Die Verwendung einer Batterie von chemischen und ökotoxikologischen Methoden zur Beurteilung der Wirksamkeit von Abwasserbehandlungsprozesse zu entfernen Estrogenic Potency

Das übergeordnete Ziel der hier beschriebenen Testreihe, einschließlich analytischer Chemie sowie in-vitro- und in-vivo-Methoden, besteht darin, die Wirksamkeit neuartiger und innovativer Abwasserbehandlungstechnologien hinsichtlich der Entfernung östrogenwirksamer Kontaminanten zu bestimmen. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen in der Umwelttechnik zu beantworten, beispielsweise bei der Auswahl der effektivsten Abwasserbehandlungsverfahren angesichts einer variablen östrogenen Potenz des Abwassers. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass sie auf sehr niedrige Konzentrationen wirksamer Verbindungen ansprechen und somit die effizientesten Technologien zur Schonung aquatischer Lebensformen aufzeigen.

Die Verfahren werden demonstriert von Postdoktorandin Dr. Chris Green, der Doktorandin Angela Pinzon, der Forschungsmitarbeiterin Dr. Alice Baynes und der leitenden wissenschaftlichen Technikerin Nicola Beresford. Der SPE-Prozess erfordert eine sorgfältige Beachtung von Sauberkeit und Ordnung, um Kontaminationen der Proben zu vermeiden. Reinigen Sie alle Röhrchen, Hähne und Sinterplatten vorab mit Methanol.

Bevor Proben analysiert werden, die Transferleitungen an das Extraktionsmanifold anschließen und das gesamte System mit entionisiertem Wasser spülen. Um die Proben zu analysieren, zuerst die Einweg-Ventildichtungen befestigen und anschließend die Styrol-Divinylbenzol-SPE-Kartuschen anschließen. Danach fünf Milliliter Ethylacetat in jedes Reservoir pipettieren, um die Kartuschen zu konditionieren.

Während dieses Schritts sicherstellen, dass die SPE abgedichtet ist. Dann die Vakuumpumpe einschalten, um eine Fließgeschwindigkeit von 10 Millimetern pro Minute zu erreichen. Bevor die Kartuschen austrocknen, fünf Milliliter Methanol auftragen, gefolgt von fünf Milliliter Wasser.

Es ist sehr wichtig, dass die SPE-Kartuschen nicht austrocknen. Nachdem das Wasser größtenteils durchgelaufen ist, schalten Sie die Pumpe aus und füllen Sie jedes Kartuschenreservoir mit Wasser auf. Anschließend verbinden Sie 1/8-Zoll-PTFE-Schläuche zwischen den Kartuschenreservoiren und den Glasprobenflaschen.

Schalten Sie nun das Vakuum auf eine Durchflussrate von weniger als 10 Milliliter pro Minute um und lassen Sie die gesamte Probe durch die Kartusche fließen. Danach trocknen Sie die SPE-Kartuschen gründlich, bis sich die Farbe des Kartuscheninhalts verändert. Verwenden Sie hierfür ein Vakuum oder einen Gasstrom.

Stellen Sie nun saubere, trockene 10-Milliliter-Glaseinzelflaschen in ein Rack und setzen Sie das Rack in das Extraktionsmanifold ein. Prüfen Sie, ob sich jeder Liner über einer Flasche befindet. Befüllen Sie die Probenreservoire mit jeweils zwei Mal vier Milliliter, insgesamt acht Milliliter Dichlormethan, schalten Sie die Vakuumpumpe ein und lassen Sie die Flüssigkeit durch die Festphasen-Extraktion und in die Sammelflaschen laufen.

Anschließend verwenden Sie einen Konzentrator, um das Volumen in allen Sammelgefäßen auf ein Milliliter zu reduzieren. Überführen Sie jede Probe in ein Autosampler-Gefäß und konzentrieren Sie sie mithilfe von Stickstoff-Abdampfgeräten weiter auf 100 Mikroliter. Der nächste Schritt im Verfahren besteht darin, mithilfe von GPC makromolekulare Störstoffe zu entfernen.

Zunächst injizieren Sie 95 Mikroliter des eluierten Probenextrakts in die mit HPLC ausgestattete GPC. Konzentrieren Sie den GPC-Extrakt mithilfe eines Konzentrators und der Stickstoff-Abdampfvorrichtung auf 200 Mikroliter und füllen Sie ihn anschließend mit Hexan auf zwei Milliliter auf. Danach befestigen Sie Einweg-Ventildichtungen, Amino-Purpur-Kartuschen und Kartuschenreservoirs an das SPE-Manifold sowie die 10-Milliliter-Glas-Sammelgefäße.

Nun zwei Milliliter Hexan in jede Säule laden, um sie zu konditionieren, und das Lösungsmittel verwerfen. Danach den GPC-Probenextrakt in das Reservoir geben und durchsaugen. Den gesammelten Extrakt beiseitestellen und das Gefäß im Rack ersetzen, um die Waschfraktion aufzufangen.

Anschließend lassen Sie zwei Milliliter einer 30 Prozent Volumen pro Volumen enthaltenden Mischung aus Ethylacetat und Hexan durch die Kartusche fließen. Danach geben Sie zwei weitere Milliliter Ethylacetat und Hexan hinzu, entsorgen die gesammelten Waschlösungen und stellen das 10-Milliliter-Sammelgefäß zurück in das Rack. Geben Sie nun zwei Milliliter einer 50 Prozent Volumen pro Volumen enthaltenden Mischung aus Ethylacetat und Aceton in das Reservoir und starten Sie die Pumpe mit einer geringen Flussrate von unter zwei Millilitern pro Minute.

Nachdem die Flüssigkeit durchgelaufen ist, geben Sie weitere zwei Milliliter 50 %ige Ethylacetat zur Säule hinzu. Anschließend konzentrieren Sie das Extrakt mit einem Verdampfer auf ein Volumen von einem Milliliter ein. Danach überführen Sie die Probe in ein kleineres Glasfläschchen und verdampfen das Extrakt mit einem Stickstoffstrom bis zum Ansatz der Trocknung. Geben Sie 100 µL Methanol hinzu, mischen die Probe gründlich und überführen sie in ein Autosampler-Fläschchen mit einem 0,3-Milliliter-Einsatz.

Führen Sie anschließend die LC-MS/MS-Analyse des Extrakts durch. Bereiten Sie am Tag vor Beginn des Assays frisches Wachstumsmedium vor und impfen Sie es mit dem Tenax-Dock des verwendeten HER-Stamms an. Bereiten Sie am folgenden Tag den Assay vor, indem Sie 100 µL serielle Verdünnungen der Testchemikalien oder Eluat-Extrakte sowie anschließend die E2-Standardkurve in Ethanol herstellen.

Überführen Sie nun Aliquots von 10 Mikrolitern in eine beschriftete sterile 96-Well-Platte. Lassen Sie die Platte anschließend unbedeckt, damit der Ethanol verdunsten kann. Bereiten Sie danach 50 Milliliter Wachstumsmedium mit 0,5 Millilitern CPRG-Lösung vor.

Aus der 24-stündigen Hefekultur die Trübung bei 620 Nanometern messen, um die Zelldichte abzuschätzen. Anschließend 40 Millionen Hefezellen zu 50 Milliliter Assay-Medium hinzufügen. Das beimpfte Assay-Medium in eine sterile Wanne überführen und mit einer Mehrkanalpipette jeweils 200 Mikroliter Medium in jede Vertiefung der Assay-Platte übertragen.

Ersetzen Sie den Deckel der Testplatte, versiegeln Sie die Kanten mit Klebeband und schütteln Sie die Testplatte mithilfe eines Plattenschüttlern 2 Minuten lang kräftig. Anschließend inkubieren Sie die Platte 32 °C in einem natürlich belüfteten Heizschrank. Nach drei Tagen Inkubation wiederholen Sie den Schüttelschritt und lassen Sie die Hefe anschließend etwa eine Stunde lang absitzen.

Schließlich wird die Lichtabsorption der Proben bei 540 und 620 Nanometern gemessen. Wasserproben aus einer konventionellen Abwasserbehandlungsanlage zur Aktivierung des Schlammprozesses wurden mittels negativer Ionen-Elektrospray-LCMS untersucht; dabei wurde Ethinylestradiol in einer Konzentration oberhalb der vorhergesagten Wirkungsfreigrenze nachgewiesen. Mithilfe einer fortgeschrittenen Wasseraufbereitung, wie z. B. granuliertem Aktivkohle (GAC), ließen sich die Konzentrationen von Ethinylestradiol deutlich verringern.

Alle Abwasserextrakte wurden mit einem isotope-markierten internen Standard analysiert, rot markiert, um eine Quantifizierung zu ermöglichen. Der Hefe-Östrogen-Screening-Test war eindeutig empfindlich gegenüber dem Standardöstrogen Estradiol, zeigte jedoch keine Reaktion auf das Ethanol, das im Wesentlichen die Blindprobe darstellt. Die Hefe-Screening-Zellen reagierten eindeutig auf das Abwasser aus dem Belebtschlammverfahren, während das nach Aktivkohlebehandlung behandelte Abwasser eine verminderte Reaktion zeigte; dennoch war es biologisch aktiver als die Blindprobe.

Mithilfe dieser neuartigen Abwassertechnologie wurden sowohl die Konzentration von Ethinylestradiol, dargestellt in Blau, als auch die östrogene Aktivität, dargestellt in Grün, durch die kombinierte Behandlung mit Wasserstoffperoxid und TAML signifikant verringert. Kläranlagen sind die Hauptquelle für die Oberflächenwasserverschmutzung mit östrogenen Substanzen. Neue Ansätze zur Verbesserung von Wasserbehandlungsverfahren für diese Abläufe erfordern eine gründliche Prüfung der östrogenen Aktivität.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für eine Reihe chemischer und ökotoxikologischer Tests besitzen, die erforderlich sind, um die östrogene Aktivität in Wasserproben zu messen. Es ist äußerst wichtig, durch sorgfältige Handhabung der Proben und Extrakte sicherzustellen, dass deren Kontamination minimiert wird. Beispielsweise enthalten häufig verwendete Kunststoffe östrogene Verbindungen. Daher ist es unerlässlich, negative Kontrollen einzuschließen, um auf chemische Kontamination zu prüfen, sowie positive Kontrollen, um zu überprüfen, ob die Extraktionsmethode funktioniert hat und eine gute Rückgewinnung der zugesetzten Östrogene erfolgt ist.