Funktionelle Charakterisierung von regulatorischen Makrophagen, die eine pfropfreaktive Immunität hemmen

Das übergeordnete Ziel dieses in vitro Verfahrens ist die phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Makrophagenpopulationen, die aus allotransplantierten Herzen in einem Massentransplantationsmodell isoliert wurden. Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Immunität zu beantworten, die wir darüber finden, wie der Erfolg des allographischen Überlebens und der Toleranz verbessert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, zu untersuchen, wie eine bestimmte gewebeinfiltrierte Untergruppe von isolierten Mikrophagen im kardialen Allographen die Reaktion des Wirtsgewebes moduliert.

Nach der Erzeugung einer Einzelzellsuspension aus dem Allotransplantat blockieren Sie jede unspezifische Bindung an die myeloischen Zellen mit ein bis zwei Mikrolitern FC-Rezeptor, der den monoklonalen Antikörper für 15 Minuten blockiert. Am Ende der Inkubation färben Sie die Zellen 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt mit den entsprechenden fluoreszenzkonjugierten myeloischen Zelloberflächenantikörpern. Waschen Sie dann die Zellen zweimal durch Zentrifugation in RPMI-Medium.

Und suspendieren Sie das Pellet zum Zählen wieder in Trypanblau. Als nächstes verdünnen Sie die Zellen auf eine einmalige Konzentration von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in frischem Medium. Und filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikron-Sieb in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden.

Färben Sie die Zellen kurz vor der Sortierung mit DAPI als Viabilitätsmarker und stellen Sie das Durchflusszytometer auf die entsprechenden Makrophagen-Sortierparameter ein. Setzen Sie konische Fünf-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter RPMI-Medium zur Entnahme der sortierten Zellen ein und laden Sie das Probenröhrchen auf das Zytometer. Wählen Sie in der Durchflusszytometer-Software ein leeres Experiment mit einem leeren Feld aus und richten Sie ein Streupunktdiagramm zwischen Vorwärts und Seite ein.

Gate auf den Leukozyten, ohne die Zelltrümmer und Klumpen mit der geringsten Vorwärts- und Seitenstreuung. Erstellen Sie aus diesem übergeordneten Gate ein neues Punktdiagramm, das die seitliche Streuung im Vergleich zu DAPI und das Gate in den negativen DAPI-Zellen anzeigt. Erstellen Sie für diese neu abgegrenzte Population ein Punktdiagramm, das CD11b im Vergleich zu CD45 anzeigt, und gattern Sie auf die CD11b CD45 doppelt positiven Makrophagen und Neutrophilen.

Erstellen Sie dann ein endgültiges Punktdiagramm für Ly6C im Vergleich zu Ly6G, um das Gating der gewünschten Grundgesamtheit zu ermöglichen und die Zellen zu sortieren. Bestätigen Sie am Ende der Sortierung die Reinheit und Lebensfähigkeit der Proben. Sammeln Sie die sortierten Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet zum Zählen in frischem RPMI-Medium.

Die Makrophagenpopulationen werden auf die geeignete Konzentration für die Aussaat von fünfmal 10 bis vier Makrophagen pro 100 Mikroliter vollständiges Medium pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden verdünnt. Legen Sie die Zellen dann für mindestens 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 in einen Zellkultur-Inkubator. Um das T zu isolieren, bringen Sie die Einschlagmaus in die Rückenlage.

Machen Sie zuerst einen Hautschnitt in der Mittellinie, schneiden Sie vorsichtig das Bauchfell und verteilen Sie die Haut sanft auseinander. Sammeln Sie die peripheren Lymphknoten und die Milz und legen Sie das Gewebe in einen 100-Mikrometer-Filter auf einen konischen 50-Milliliter-Schlauch. Drücken Sie das Lymphgewebe mit dem Kolben einer 1-Milliliter-Spritze vorsichtig durch den Filter und spülen Sie den Filter mit frischem RPMI-Medium aus, bis das Netz sauber ist.

Sammeln Sie die einzellige Suspension durch Zentrifugation und geben Sie das Pellet erneut in zwei Milliliter ACK-Lysepuffer. Nach fünf Minuten bei vier Grad Celsius neutralisieren Sie den Lysepuffer mit zwei Millilitern frischem RPMI-Medium und zentrifugieren die Zellen. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 200 Mikrolitern frischem Medium und geben Sie die Zellen in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden, um sie mit den entsprechenden T-Zell-Oberflächenfärbe-Antikörpern zu belasten.

Nach 45 Minuten bei vier Grad Celsius lichtgeschützt die Zellen zweimal in frischem RPMI-Medium waschen und die Zellen durch Trypanblau-Ausschluss zählen. Als nächstes verdünnen Sie die CD8-gefärbten Zellen in CFSE fünf Minuten lang in einem 20 Grad Celsius heißen Wasserbad auf eine einmalige Konzentration von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter. Am Ende der Inkubation neutralisieren Sie das CFSE mit zwei Millilitern RPMI-Medium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Suspendieren Sie die Zellen einmal um 10 bis sechs CD8-gefärbte T-Zellen pro Milliliter RPMI-Mediumkonzentration und filtrieren Sie alle Zellproben durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden. Markieren Sie dann die Zellen mit DAPI und bereiten Sie das Durchflusszytometer für die Sortierung vor, wie gerade gezeigt. Für die CD4-positive T-Zell-Isolierung erstellen Sie ein Vorwärts- und Seiten-Scatter-Dot-Diagramm für das Gating auf den Lymphozyten, wobei sowohl die Trümmer als auch die großen körnigen myeloischen Zellen ausgeschlossen werden.

Erstellen Sie aus diesem übergeordneten Gate ein Punktdiagramm, das die seitliche Streuung im Vergleich zu DAPI anzeigt, und fügen Sie ein Gate für die negativen DAPI-Zellen ein. Erstellen Sie für diese neu abgegrenzte Grundgesamtheit ein Punktdiagramm, das seitliche Streuung im Vergleich zu CD4 anzeigt, und ein Punktdiagramm, das CD8 im Vergleich zu CFSE anzeigt. Sortieren Sie dann die Gated T-Zell-Populationen.

Bestätigen Sie am Ende der Sortierung die Reinheit und Lebensfähigkeit der Proben und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation zur Zählung. Verdünnen Sie die Zellen auf zweimal 10 bis sechs T-Zellen pro Milliliter RPMI-Konzentration und 100 Mikroliter T-Zellen in vollständigem RPMI-Medium in jede Vertiefung der Makrophagen für eine 96-stündige Co-Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Geben Sie schließlich fünf Mikroliter PBS-Wasch-T-Zell-Aktivator CD3 CD28 Magnetkügelchen in jede Vertiefung, um die T-Zellen zu aktivieren und zu erweitern.

Ly6Clo Ly6G-Makrakhagen, die von tolerierten Empfängern gewonnen wurden, üben eine suppressive Wirkung auf CD8-positive T-Zellen aus, wobei eine bescheidene suppressive Aktivität auch von Ly6C-intermediären Ly6CG-positiven Zellen beobachtet wurde. Nur Ly6Clo Ly6G-Zellen fördern jedoch die in vitro Expansion von CD4-positiven Foxp3-positiven TReg. Zusammengenommen stützen diese Daten die Schlussfolgerung, dass transplantatinfiltrierende CD11B-positive Ly6Clo Ly6G-negative Makrophagen viele der Eigenschaften besitzen, von denen berichtet wird, dass sie mit Monozyten-abgeleiteten Suppressorzellen assoziiert sind, einschließlich ihrer Fähigkeit, die CD8-T-Zellproliferation zu hemmen und die CD4-positive Foxp3-positive TReg-Expansion zu fördern.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Reinheit zu erhalten, um schlüssige Daten über die Suppressionskapazität jeder Makrophagen-Untergruppe zu erhalten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Verwendung kommerzieller Anreicherungsgates, zur Isolierung verschiedener Leukozytenpopulationen von Interesse verwendet werden. Die Makrophagensortierung ist der längste Teil dieses Verfahrens, aber wenn sie gemeistert ist, kann dieser Teil der Technik in acht Stunden abgeschlossen sein, wenn er richtig durchgeführt wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die suppressive Fähigkeit infiltrierender Makrophagen in Simulationsmodellen für die Transplantation fester Organe zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man verschiedene Makrophagenpopulationen in ausgewählten Mausherz-Allographen charakterisiert.