Name: Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Erfahren Sie die Kultur von M-CSF-differenzierten humanen monozytenabgeleiteten Makrophagen. Diese Methode minimiert Zellvariabilität und verbessert die Verfügbarkeit für immunologische Forschung.

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Die Abteilung für Transfusionsmedizin, Klinisches Zentrum, National Institutes of Health, stellte elutriierte Monozyten zur Verfügung. Diese Arbeit wurde vom Intramural Research Program, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health unterstützt.

Leukapherese wurde unter einem menschlichen Subjekt Forschungsprotokoll, das von einem National Institutes of Health Institutional Review Board genehmigt durchgeführt. 1. Isolierung und Kryokonservierung von Monozyten <ol><li> Erhalten einkernigen Zellen durch Leukapherese von menschlichen Spendern und bereichern Monozyten durch kontinuierliche Gegenstrom - Zentrifugation Auswaschung von einkernigen Zellen als 7,8 in den Referenzen beschrieben. Erhalten ca. 100 x 10 6 aufgeschlämmt Zellen (etwa 80 bis 90% Monozyten) in Elutriation Puffer vom Hersteller angegeben. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Zentrifuge Monozyten in einem 15 ml Polypropylen-Röhrchen bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und die Zellen vorsichtig in FBS resuspendieren von Dimethylsulfoxid , gefolgt in einer Endkonzentration von 90% FBS / 10% Dimethylsulfoxid zu erreichen , und 50 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> In jeder ml der Zellsuspension to eine individuelle Cryovial. </li><li> Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einer Zelle Gefrierbehälter und in einen -80 ° C Gefrierschrank für 24 h vor Kryoröhrchen Vorratsbehälter für die Langzeitlagerung zu einem flüssigen Stickstoff übertragen. </li></ol> 2. Differenzierung von Monozyten in Makrophagen <ol><li> Auftauen ein Kryoröhrchen von Zellen durch zu einem 37 ° C Wasserbad schnell übertragen und dann sofort zu entfernen, wenn die Zellsuspension etwa 70% aufgetaut ist. </li><li> Unmittelbar nach dem vollständigen Auftauen bei Raumtemperatur, übertragen Sie die 1 ml Kryoröhrchen Inhalt in 50 ml 37 ° C erwärmt Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 2 mM L-Glutamin, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml Interleukin-10 (IL-10) und 10% FBS (komplettes Medium). </li><li> Transfer 25 ml Monozyten - Suspension in jeweils zwei 75 cm 2 Plastikzellkulturflaschen. </li><li> Inkubieren Kulturen in einem 37 ° C Zellkultur - Inkubator mit 5% CO 2/95% Luft für 48 Stunden. </li><li> Spülen Sie die cultures 3 mal mit 10 ml RPMI 1640-Medium (vorgewärmt auf 37 ° C), sanft das Kulturmedium Entfernen jeglicher lose anhaftenden Zellen zu vermeiden Verdrängen. </li><li> Nach dem Spülen, fügen Sie frisches komplettes Medium, Mediumwechsel alle 2 Tage bis Monozyten differenzieren und ausreichend zu konfluieren vermehren. Dies erfordert etwa eine Woche der Kultur. </li></ol> 3. Ernte Makrophagen Experimente zu initiieren <ol><li> Spülen differenzierten Makrophagen in Kolben 3 mal mit 10 ml vorgewärmten 37 ° C Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung ohne Ca 2+ und Mg 2+ , bevor die Zugabe von 10 ml vorgewärmten 37 ° C 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung. </li><li> Danach wird der Kolben in der Zellkultur-Inkubator 10 - 15 min zu diesem Zeitpunkt etwa 90% der Makrophagen abzurunden und abgelöst. Überprüfen dies durch mikroskopische Untersuchung des Kolbens. </li><li> 10 ml RMPI 1640-Medium mit 10% FBS zu sTop Trypsinierung. </li><li> Übertragen Sie die Makrophagen-Zellsuspension aus dem Kolben in ein 50 ml Polypropylenröhrchen, Zentrifuge 300 xg für 5 min, und den Überstand verwerfen. </li><li> resuspendieren Sie vorsichtig die Makrophagen in 1 ml Vollmedium. </li><li> Mischen 10 ul Makrophagenzellsuspension mit 10 ul Trypanblau-Lösung und bestimmen Makrophagenzellzahl und Lebensfähigkeit (typischerweise&gt; 95%) unter Verwendung eines Hämozytometers. </li><li> Auf der Grundlage der Zellzahl ( in der Regel etwa 15 - 18 x 10 5 Makrophagen), fügen Sie zusätzliche Komplettmedium die gewünschte Seedingzelldichte zu erreichen. Anmerkung: 1 x 10 5 Makrophagen in 1,5 ml Medium pro Well einer 12-Well - Platte wird eine nahezu konfluenten Kultur herzustellen. </li><li> Folgende Aussäen über Nacht inkubieren Makrophagen in einem 37 ° C Zellkultur - Inkubator mit 5% CO 2/95% Luft Zellanheftung zu ermöglichen. Dann beginnen die gewünschten Experimente. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

definiert Makrophagen-Typen generieren können von den Forschern erhalten einige der widersprüchlichen Ergebnisse verdeutlichen, wenn Makrophagen Biologie zu studieren. Die Verwendung von verschiedenen Kulturbedingungen und Differenzierungsfaktoren Makrophagen primären humanen erzeugen eine Tatsache zu sehr unterschiedlichen Makrophagen-Typen führen kann, die nicht durch den Forscher schätzen. Zum Beispiel werden manchmal Makrophagen aus humanen Monozyten erzeugt allein kein Serum, menschlichem Serum unter Verwendung von...

Die Untersuchung von kultivierten Makrophagen ist ein nützliches Modell, um die Funktion dieser Zellen bei Entzündungen zu verstehen, wie sie in atherosklerotischen Plaques auftreten. Wenn der Forschungsschwerpunkt auf menschlichen Krankheiten liegt, an denen Makrophagen beteiligt sind, ist es sinnvoll, primäre menschliche Makrophagen anstelle von nicht-menschlichen Makrophagen zu untersuchen, um Speziesunterschiede zu vermeiden. Außerdem können die Auswirkungen der Zelltransformation vermieden werden, indem primäre Makrophagen anstelle von Makrophagen-Zelllinien verwendet werden. Zu diesem Zweck dienen Makrophagen, differenziert von Monozyten, die aus menschlichem Blut isoliert wurden, als Mittel zur Gewinnung primärer humaner Makrophagen. 
Gewebemakrophagen können entweder in Geweben ansässig sein oder von Monozyten abgeleitet sein, die in das Gewebe wandern und sich zu Makrophagen differenzieren 1. Es wurden zwei Typen von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen definiert, die sich nicht nur in der Morphologie, sondern auch in der Genexpression und der Zellfunktion unterscheiden 2. Diese beiden Typen werden aus Monozyten gewonnen, die in Gegenwart von M-CSF + fötalem Rinderserum (FBS) in Makrophagen differenziert werden, und Monozyten, die in Gegenwart von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) + FBS 2-6 zu Makrophagen differenziert werden. Nach unserer Erfahrung (unveröffentlichte Beobachtung) erzeugt die Verwendung von Humanserum anstelle von FBS den GM-CSF-Typ, unabhängig davon, ob M-CSF oder GM-CSF im Differenzierungsmedium enthalten ist. Makrophagen vom M-CSF-Typ neigen dazu, länglicher zu sein als Makrophagen vom GM-CSF-Typ, die in ihrer Morphologie Spiegeleiern ähneln. Die Forscher sollten sich darüber im Klaren sein, dass humane M-CSF- und GM-CSF-Monozyten-abgeleitete Makrophagen nicht mit sogenannten M1- und M2-Maus-Knochenmark-Makrophagen identisch sind 6.
Während der Forschung mit humanen Monozyten-abgeleiteten M-CSF-differenzierten Makrophagen hatten wir Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Verfügbarkeit von Monozyten, um Experimente zu initiieren, und Variation in den erhaltenen Zelldichten von Makrophagen während der Differenzierung von Monozyten in Makrophagen. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir das folgende Protokoll entwickelt, bei dem Monozyten eingefroren werden, bis sie für die Verwendung benötigt werden, und Monozyten in großen Mengen in Makrophagen differenziert werden, die dann aus Kulturflaschen entnommen und mit der gewünschten Zelldichte plattiert werden können, um von Experiment zu Experiment einheitlichere Kulturen zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>Cellbind 12-Well-Kulturplatte</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, T-75 Flasche, mit Gewebekultur behandelt</td><td>Greiner Bio-One North America</td><td>658157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Kulturmedium</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>15-040-CM</td><td>erwärmt auf 37 > C</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-10&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Kryophiläum &nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>375418</tr><tr><td>DPBS ohne Ca2+ und Mg2+&nbsp;</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisches Polypropylen-Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-verbessertes Helllicht-Hämozytometer</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>610031</td><td>http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html</td></tr><tr><td>CoolCell LX Zelleinfrieren Behälter</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td>andere Gefrierbehälter sollten ebenfalls für diesen Schritt geeignet sein</td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff-Lagersystem, CryoPlus 1</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>7400</td><td>Jeder Flüssigstickstofftank sollte ausreichend sein</td></tr></tbody></table>

kultur von m-csf differentiated menschliche monozyten abgeleiteten makrophagen

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Zu Beginn der Experimente werden frische oder gefrorene Monozyten 1 Woche lang in Kolben mit M-CSF kultiviert, um ihre Differenzierung zu Makrophagen zu induzieren. Dann können die Makrophagen geerntet und in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden. Die Verwendung einer definierten Anzahl von Makrophagen anstelle einer definierten Anzahl von Monozyten zur Initiierung von Makrophagenkulturen für Experimente führt zu Makrophagenkulturen, in denen die gewünschte Zelldichte konsistenter erreicht werden kann. Die Verwendung von kryokonservierten Monozyten reduziert die Abhängigkeit von der Verfügbarkeit von Spendern und führt zu homogeneren Makrophagenkulturen.

Die Lebensfähigkeit von frischen oder kryokonserviert Monozyten war größer als 95% , wie mit bestimmt Trypanblau 9 Färbung. Abbildung 1 und Abbildung 2 vergleichen bei niedrigeren und höheren Vergrößerungen bzw. der Fortschritt der frischen und kryokonservierten (dh gefroren) Monozytendifferenzierung in Makrophagen. Beachten Sie, dass die frisch im Vergleich mit kryokonservierten Monozyten eine Subpopulation der Diffe...

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Das Protokoll nutzt die Kryokonservierung von Monozyten in Verbindung mit ihrer Massendifferenzierung in Makrophagen. Dann können geerntete Makrophagen in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Verfügbarkeit von Monozyten zu verbessern und die Variabilität der erzielten Zelldichten während der MCSF-induzierten Differenzierung menschlicher Blutmonozyten in Makrophagen zu minimieren. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zur Biologie menschlicher Makrophagen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Strategie liegt darin, dass Kulturen aus menschlichen monocytenabgeleiteten Makrophagen leichter gewonnen werden können und weniger von der Verfügbarkeit von Spendern abhängen. Zusätzlich können die gewünschte Makrophagenzell-Dichte und homogene Kulturen konsistent erreicht werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die mononukleären Zellen durch Leukozytenapherese von menschlichen Spendern gewinnen und anschließend die Monozyten durch kontinuierliche Gegenstrom-Zentrifugal-Elution der mononukleären Zellen anreichern. Danach zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Als Nächstes zentrifugieren Sie die Monozyten fünf Minuten bei Raumtemperatur in einem 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen. Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in FBS, gefolgt von Dimethy

culture-macrophage-colony-stimulating-factor-differentiated-human

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt das Priming von primären Monozyten in Makrophagen. Primäre humane Monozyten können isoliert und unter Verwendung des Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF) zu einem M1-ähnlichen proinflammatorischen Phänotyp oder unter Verwendung des Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF) zu einem M2-ähnlichen entzündungshemmenden Phänotyp differenziert werden.

In vitro Kultur und Differenzierung von primären Monozyten zu Makrophagen

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Induktion der Differenzierung und Polarisation von Monozyten aus peripherem Blut in M1- oder M2-Makrophagen. Die Inkubation mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, Lipopolysaccharid und Interferon-gamma ergibt proinflammatorische M1-Makrophagen, während die Inkubation mit Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor und Interleukin-4 die entzündungshemmende Produktion von M2-Makrophagen induziert.

Differenzierung und Polarisation von Monozyten-abgeleiteten Zellen in Makrophagen-ähnliche Zellen

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind wichtige Zellen des angeborenen Immunsystems. Hier beschreiben wir eine einfach zu...

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Wir stellen ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung von menschlichen Makrophagen. Buffy Coats werden durch Doppel Dichtegradientenzentrifugation isoliert verarbeitet und Monozyten werden dann an Makrophagen in Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel differenziert. Dies maximiert Makrophagen-Renditen und erleichtert die Zellernte für nachfolgende Experimente.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Knochenmarkzellen, die mit dem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) kultiviert wurden, erzeugen eine heterogene Kultur, die Makrophagen und dendritische Zellen (DCs) enthält. Diese Methode konzentriert sich auf die Verwendung von MHCII- und Hyaluronan (HA)-Bindung zur Unterscheidung von Makrophagen von den DCs in der GM-CSF-Kultur. Makrophagen in dieser Kultur haben viele Ähnlichkeiten mit Alveolarmakrophagen.

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

Hier wird ein Protokoll zum Nachweis der Produktion extrazellulärer Makrophagen (MET) in der Lebendzellkultur mittels Mikroskopie und Fluoreszenzfärbung vorgestellt. Dieses Protokoll kann weiter erweitert werden, um spezifische MET-Proteinmarker durch Immunfluoreszenzfärbung zu untersuchen.

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

M2-ähnliche tumorassoziierte Makrophagen (TAM) sind mit Tumorprogression und schlechter Prognose bei Krebs assoziiert. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen reproduzierbar in M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren. Dieses Modell ist die Grundlage, um die entzündungshemmende Wirkung von TAM in der Tumormikroumgebung zu untersuchen.

Makrophagendifferenzierung und Polarisation in einen M2-ähnlichen Phänotyp unter Verwendung einer humanen Monozyten-ähnlichen THP-1-Leukämie-Zelllinie

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen aus Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Monozyten und Makrophagen sind sehr plastische und reprogrammierbare Immunzellen, die für Gesundheit und Krankheit entscheidend sind. Sie spüren und reagieren auf ein breites Spektrum von Reizen, indem sie spezifische Differenzierungsprogramme und Phänotypen übernehmen. Wir haben ein In-vitro-Modell standardisiert, um die Polarisation und Reprogrammierung von Makrophagen zu untersuchen, was ein wertvolles Werkzeug für die Forschung darstellt.

Reprogrammierungsmodell von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen für In-vitro-Assays

Erfahren Sie die Kultur von M-CSF-differenzierten humanen monozytenabgeleiteten Makrophagen. Diese Methode minimiert Zellvariabilität und verbessert die Verfügbarkeit für immunologische Forschung.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

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