Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, mit Hilfe von Zebrafischen die Wirkung von Nephrotoxinen wie Gentamicin oder Cisplatin zu beobachten, um akute Nierenschäden zu modellieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Zebrafischmodell die Echtzeit-Bildgebung von Zellschäden und -regeneration nach akutem Nierenversagen ermöglicht. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie ein Embryomanipulationswerkzeug vor, um die Embryonen für die Mikroinjektion zu positionieren, indem Sie eine Gelladespitze am Ende einer fünf Zoll großen geraden Präpariernadel anbringen und sie mit Klebeband oder Sekundenkleber sichern.

Bereiten Sie als Nächstes einige feine konische Mikroinjektionsnadeln vor, indem Sie die feuerpolierten Borosilikatgläser mit einem Pipettenabzieher mit Filament ziehen. Schneide dann mit einer Rasierklinge oder einer feinen Pinzette die Nadelspitzen ab, um scharfe, eckige Injektionsspitzen zu erhalten. Legen Sie anschließend die Nadeln auf einen Streifen Modelliermasse in einer Petrischale, um die Nadelspitzen zu schützen.

Um die Mikroinjektionsschale herzustellen, bereiten Sie die 1,5%ige Agarose-E3-Soluation in einem 100-Milliliter-Erlenmeyerkolben vor, indem Sie die Agarose mit E3 in der Mikrowelle auflösen. Lassen Sie die Mischung dann etwa zehn Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen. Gießen Sie die abgekühlte Agarose-E3-Lösung in eine Petrischale, um ein Fundament mit einer Tiefe von etwa 0,5 Zentimetern herzustellen.

Nachdem es sich verfestigt hat, gießen Sie eine zweite Schicht Agarose E3-Lösung. Führen Sie dann die vorgefertigte Embryo-Well-Form in den Agar ein, in einem Winkel, um Luftblasen zu vermeiden, und lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur erstarren. Nachdem die gesamte Mikroinjektionsschale fest geworden ist, heben Sie die vorgefertigte Embryo an, formen Sie sie langsam und vorsichtig aus, füllen Sie die Schale mit E3-Lösung und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.

Bei diesem Verfahren werden die Zebrafisch-Begattungsbecken eingerichtet, indem Trennwände in die Begattungskammern eingesetzt und mit Systemwasser befüllt werden. Platzieren Sie dann einen Fisch auf jeder Seite der Trennwand, so dass jede Paarungskammer einen weiblichen und einen männlichen Fisch enthält, und decken Sie beide Paarungskammern ab. Entfernen Sie am nächsten Morgen die Trennwände, um das Laichen zu ermöglichen.

Überprüfen Sie nach etwa 30 Minuten, ob sich am Boden des Tanks Embryonen befinden. Setzen Sie dann die Fische wieder in das Aquarium zurück und sammeln Sie ihre Embryonen, indem Sie das Wasser des Paarungsbeckens durch ein feines Drahtsieb leiten. Als nächstes drehen Sie das Sieb über eine Petrischale und spülen es mit E3 aus, um die Embryonen zu sammeln.

Anschließend werden die Embryonen über Nacht bei 28,5 Grad Celsius inkubiert. Wenn die Embryonen das Somitenstadium von 24 bis 26 Jahren erreichen, wird der größte Teil des E3-Mediums dekantiert. Dann dechorionieren Sie sie, indem Sie E3-Medien hinzufügen, dann 100 Mikroliter 50 Milligramm pro Milliliter Pronase in jede Schale mit Embryonen geben und dann die Embryonen 15 Minuten lang bei 28 Grad Celsius inkubieren.

Füllen Sie die Schale nach 15 Minuten mit E3 und schwenken Sie sie dann vorsichtig, um die Chorionen von den Embryonen zu lösen. Dann die E3-Pronase dekantieren und die Schale mit 25 Millilitern frischem E3.To ausspülen, um die Entwicklung der Pigmentierung zu blockieren, E3 24 Stunden nach der Befruchtung durch 25 Milliliter frisches E3 PTU ersetzen. Ersetzen Sie bei Experimenten, die sich über mehrere Tage erstrecken, die E3-PTU-Lösung einmal täglich durch frisches Medium, um die Schale sauber zu halten.

Bereiten Sie am Tag der Injektion die gewünschte Nephrotoxinlösung mit der entsprechenden Fahrzeugkontrolle vor. Vortexen oder sanft mischen. Überprüfen Sie anschließend die Seiten des Röhrchens und die Oberseite der Wassersäule, um sicherzustellen, dass die Arzneimittel in Lösung aufgelöst sind.

Laden Sie eine getrimmte Mikroinjektionsnadel mit zwei bis drei Mikrolitern Nephrotoxin, indem Sie eine feine Gelladespitze in die Rückseite der Nadel einfädeln, und hängen Sie die Nadel vertikal mit einem Stück Klebeband auf, damit die Lösung die getrimmte Nadelspitze durch die Schwerkraft füllen kann. Sobald die Nadelspitze voll ist, befestigen Sie die geladene Nadel im Mikromanipulator. Testen Sie das Mikroinjektionsvolumen, indem Sie einen Tropfen Mineralöl auf einen Mikrometerschieber geben und in das Öl injizieren, um die Tröpfchengröße zu bestimmen.

Nehmen Sie als Nächstes die Schale mit den Embryonen aus dem Inkubator und betäuben Sie sie, indem Sie fünf Milliliter 0,2%iges Tricain in die Embryoschale geben. Anschließend übertragen Sie die Embryonen mit einer Transferpipette in die Spritzgießform. Manövriere jeden Embryo in eine andere Vertiefung der Form und setze den Kopf in den tiefsten Bereich der Vertiefung, so dass der Rumpf entlang der Vertiefung aufliegt und der Schwanz ein wenig herausragt.

Führen Sie nun die gefüllte Nadel in den Mikromanipulator ein und positionieren Sie die Nadelspitze neben einem Embryo. Führen Sie die Nadel vorsichtig in die Schwanzvene ein, um sie zu mikroinjizieren. Der kritischste Schritt des Verfahrens ist die Mikroinjektion.

Um den Erfolg zu gewährleisten, muss die Nadel in einem spitzen Winkel geschnitten werden, sie muss vorsichtig in Position neben dem Embryo gebracht werden. Wenn die Injektion erfolgreich ist, sollten Sie sehen, dass die Flüssigkeit in den Kreislauf gelangt. Eine Co-Injektion des Nephrotoxinums mit fluoreszierend konjugiertem Dextrin würde es dem Forscher ermöglichen, die erfolgreiche Injektion nach dem Eingriff zu überprüfen.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Nadel vom Embryo. Übertragen Sie den Embryo in ein sauberes Geschirr und spülen Sie ihn mit frischem E3 PTU ab, um das Tricain zu entfernen. Inkubieren Sie dann den Embryo zum gewünschten Zeitpunkt, um die Morphologie zu beurteilen, die durch Fotografie in Methylcellulose-Einbettmedien dokumentiert werden kann.

Oder Verfahren zur experimentellen Analyse nach Wunsch. Beachten Sie, dass die Genesung von Embryonen alle 12 bis 24 Stunden nach der Injektion beurteilt werden sollte, um den Prozentsatz der Personen mit Ödemen zu bestimmen, die häufig auf eine Nierenschädigung hinweisen. Die Transparenz des Zebrafischembryos erleichtert das Mikroinjektionsverfahren und kann durch eine chemische PTU-Behandlung bei 24 hpf weiter verbessert werden, um die Entwicklung der Pigmentierung während eines typischen experimentellen Zeitverlaufs zu verringern.

Hier wurden die Embryonenproben durch das 72-HPF-Stadium entwickelt und dann entweder scheininjiziert, mit einem Mikroimplantat oder mit 2,5 Milligramm pro Milliliter Gentamicin mikroinjiziert. Die anschließende Live-Beobachtung wurde ein und zwei Tage nach der Injektion unter Verwendung von Durchleuchtungsbeleuchtung mit einem Stereomikroskop durchgeführt. Im Vergleich zu Schein- oder Kochsalzlösungsembryonen zeigten nur die injizierten Gentamicin-Individuen die Entwicklung von Ödemen.

In diesem Fall handelt es sich um ein Perikardödem, das auf eine Aufhebung der normalen Nierenfunktion hindeutet, die mit zuvor veröffentlichten Beobachtungen übereinstimmt. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die Hybridisierung des gesamten Mount C2, durchgeführt werden, um Veränderungen in der Genexpression nach Nephrotoxin-Exposition zu erschließen.