivität zusammenhängen. Die Aufgaben der Arbeiter ändern sich je nach Alter (altersbedingte Arbeitsteilung). Junge Arbeiterinnen sind mit der Brutpflege beschäftigt (Ammenbienen), während ältere Arbeiterinnen mit der Suche nach Nektar und Pollen beschäftigt sind (Sammler). Die Physiologie der Arbeiter verändert sich in Verbindung mit diesem Rollenwechsel. Zum Beispiel ändert sich die Hauptfunktion der Hypopharynxdrüsen (HPGs) von der Sekretion der wichtigsten Gelée Royale-Proteine (MRJPs) zur Sekretion von kohlenhydratmetabolisierenden Enzymen. Da sich die Aufgaben der Arbeiter in typischen Kolonien mit dem Alter der Arbeiterinnen ändern, ist es schwierig, die physiologischen Veränderungen, die mit dem Altern auftreten, von denen zu unterscheiden, die mit dem Rollenwechsel auftreten. Um die physiologischen Veränderungen im Gewebe der Arbeiterinnen, einschließlich der HPGs, in Verbindung mit der Rollenverschiebung zu untersuchen, wäre es nützlich, die Population der Honigbienenvölker zu manipulieren, indem man einzelne Kohortenvölker präpariert, in denen Arbeiterinnen im fast gleichen Alter unterschiedliche Aufgaben ausführen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von Einzelkohortenvölkern für diese Analyse. Sechs bis acht Tage nach der Vorbereitung der Einzelkohortenkolonie erscheinen frühreife Sammler, die früher als üblich die Nahrungssuche durchführen, in der Kolonie. Repräsentative Ergebnisse deuteten auf rollenassoziierte Veränderungen der HPG-Genexpression hin, was auf eine rollenassoziierte HPG-Funktion hindeutet. Neben der Manipulation der Koloniepopulation ist die Analyse des endokrinen Systems wichtig für die Untersuchung der rollenassoziierten Physiologie. Hier beschreiben wir auch ein detailliertes Protokoll zur Behandlung von Arbeitern mit 20-Hydroxyecdyson (20E), einer aktiven Form von Ecdyson, und Methopren, einem juvenilen Hormonanalogon. Die Überlebensrate der behandelten Bienen war ausreichend, um die Genexpression in den HPGs zu untersuchen. Es wurden Veränderungen der Genexpression als Reaktion auf eine 20E- und/oder Methopren-Behandlung beobachtet, was darauf hindeutet, dass Hormonbehandlungen physiologische Veränderungen der HPGs induzieren. Das hier beschriebene Protokoll für die Hormonbehandlung ist geeignet, um hormonelle Auswirkungen auf die Physiologie der Arbeitnehmer zu untersuchen.

Eine Übersicht über das Protokoll single-Kohorte Kolonien zur Herstellung ist in 1A veranschaulicht. Zeitverlauf der Experimente von Single-Kohorte Kolonien Vorbereitung der Probenahme ist in 1B gezeigt. Arbeiter, die die Verhaltenskriterien für Pflegeverhalten oder Fraßverhalten erfüllt wurden von Single-Kohorte Kolonien gesammelt und HPG Entwicklung wurde in dieser Arbeiter Tabelle 1 zeigt die Einteilung der HPG Entwicklung in drei Gru...

Hier beschreiben wir unser ausführliches Protokoll zur Herstellung von Single-Kohorte Bienenvölker - ein nützliches Werkzeug für die Analyse der Rolle-assoziierten Arbeiter Physiologie. Wir beschreiben auch detaillierte Protokolle für Arbeitnehmer mit Juvenilhormons und Ecdyson Behandlung der Beteiligung dieser Hormone an der Regulation der Arbeiter Verhalten und / oder Physiologie zu bewerten.

Erstellung von Einzel-Kohorte Kolonien und Hormonbehandlung von Arbeitshonigbienen Physiologie Assoziierte Analysieren mit Rolle und / oder endokrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, die Physiologie von Arbeitsbienen im Zusammenhang mit ihrer sozialen Rolle und dem Zustand ihres endokrinen Systems zu untersuchen. Diese Methode wird häufig zur Analyse des Verhaltens von Arbeitsbienen eingesetzt und kann ebenfalls helfen, zentrale Fragen zur Beziehung zwischen Physiologie und der Rolle von Arbeitsbienen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie relativ einfach durchzuführen ist.Um zwei Kolonien mit jeweils einer einzigen Altersgruppe zu erstellen, beginnen Sie mit drei Standardkolonien und sammeln Sie neu geschlüpfte Arbeiterinnen aus jeder der drei Kolonien. Überprüfen Sie die Kolonien mithilfe einer Pinzette regelmäßig auf das Auftreten von Puppen in den verschlossenen Randzellen mit braunen Augen und pigmentierter Kutikula. Sobald diese gefunden wurden, schlüpfen die meisten Puppen innerhalb der nächsten Tage. Danach die erwachsenen Bienen von den Waben abbürsten und die Waben aus dem Stock entfernen. Eine solche Wabe aus jedem der drei Stöcke in eine leere Kernbeute zusammenfügen. Zwei solche Kernbeuten anlegen und bei 33 Grad Celsius mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von mindestens 60 % inkubieren. In den folgenden drei Tagen jeweils etwa 3.000 frisch geschlüpfte Arbeitsbienen aus jeder neuen Kernbeute sammeln.Um die Anzahl der Bienen in jeder Sammlung abzuschätzen, wiegen Sie fünf zufällig ausgewählte, frisch geschlüpfte Arbeiterinnen und verwenden deren durchschnittliche Masse im Vergleich zur Masse der gesammelten Arbeiterinnen, um die Anzahl der Bienen zu schätzen. Bereiten Sie neue Bienenstockkästen mit einem Wabenstück vor, das mit Honig und Pollen aus einer nicht manipulierten Kolonie beladen ist, sowie einem weiteren leeren Wabenstück. Markieren Sie anschließend die Thoraces von etwa 900 Arbeiterinnen in jeder neuen Kolonie mit wasserbasierten Farbstiften für Plakatfarben.Überführen Sie dann die Sammlung von Arbeiterinnen in diese neuen Bienenstockkästen und fügen Sie eine Königin hinzu. Sechs bis acht Tage nach dem Aufstellen der Einzelkohortenkolonien sammeln Sie einige ihrer Ammenbienen und frühreifen Sammlerinnen zur Analyse. Um die Ammenbienen zu sammeln, verwenden Sie eine Pinzette, um Bienen auszuwählen, die ihre Köpfe in Wabenwaben stecken, um die Brut zu versorgen.Heben Sie sie am Thorax auf. Um Sammlerinnen zu sammeln, fangen Sie mit einem Insektennetz Arbeiterinnen ein, die mit Pollenlasten an den Hinterbeinen zu ihren Völkern zurückkehren. Um die HPGs der Honigbienen zu klassifizieren, überführen Sie eine Sammlung von 10 bis 15 Bienen in einen Insektenkäfig und betäuben Sie sie bei vier Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten, bis die Bienen weder fliegen noch laufen können.Überführen Sie die Bienen anschließend zur Betäubung für etwa fünf Minuten auf Eis, bis sie vollständig anästhesiert sind. Lassen Sie die Bienen danach so lange auf dem Eis, bis sie benötigt werden. Trennen Sie nun mit einer Schere und einer Pinzette die Köpfe von den Körpern.Befestigen Sie die Köpfe in einer Petrischale mit Insektennadeln in Zahnwachs. Verwenden Sie hierzu zwei Nadeln, die in die Basis der Antennen eingeführt werden. Tauchen Sie die fixierten Köpfe nun in Insekten-Salzlösung ein und stellen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop.Entfernen Sie mithilfe feiner Pinzette und eines chirurgischen Messers die vordere Kutikula vom Kopf, um die Bereiche um das Gehirn freizulegen. Entfernen Sie anschließend das weiße membranöse tracheale Gewebe unterhalb der Kutikula, um die HPGs freizulegen. Danach werden die HPGs durch vorsichtiges Herausziehen mit der Pinzette vom Kopf abpräpariert.Klassifizieren Sie die HPG mit großen und kreisförmigen Aseni als entwickelt und betrachten Sie sie als von Pflegebienen stammend. Klassifizieren Sie die HPG mit kleinen und verzerrten Aseni als geschrumpft und betrachten Sie diese als von Sammelbienen stammend. Klassifizieren Sie die HPG, die weder als entwickelt noch als geschrumpft eingestuft werden, als intermediär.Verwenden Sie die entwickelten und geschrumpften HPGs zur RNA-Extraktion, um ihre Genexpression zu vergleichen. Sammeln Sie Pflegebienen aus typischen Kolonien, wie zuvor beschrieben. Betäuben Sie die Pflegebienen bei vier Grad Celsius für etwa 30 Minuten.Danach die Bienen mit einer Pinzette auf Zahnpflege-Wachs in einer Petrischale fixieren. Sobald sie fixiert sind, die Köpfe der Pflegebienen mit einem Mikroliter 20E-Lösung injizieren. Verwenden Sie hierfür eine kalibrierte Kapillar-Mikropipette.Verbinden Sie die Injektionsspitze mit einem Gummischlauch und verbinden Sie die 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze mit dem gegenüberliegenden Ende des Schlauchs. Laden Sie anschließend ein Mikroliter der 20E-Lösung auf ein Stück Parafilm. Saugen Sie die Lösung dann mittels Mundaspiration in die Injektionsspitze. Als Nächstes die Injektionsspitze an der Basis der Antennen einsetzen und die Lösung einzuwerfen, indem man in das Rohr ausatmet. Alternativ kann eine automatisierte Injektionsmaschine verwendet werden, falls vorhanden. Die behandelten Bienen in Insektenkäfigen bei 35 Grad Celsius unter dunklen und feuchten Bedingungen aufziehen.Fügen Sie Honigwasser zur Ernährung hinzu und verfolgen Sie die Überlebensrate nach Bedarf. Sammeln Sie Waben mit Puppen aus einem Volk und inkubieren Sie sie bis zu einem Tag lang bei 35 Grad Celsius und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % oder mehr. Sammeln Sie die neu geschlüpften Bienen von den Waben und bringen Sie Farbmarkierungen auf ihren Thoraxen mit Plakatfarbe an.Bringen Sie diese Bienen anschließend zu ihren Kolonien zurück. Nach sechs Tagen sammeln Sie die markierten Arbeiterinnen aus den Kolonien und betäuben sie für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Betäubung fixieren Sie die Bienen mithilfe von Pinzette und Zahnwachs, wie zuvor beschrieben.Tragen Sie dann ein bis fünf Mikroliter Methopren und Aceton mit einer gegenüber Aceton beständigen Mikropipette auf ihre Köpfe auf. Züchten Sie die Bienen in Käfigen, wie zuvor beschrieben. Wenn eine hohe Sterblichkeit beobachtet wird, reduzieren Sie das Volumen des Acetons auf ein Mikroliter.Arbeiterinnen, die die Verhaltenskriterien für Pflege- oder Sammelverhalten erfüllten, wurden aus Einheitskohortenkolonien gesammelt und ihre HPG-Entwicklung wurde geschätzt. Basierend auf den HPG-RNA-Extraktionen und der quantitativen RT-PCR war die Expression von MRJP2 in Pflegebienen angereichert und die von Hbg3 in vorzeitigen Sammlerinnen. Ausgewählte Arbeiterinnen wurden mit 20E injiziert und die überlebenden Bienen wurden gezählt.Sieben Tage nach der Injektion waren etwa 60 % bis 80 % der injizierten Bienen am Leben. Die Kontrollinjektion zeigte ähnliche Ergebnisse. Die quantitative RT-PCR-Analyse zeigt, dass die 20E-Injektion die Expression von MRJP2 in den HPGs verringerte.Dasselbe trat mit Hbg3 in den HPGs auf. Zusätzlich zu 20E wurde der Einfluss einer topischen Methopren-Anwendung auf die Expression von MRJP2 und Hbg3 in den HPGs untersucht. Nach der topischen Applikation überlebte der größte Teil der Bienen bis zu sieben Tage.RNA, das aus diesen Überlebenden gewonnen wurde, zeigt, dass die Applikation von Methopren die Expression von MRJP2 hemmte und die Expression von Hbg3 verstärkte. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Einzelkohorten-Kolonien vorbereitet und die Bienen mit Hormonen behandelt, um die mit den Arbeitsrollen und dem endokrinen System assoziierte Physiologie der Arbeitsbienen zu analysieren. Sobald diese Methoden beherrscht sind, kann die Klassifizierung der HPG innerhalb von fünf Minuten durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Bei der Injektion der Hormonlösung ist es wichtig, den Schaden an den Bienen durch Anästhesie und Injektion so gering wie möglich zu halten, um die Bienen während der Aufzucht am Leben zu erhalten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Honigbienen gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Bienenanzügen und Handschuhen, wenn Sie Bienen sammeln oder mit Bienenvölkern arbeiten.

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Research

Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

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Erstellung von Einzel-Kohorte Kolonien und Hormonbehandlung von Arbeitshonigbienen Physiologie Assoziierte Analysieren mit Rolle und / oder endokrine System (Video) | JoVE Journal

Erstellung von Einzel-Kohorte Kolonien und Hormonbehandlung von Arbeitshonigbienen Physiologie Assoziierte Analysieren mit Rolle und / oder endokrine System

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