Name: Funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen, die eine pfropfreaktive Immunität hemmen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Lernen Sie die phänotypische und funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen aus allotransplantierten Herzen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung ihrer Rolle bei der Immunmodulation und der Verbesserung des Allograft-Überlebens.

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Wir anerkennen die technischen Beiträge der Durchflusszytometrie, der Mikrochirurgie und der Bio- / Pathologie-Zentren der Forschungs-Exzellenz am Berg Sinai. Diese Arbeit wurde von der COST-Aktion BM1305 unterstützt: Maßnahmen zur Fokussierung und Beschleunigung zelltolerogener Therapien (A FACTT), dem Entwicklungszentrum des Sinai Recanati / Miller Transplantationsinstituts, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R und SAF2016-80031-R JO

<html> In dieser Studie sind Mäuse in Übereinstimmung mit den Vereinigten Staaten Department of Agriculture Leitlinien und die Empfehlungen der Public Health Service Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren untergebracht. Alle experimentellen Techniken, die den tierischen Gebrauch beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Utilization Committee (IACUC) -approved Protokolle der Mount Sinai School of Medicine durchgeführt. 1. Medienvorbereitung <ol><li> Vorbereiten des vollständigen RPMI 1640-Mediums mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin (10.000 U / ml) unter Verwendung von 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht essentiellen Aminosäuren, 5 mM HEPES und 0,05 mM 2 -captoethanol </li></ol> 2. Allograft-Isolierung und Einzelzell-Suspension ANMERKUNG: Die Transplantations- und Anastomosetechnik der Pulmonalarterie und der minderwertigen Cava-Vene wurde zunächst von Corry und Mitarbeitern beschrieben und kann in Liu &amp; Kang visualisiert werdenS = &quot;xref&quot;&gt; 10 , 11 ( Abbildung 1A ). <ol><li> Anästhesieren einer transplantierten Maus mit 4-5% Isofluran in einer Induktionskammer. Opfer es durch zervikale Versetzung. </li><li> Machen Sie eine Mittellinie Bauch-Inzision mit Standard-Schere und entfernen Sie die Bauch-Inhalte, um die Aorta zu lokalisieren. ANMERKUNG: Das transplantierte Herz wird auf der rechten Seite der Empfangsabdominalaorta sein (Abbildung 1B ). </li><li> Ziehen Sie das Transplantat vorsichtig mit feiner Zigarettenzange heraus und legen Sie es sofort in eiskaltes RPMI-Medium. HINWEIS: Mit einer Chirurgie Schere, um das Transplantat von der Aorta zu trennen, kann das Transplantat beschädigen und dazu führen, dass etwas Gewebe an den Empfänger haften bleibt. </li><li> Nachdem alle Transplantate gesammelt wurden, verschieben Sie sie in eine sterile Kulturhaube für die Gewebeverarbeitung. Legen Sie das Transplantat in eine Petrischale und würfeln Sie das Gewebe in kleine Stücke (1 mm) mit sterilen, stumpfen, mikrochirurgischen Scheren. </li><li> Mit scharfzähnenEps, transferieren die Stücke in ein 50 ml-Röhrchen mit 5 ml Kollagenase A (0,1 mg / ml Kollagenase in sterilem 1x PBS). Inkubieren Sie es für 1 h in einem 37 ° C Bad. </li><li> Füge 5 ml RPMI-Medium hinzu, um die Kollagenase zu neutralisieren und die Probe durch ein 100 μm Sieb mit Hilfe des Kolbens einer 1 ml-Spritze zu transferieren. </li><li> Die Probe bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C abtropfen lassen. </li><li> Das Pellet wird in 1 ml ACK-Lysepuffer resuspendiert. Gut mischen und 5 min bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Füge 1 ml RPMI-Medium hinzu, um den Lysepuffer zu neutralisieren und die Probe bei 400 xg für 5 m bei 4 ° C zu spinnen. </li><li> Das Zellpellet wird in 200 μl RPMI-Medium resuspendiert und auf ein 5-ml-Polypropylen-Rundbodenrohr überführt. HINWEIS: Polypropylenrohre unterstützen weniger Haftung. Auch die Aufrechterhaltung der Zellen bei niedriger Temperatur, wie 4 ° C, verringert die Haftung. </li></ol> 3. Isolierung von Graft-infiltrierenden Makrophagen mit Fluoreszenz-aktivierter Zell-SortierungIng <ol><li> Blockieren Sie unerwünschte spezifische Bindung an myeloiden Zellen unter Verwendung von Fc-Rezeptor-blockierenden mAb (Ratten-anti-Maus CD16 / 32). Füge 1-2 μl pro Probe hinzu, 15 min vor der Oberflächenfärbung. </li><li> Flecken mit anti-Maus CD11b Percp / Cy5.5 (0,6 μg / μL Endkonzentration im RPMI-Medium), anti-Maus CD45 APC / eFluor780 (0,6 μg / μL), anti-Maus Ly6C APC (2 μg / μL) Und anti-Maus Ly6G Pe / Cy7 (2 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l). Decken Sie die Rohre mit Aluminiumfolie ab, um die fluoreszierenden Antikörper vor Licht zu schützen und die Röhrchen im Kühlschrank bei 4 ° C für 45 min zu inkubieren. HINWEIS: Für Einmal-Kompensationen, bereiten Sie ein negatives Kontrollrohr (kein Fleck) und Röhrchen mit Zellen, die einzeln mit jedem der Fluorochrome markiert sind. Um das Tor einzurichten, können Isotyp-Kontrollen besonders für Ly6C (IgG2a) und Ly6G (IgG2b) verwendet werden. </li><li> Die Zellen zweimal mit RPMI-Medium waschen und bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zähle die Zellen mit Trypanblau und einem HämocytometeR und verdünnen sie in 1 ml RPMI-Medium pro 1 x 10 6 Zellen. Vor der Sortierung die Proben durch eine 5 ml, 70 μm Zelle Siebschlauchkappe überführen. Füge DAPI (1 μg / mL) als Zell-Lebensfähigkeitsmarker hinzu und gehe weiter. </li><li> Weil Makrophagen empfindliche und zerbrechliche Zellen sind, setzen Sie die Sortierbedingungen auf 20 psi und verwenden eine 100 μm Düsengröße, um Makrophagen mit einem 4-Wege-Reinheitsmodus zu isolieren. </li><li> Bereiten Sie Sammelröhrchen mit 1 ml RPMI-Medium in einem 5-ml-Polypropylen-Rohr vor. </li><li> Mit der Sortierersoftware öffnen Sie das neue Experiment und wählen das Leer-Experiment mit einem leeren Panel aus, um Einstellungen zu definieren. </li><li> Richten Sie einen Punkt-Plot ein, der die Vorwärts- (FSC) versus ( vs. ) Seitenstreuung (SSC) anzeigt und auf alle Leukozyten, ohne Schutt und Klumpen mit der niedrigsten Vorwärts- und Seitenstreuung, Von diesem übergeordneten Gate, erstellen Sie eine neue Punkt-Diagramm, das SSC vs. DAPI und Gate auf DAPI-Zellen zeigt. <ol><li> Auf dieser neu geschalteten Bevölkerung erstellen Sie adOt-Plot, das CD11b gegen CD45 und Gate auf doppelt-positiven (CD11b + CD45 + ) Makrophagen und Neutrophilen zeigt. </li><li> Von hier aus schaffen Sie ein endgültiges Punktdiagramm, das Ly6C vs. Ly6G anzeigt und die wünschenswerten Populationen lügt: Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - und Ly6C int Ly6G + (Abbildung 2 ). </li></ol></li><li> Nach der Sortierung auf Reinheit und Zelllebensfähigkeit (&gt; 90%) prüfen und die Sammelröhrchen bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau und einem Hämocytometer und resuspendieren sie in der gewünschten Konzentration ( z. B. 1 x 10 6 Makrophagen / ml) in komplettem RPMI-Medium. </li><li> Platte 50 x 10 3 Makrophagen pro Vertiefung in einer 96-Well-Rundbodenplatte mit einem Endvolumen von 100 &amp; mgr; l vollständigem RPMI-Medium. Lassen Sie die Zellen für mindestens 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2 ungestört. </li></ol> 4. isolatioN von T-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung HINWEIS: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn ist ein X-verknüpfter, gezielter Knock-in-Maus-Stamm, der Zellen markiert, die das Foxp3 (Gabelkopf-Kasten-P3) -Gen mit monomerem rotem fluoreszierendem Protein (mRFP) exprimieren. <ol><li> Anästhesieren und Opfern von C57BL / 6 und C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) Mäusen, wie zuvor in Schritt 2.1 beschrieben. Isoliere die Milz und Lymphknoten (LN: Leisten-, Lenden-, Axillar-, Brachial- und Gebärmutterhalskrebs) und platziere sie schnell in eiskaltes RPMI-Medium. </li><li> Um das LN zu isolieren, platziere die Maus in eine Rückenlage, mache einen Mittellinie Hautschnitt von unten nach oben, sorgfältig schneiden das Bauchfell und sanft Ausbreitung der Haut auseinander. Sobald alle Leisten-, Lenden-, Achsel-, Brachial- und Zervix-LN gesammelt werden (Abbildung 1C , in Rot gefärbt), schneiden Sie das Peritoneum und isolieren die Milz an der oberen linken Seite des Darms. </li><li> Dispergieren der Milz und LN mit einem 100 μm Filter platziertOben auf einem 50 mL Rohr. Mit dem Kolben einer 1-ml-Spritze das Gewebe vorsichtig drücken. Spülen Sie den Filter mit RPMI-Medium so oft wie nötig, bis es sauber ist. ANMERKUNG: LN und Milz von jeder Maus können zusammen in der gleichen Tube zusammengefasst werden. </li><li> Bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C abreiben. </li><li> Das Pellet wird in 2 ml ACK-Lysepuffer resuspendiert. Gut mischen und 5 min bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Füge 2 ml RPMI-Medium hinzu, um den Lysepuffer zu neutralisieren. Bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C abreiben. </li><li> Das Zellpellet wird in 200 &amp; mgr; l RPMI-Medium resuspendiert und auf ein 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr gegeben. </li><li> Fleck für anti-Maus CD4 APC (0,6 μg / μL) und / oder anti-Maus CD8 PeCy7 (2 μg / μL). Bedecken Sie die Rohre mit Aluminiumfolie, um die fluoreszierenden Antikörper vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie die Röhrchen im Kühlschrank bei 4 ° C für 45 min. HINWEIS: Für Einmal-Kompensationen, bereite ein Negativ-Kontrollrohr (kein Fleck) undRöhrchen mit einzeln markierten Zellen mit jedem der Fluorochrome. </li><li> Die Zellen zweimal mit RPMI-Medium waschen und bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zähle die Zellen mit Trypanblau und einem Hämocytometer. ANMERKUNG: CFSE-Farbstoff wird als Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester-Pulver gewöhnlich bei 50 &amp; mgr; g bereitgestellt. Füge 18 μL DMSO zu einer Ampulle von CFSE für eine endgültige Stammlösung von 5 mM hinzu und lag bei -20 ° C für mehrere Monate. </li><li> Für die CFSE-Markierung werden CD8-gefärbte Zellen in einer Konzentration von bis zu 10 6 Zellen pro ml in PBS bei einer Endarbeitskonzentration von 5 μM CFSE aus der Stammlösung resuspendiert. Inkubieren sie in einem Bad bei 20 ° C für 5 min wie zuvor beschrieben 6 . HINWEIS: (CRITICAL STEP) Für Zellen mit einer niedrigen Konzentration (≤10 6 pro ml) ist es wesentlich, dass die Zellen in Gegenwart von Protein markiert werden, um die toxischen Effekte von CFSE zu puffern. Daher kann PBS 5% FBS enthalten. Beachten Sie, dass wenn ichDium verwendet wird, können freie Aminosäuren die Markierungseffizienz durch Konkurrenz für CFSE senken. </li><li> Neutralisieren des CFSE mit 2 ml RPMI-Medium. Spin bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C. Füge 1 ml RPMI-Medium pro 1 x 10 6 CD8 T-Zellen hinzu. </li><li> Vor der Sortierung die Probe durch ein 70 μm Zellsieb auf eine 5 mL Röhrchenkappe überführen. Füge 50 μl 1x DAPI (1 μg / mL) als Zelllebensfähigkeitsmarker hinzu und gehe zur Sortierung vor. HINWEIS: 1x bedeutet 1: 1 Verhältnis des Reagenzes gegenüber anderen Bestandteilen. </li><li> Stellen Sie die Sortierbedingungen auf 20 psi und 100 μm Düsengröße ein, um doppelt-positive CD8 + CFSE + T-Zellen zu isolieren (Abbildung 3A ). </li><li> Bereiten Sie Sammelröhrchen mit 1 ml RPMI-Medium in einem 5-ml-Polypropylen-Röhrchen vor und gehen Sie weiter. </li><li> Mit der Sortierersoftware öffnen Sie das neue Experiment und wählen das Leer-Experiment mit einem leeren Panel aus, um Einstellungen zu definieren. </li><li> Für CD4 + T-Zell-Isolation, richten Sie ein Punkt-Diagramm, dass disSpielt den FSC gegen SSC und Gate auf Lymphozyten, ohne Schutt sowie große körnige Zellen, wie dendritische Zellen. <ol><li> Von diesem übergeordneten Gate, erstellen Sie eine neue Punkt-Diagramm, das SSC vs. DAPI und Gate auf DAPI-Zellen zeigt. </li><li> Auf dieser neu geschalteten Population erstellen Sie ein Punktdiagramm, das SSC vs. CD4 anzeigt, um alle CD4 + Zellen zu isolieren (Abbildung 3B ). Alternativ kann ein anti-CD3-mAb verwendet werden, um die Isolierung von reinen T-Zellpopulationen zu gewährleisten. HINWEIS: Ein kleiner Bruchteil aller CD4 + T-Zellen (5-10%) sollte Foxp3 + mRFP + sein . </li></ol></li><li> Nach der Sortierung auf Reinheit und Zelllebensfähigkeit (&gt; 90%) prüfen und die Sammelröhrchen bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zähle die Zellen mit Trypanblau und einem Hämocytometer. Resuspend unter Verwendung von 1 ml vollständigem RPMI-Medium pro 2 × 10 6 T-Zellen. </li><li> Einstellen des Suppressionstests durch Kultivierung von T-Zellen mit zuvor sortierten Makrophagen. Teller 10 x 10 4 CD4 + T und 10 x 10 4 CD8 + CFSE + T-Zellen in der gleichen Vertiefung in einem Endvolumen von 100 &amp; mgr; l vollständigem RPMI-Medium. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 96 h. HINWEIS: Makrophagen und T-Zellen wurden im Verhältnis 1: 4 verwendet. </li><li> Stimulieren der T-Zellteilung durch Waschen von T-Zell-Aktivator CD3 / CD28-Magnetperlen in 2 ml PBS, bevor sie verwendet werden, um den Azid-haltigen Puffer zu entfernen. Füge 5 μl Maus-T-Zell-Aktivator CD3 / CD28 Perlen pro Vertiefung hinzu. HINWEIS: Magnetperlen sind ähnlich wie Antigen-präsentierende Zellen und sind mit anti-CD3 und anti-CD28 mAb gekoppelt und bieten ein einfaches Verfahren zur Aktivierung und Erweiterung von T-Zellen. </li></ol>

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<li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+immune+cell+proliferation+and+cytotoxic+potential+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt die Methoden, mit denen wir pfropf-infiltrierende myeloide Zelluntergruppen in einem experimentellen Mausmodell der Herztransplantation immunocharakterisieren, was auch für andere Gewebe in verschiedenen murinen experimentellen Modellen gilt. Die Niederdruckzellsortierung bei 20 psi war die bevorzugte Methode, um eine gute Ausbeute an reinen Zelluntergruppen zu isolieren. Die Aufrechterhaltung der Reinheit jeder myeloiden Teilmenge ist entscheidend, um schlüssige Ergebnisse der Unterdrückungs...

Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die Funktion von Gewebe-infiltrierenden Makrophagen, die aus kardialen Allotransplantaten isoliert wurden, nach ihrer Fähigkeit, T-Zell-Antworten zu modulieren, zu untersuchen. In der Literatur weithin beschrieben, sind fluoreszierende Zellverfolgungsfarbstoffe in Kombination mit Durchflusszytometrie mächtige Werkzeuge, um die suppressive Funktion spezifischer Zelltypen in vitro und in vivo zu untersuchen . Unser Protokoll folgt dem Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) -Verfahren zur Überwachung der Lymphozytenproliferation in vitro . Wenn eine CFSE-markierte Zelle sich teilt, erhält ihre Nachkommenschaft die Hälfte der Anzahl der Carboxyfluorescein-markierten Moleküle 6 . Die entsprechende Abnahme der Zellfluoreszenz durch Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um die Zellteilung zu beurteilen, wobei die Kapazität der suppressiven Makrophagen überwacht wird, um T-Zell-Immunantworten zu modulieren. Da CFSE ein Fluorescein-basierter Farbstoff ist, ist er mit einem brOad Bereich der anderen Fluorochrome, so dass es für Multi-Farb-Durchflusszytometrie. Die geeignete Wahl der Fluorochrome für die Phänotypisierung ist auch wichtig, um eine übermäßige spektrale Überlappung zu vermeiden und die Unfähigkeit, Antikörper-positive Zellen zu erkennen, insbesondere mit sichtbaren Proteinfarbstoffen wie CFSE 7 . Es gibt viele Vorteile der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen gegenüber alternativen Techniken, die die Zellproliferation messen, wie der Thymidin-Inkorporationstest, der radioaktiv markiertes Thymidin (TdR) 8 verwendet. Dieser Assay verwendet tritiiertes Thymidin ( 3 H-TdR), das während der Mitosezellteilung in neue Stränge chromosomaler DNA eingebaut wird. Eine Sicherheitsbedeutung, die mit diesem Assay verbunden ist, ist die Verwendung von Radioisotopen, da ein Szintillationsbeta-Zähler verwendet wird, um die Radioaktivität in der aus den Zellen gewonnenen DNA zu messen, um das Ausmaß der Zellteilung zu bestimmen. Methodisch ist der tritiierte Thymidin assAy ist nicht flexibel genug, um wichtige klinische Laborbeschränkungen wie z. B. niedrige Anzahl von Zellen und verzögerte Analyse nach der Färbung anzupassen. Im Gegenteil wurde gezeigt, dass die CFSE-Färbung die Zellproliferation verhindert und kritische Aktivierungsmarker wie CD69, HLA-DR und CD25 9 stört. Daher ist das Verständnis von Vorteilen und Einschränkungen jeder Methodik, insbesondere bei mehrfarbigen Studien, bei denen mehrere Farbstoffe verwendet werden, um verschiedene Zelltypen zu verfolgen, entscheidend für die Erzielung genauer und reproduzierbarer Ergebnisse.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1.000x 2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100x L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>100x Non Ätherische Aminosäuren</td><td>Corning</td><td>25025039</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES Puffer</td><td>Corning</td><td>25060CL</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Natriumpyruvat</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptavidyn</td><td>ThermoScientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen A</td><td>Roche</td><td>70381322</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (ohne Kalzium und Kalzium) Corning</td><td></td> <td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Zellsieb</td><td>Fisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysepuffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>CFSE-FITC</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Maus T-Zell-Aktivator CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>96 Well&nbsp; U-Bodenplatte</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-Ly6C-APC</td><td>eBioscience</td><td>175932-80</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ly6G-Pe/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127617</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b-Percp/Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45011282</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>47045182</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4-APC</td><td>eBioscience</td><td>17004181</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8-P/ Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25008181</td><td></td></tr><tr><td>LSRII Durchflusszytometer</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Software</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J&nbsp;</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>008374</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr></tbody></table>

funktionelle charakterisierung von regulatorischen makrophagen, die eine pfropfreaktive immunität hemmen

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Makrophagenakkumulation in transplantierten Organen ist seit langem als ein Merkmal der Allotransplantatabstoßung erkannt worden 1 . Immunogene Monozyten infiltrieren das Allotransplantat früh nach der Transplantation, pflegen eine pfropfreaktive Reaktion gegen das transplantierte Organ und initiieren die Organabstoßung 2 . Jüngste Daten deuten darauf hin, dass unterdrückende Makrophagen eine erfolgreiche Langzeit-Transplantation 3 ermöglichen und für die Induktion der Transplantationstoleranz erforderlich sind 4 . Dies deutet auf ein multidimensionales Konzept der Makrophagen-Ontogenese, Aktivierung und Funktion hin, das eine neue Roadmap für die Isolierung und Analyse der Makrophagen-Funktion erfordert. Aufgrund der Plastizität von Makrophagen ist es notwendig, eine Methodik zur Isolierung und Charakterisierung von Makrophagen in Abhängigkeit von der Gewebeumgebung vorzusehen und ihre Funktionen nach verschiedenen Szenarien zu definieren. Hier beschreiben wirEin Protokoll für die Immuncharakterisierung von Transplantat-infiltrierenden Makrophagen und die Methoden, mit denen wir ihre Fähigkeit, die CD8 + T-Proliferation zu hemmen, funktionell zu bewerten und die CD4 + Foxp3 + Treg-Expansion in vitro zu fördern.

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die im obigen Protokoll beschriebene Gating-Strategie. Die Ergebnisse zeigen auch die Analyse der T-Zell-Proliferationsaktivität nach der Co-Kultur mit pfropf-infiltrierenden Makrophagen. Die in vitro- suppressive Kapazität von Makrophagen-Teilmengen wurde in Abbildung 4 analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die aus tolerierten Empfängern gewonnenen Ly6C lo Ly6G - Makrophagen unterdrückend sind. Die E...

Makrophagen sind Plastikzellen des hämatopoetischen Systems, die eine entscheidende Rolle bei der schützenden Immunität und Homöostase haben. In diesem Bericht beschreiben wir optimierte in vitro- Techniken zur phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von pfropf-infiltrierenden regulatorischen Makrophagen, die sich im transplantierten Organ unter toleranten Bedingungen ansammeln.

Funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen, die eine pfropfreaktive Immunität hemmen

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Das übergeordnete Ziel dieses in vitro Verfahrens ist die phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Makrophagenpopulationen, die aus allotransplantierten Herzen in einem Massentransplantationsmodell isoliert wurden. Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Immunität zu beantworten, die wir darüber finden, wie der Erfolg des allographischen Überlebens und der Toleranz verbessert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, zu untersuchen, wie eine bestimmte gewebeinfiltrierte Untergruppe von isolierten Mikrophagen im kardialen Allographen die Reaktion des Wirtsgewebes moduliert.Nach der Erzeugung einer Einzelzellsuspension aus dem Allotransplantat blockieren Sie jede unspezifische Bindung an die myeloischen Zellen mit ein bis zwei Mikrolitern FC-Rezeptor, der den monoklonalen Antikörper für 15 Minuten blockiert. Am Ende der Inkubation färben Sie die Zellen 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt mit den entsprechenden fluoreszenzkonjugierten myeloischen Zelloberflächenantikörpern. Waschen Sie dann die Zellen zweimal durch Zentrifugation in RPMI-Medium.Und suspendieren Sie das Pellet zum Zählen wieder in Trypanblau. Als nächstes verdünnen Sie die Zellen auf eine einmalige Konzentration von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in frischem Medium. Und filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikron-Sieb in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden.Färben Sie die Zellen kurz vor der Sortierung mit DAPI als Viabilitätsmarker und stellen Sie das Durchflusszytometer auf die entsprechenden Makrophagen-Sortierparameter ein. Setzen Sie konische Fünf-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter RPMI-Medium zur Entnahme der sortierten Zellen ein und laden Sie das Probenröhrchen auf das Zytometer. Wählen Sie in der Durchflusszytometer-Software ein leeres Experiment mit einem leeren Feld aus und richten Sie ein Streupunktdiagramm zwischen Vorwärts und Seite ein.Gate auf den Leukozyten, ohne die Zelltrümmer und Klumpen mit der geringsten Vorwärts- und Seitenstreuung. Erstellen Sie aus diesem übergeordneten Gate ein neues Punktdiagramm, das die seitliche Streuung im Vergleich zu DAPI und das Gate in den negativen DAPI-Zellen anzeigt. Erstellen Sie für diese neu abgegrenzte Population ein Punktdiagramm, das CD11b im Vergleich zu CD45 anzeigt, und gattern Sie auf die CD11b CD45 doppelt positiven Makrophagen und Neutrophilen.Erstellen Sie dann ein endgültiges Punktdiagramm für Ly6C im Vergleich zu Ly6G, um das Gating der gewünschten Grundgesamtheit zu ermöglichen und die Zellen zu sortieren. Bestätigen Sie am Ende der Sortierung die Reinheit und Lebensfähigkeit der Proben. Sammeln Sie die sortierten Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet zum Zählen in frischem RPMI-Medium.Die Makrophagenpopulationen werden auf die geeignete Konzentration für die Aussaat von fünfmal 10 bis vier Makrophagen pro 100 Mikroliter vollständiges Medium pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden verdünnt. Legen Sie die Zellen dann für mindestens 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 in einen Zellkultur-Inkubator. Um das T zu isolieren, bringen Sie die Einschlagmaus in die Rückenlage.Machen Sie zuerst einen Hautschnitt in der Mittellinie, schneiden Sie vorsichtig das Bauchfell und verteilen Sie die Haut sanft auseinander. Sammeln Sie die peripheren Lymphknoten und die Milz und legen Sie das Gewebe in einen 100-Mikrometer-Filter auf einen konischen 50-Milliliter-Schlauch. Drücken Sie das Lymphgewebe mit dem Kolben einer 1-Milliliter-Spritze vorsichtig durch den Filter und spülen Sie den Filter mit frischem RPMI-Medium aus, bis das Netz sauber ist.Sammeln Sie die einzellige Suspension durch Zentrifugation und geben Sie das Pellet erneut in zwei Milliliter ACK-Lysepuffer. Nach fünf Minuten bei vier Grad Celsius neutralisieren Sie den Lysepuffer mit zwei Millilitern frischem RPMI-Medium und zentrifugieren die Zellen. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 200 Mikrolitern frischem Medium und geben Sie die Zellen in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden, um sie mit den entsprechenden T-Zell-Oberflächenfärbe-Antikörpern zu belasten.Nach 45 Minuten bei vier Grad Celsius lichtgeschützt die Zellen zweimal in frischem RPMI-Medium waschen und die Zellen durch Trypanblau-Ausschluss zählen. Als nächstes verdünnen Sie die CD8-gefärbten Zellen in CFSE fünf Minuten lang in einem 20 Grad Celsius heißen Wasserbad auf eine einmalige Konzentration von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter. Am Ende der Inkubation neutralisieren Sie das CFSE mit zwei Millilitern RPMI-Medium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.Suspendieren Sie die Zellen einmal um 10 bis sechs CD8-gefärbte T-Zellen pro Milliliter RPMI-Mediumkonzentration und filtrieren Sie alle Zellproben durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden. Markieren Sie dann die Zellen mit DAPI und bereiten Sie das Durchflusszytometer für die Sortierung vor, wie gerade gezeigt. Für die CD4-positive T-Zell-Isolierung erstellen Sie ein Vorwärts- und Seiten-Scatter-Dot-Diagramm für das Gating auf den Lymphozyten, wobei sowohl die Trümmer als auch die großen körnigen myeloischen Zellen ausgeschlossen werden.Erstellen Sie aus diesem übergeordneten Gate ein Punktdiagramm, das die seitliche Streuung im Vergleich zu DAPI anzeigt, und fügen Sie ein Gate für die negativen DAPI-Zellen ein. Erstellen Sie für diese neu abgegrenzte Grundgesamtheit ein Punktdiagramm, das seitliche Streuung im Vergleich zu CD4 anzeigt, und ein Punktdiagramm, das CD8 im Vergleich zu CFSE anzeigt. Sortieren Sie dann die Gated T-Zell-Populationen.Bestätigen Sie am Ende der Sortierung die Reinheit und Lebensfähigkeit der Proben und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation zur Zählung. Verdünnen Sie die Zellen auf zweimal 10 bis sechs T-Zellen pro Milliliter RPMI-Konzentration und 100 Mikroliter T-Zellen in vollständigem RPMI-Medium in jede Vertiefung der Makrophagen für eine 96-stündige Co-Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Geben Sie schließlich fünf Mikroliter PBS-Wasch-T-Zell-Aktivator CD3 CD28 Magnetkügelchen in jede Vertiefung, um die T-Zellen zu aktivieren und zu erweitern.Ly6Clo Ly6G-Makrakhagen, die von tolerierten Empfängern gewonnen wurden, üben eine suppressive Wirkung auf CD8-positive T-Zellen aus, wobei eine bescheidene suppressive Aktivität auch von Ly6C-intermediären Ly6CG-positiven Zellen beobachtet wurde. Nur Ly6Clo Ly6G-Zellen fördern jedoch die in vitro Expansion von CD4-positiven Foxp3-positiven TReg. Zusammengenommen stützen diese Daten die Schlussfolgerung, dass transplantatinfiltrierende CD11B-positive Ly6Clo Ly6G-negative Makrophagen viele der Eigenschaften besitzen, von denen berichtet wird, dass sie mit Monozyten-abgeleiteten Suppressorzellen assoziiert sind, einschließlich ihrer Fähigkeit, die CD8-T-Zellproliferation zu hemmen und die CD4-positive Foxp3-positive TReg-Expansion zu fördern.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Reinheit zu erhalten, um schlüssige Daten über die Suppressionskapazität jeder Makrophagen-Untergruppe zu erhalten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Verwendung kommerzieller Anreicherungsgates, zur Isolierung verschiedener Leukozytenpopulationen von Interesse verwendet werden. Die Makrophagensortierung ist der längste Teil dieses Verfahrens, aber wenn sie gemeistert ist, kann dieser Teil der Technik in acht Stunden abgeschlossen sein, wenn er richtig durchgeführt wird.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die suppressive Fähigkeit infiltrierender Makrophagen in Simulationsmodellen für die Transplantation fester Organe zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man verschiedene Makrophagenpopulationen in ausgewählten Mausherz-Allographen charakterisiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Homöostase und Pathologie in vielen Geweben. Das Protokoll beschreibt hier vorgestellte Verfahren zur Abreicherung von...

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Wir beschreiben hier ein einfaches Protokoll zur Isolierung von Maus-Peritonealmakrophagen. Diesem Verfahren folgt eine RNA-Extraktion, um eine Genexpressionsanalyse bei der Stimulation von Toll-like-Rezeptoren durchzuführen.

Isolierung von Murine Peritonealmakrophagen zur Durchführung Genexpressionsanalyse Nach Toll-like Rezeptoren Stimulation

Wir beschreiben ein Protokoll für die Aorteninterpositionstransplantation bei Mäusen. Ziel des Protokolls ist es, ein Modell zur Verfügung zu stellen, mit dem pathologische Prozesse und therapeutische Strategien, die für alloimmune Reaktionen in den Arterien relevant sind, und die daraus resultierenden arteriellen Veränderungen, die zum Versagen von Organtransplantaten beitragen, untersucht werden können.

Maus-Modell der Alloimmune-induzierte Gefäßabstoßung und Transplantat-Arteriosklerose

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse des Phänotyps von regulatorischen T (Treg)-Zellen, die von naiven und chronischen lymphozytären Choriomeningitis-Virus-infizierten Mäusen isoliert wurden. Darüber hinaus stellen wir einen Prozess zur Verfügung, um die suppressive Aktivität derT-reg-Zellen zu bewerten.

Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum induzieren Toleranz in der Transplantationsmedizin und in Vitro und in Vivo zu bewerten, die unterdrückende unterschiedliche Zelle Teilmengen des Empfängers und der Immunstatus des Empfängers in Richtung Spender oder exogene Antigene.

In Vitro und In Vivo Beurteilung der T, B und myeloische Zellen Suppressive Aktivität und humorale Reaktionen von Transplantationspatienten

Antikörper-basierte Medikamente haben die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen revolutioniert. Zusätzlich zu den direkten Auswirkungen auf bestimmte Ziele, können Antikörper Makrophagen entzündungshemmende zu aktivieren. Dieses Protokoll beschreibt wie entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung bewertet in vitro mit Maus Knochenmark Makrophagen, und in-vivo mit peritonealen Makrophagen werden kann.

Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Das Protokoll zeigt die Verwendung der histologischen Untersuchung und immunhistochemische Profil Folat Rezeptor Beta-Makrophagen und seine Beziehung zu der gesamten Immunzelle Schläfenarterie Biopsien in riesige Zelle Arterienentzündung zu infiltrieren.

Eine Immunohistopathologic Untersuchung der Folat-Rezeptor Beta Makrophagen und vaskuläre immun Mikroumgebung in riesige Zelle Arterienentzündung Profil

Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung und Erzeugung dynamischer Bilder der mesenchymalen Stammzell (MSC) vermittelten Regulation der Makrophagen (MΦ) Phagozytose von nicht opsonisierten Hefepartikeln (Zymosan) vorgestellt, die zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind.

Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

Monozyten und Makrophagen sind sehr plastische und reprogrammierbare Immunzellen, die für Gesundheit und Krankheit entscheidend sind. Sie spüren und reagieren auf ein breites Spektrum von Reizen, indem sie spezifische Differenzierungsprogramme und Phänotypen übernehmen. Wir haben ein In-vitro-Modell standardisiert, um die Polarisation und Reprogrammierung von Makrophagen zu untersuchen, was ein wertvolles Werkzeug für die Forschung darstellt.

Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays

Lernen Sie die phänotypische und funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen aus allotransplantierten Herzen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung ihrer Rolle bei der Immunmodulation und der Verbesserung des Allograft-Überlebens.

Funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen, die eine pfropfreaktive Immunität hemmen

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