Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Verfügbarkeit von Monozyten zu verbessern und die Variabilität der erzielten Zelldichten während der MCSF-induzierten Differenzierung menschlicher Blutmonozyten in Makrophagen zu minimieren. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zur Biologie menschlicher Makrophagen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Strategie liegt darin, dass Kulturen aus menschlichen monocytenabgeleiteten Makrophagen leichter gewonnen werden können und weniger von der Verfügbarkeit von Spendern abhängen.

Zusätzlich können die gewünschte Makrophagenzell-Dichte und homogene Kulturen konsistent erreicht werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die mononukleären Zellen durch Leukozytenapherese von menschlichen Spendern gewinnen und anschließend die Monozyten durch kontinuierliche Gegenstrom-Zentrifugal-Elution der mononukleären Zellen anreichern. Danach zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers.

Als Nächstes zentrifugieren Sie die Monozyten fünf Minuten bei Raumtemperatur in einem 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen. Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in FBS, gefolgt von Dimethylsulfoxid, um eine Endkonzentration von 90 % FBS, 10 % Dimethylsulfoxid und 50 × 10⁶ Zellen pro Milliliter zu erreichen. Danach geben Sie ein Milliliter der Zellsuspension in eine einzelne Kryoröhrchen.

Stellen Sie die Kryofile in einen Zellgefriertank und überführen Sie diesen für 24 Stunden in den Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank. Nach 24 Stunden überführen Sie den Tank in einen Kryotank mit flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung. In diesem Schritt wird ein Kryofile mit Zellen durch kurzes Einlegen in ein 37 °C warmes Wasserbad aufgetaut.

Wenn die Zellsuspension zu etwa 70 % aufgetaut ist, entfernen Sie sie sofort aus dem Wasserbad und bringen Sie sie auf Raumtemperatur. Nachdem die Zellsuspension vollständig aufgetaut ist, überführen Sie ein Milliliter des Inhalts der Kryoröhre in 50 Milliliter RPMI 1640-Medium mit zwei Millimolar L-Glutamin, 50 Nanogramm pro Milliliter M-CSF, 25 Nanogramm pro Milliliter IL-10 und 10 % FBS bei 37 Grad Celsius. Anschließend geben Sie 25 Milliliter der Monocyten-Suspension auf zwei 75 Quadratzentimeter große Kunststoffzellkulturflaschen.

Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Denken Sie daran, das Medium erst nach 48 Stunden zu wechseln; andernfalls heften sich die Zellen nicht gut an und werden weggespült. Nach 48 Stunden spülen Sie die Kulturen dreimal mit je 10 Milliliter vorgewärmtem RPMI 1640-Medium aus.

Entfernen Sie vorsichtig das Kulturmedium, um lose angeheftete Zellen nicht zu lösen. Anschließend geben Sie komplettes Medium hinzu und kultivieren die Zellen eine Woche lang. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, bis sich die Monozyten effizient differenzieren und proliferieren und eine konfluente Zellschicht bilden.

Spülen Sie die differenzierten Makrophagen im Kolben nun dreimal mit je 10 Milliliter 37 Grad Celsius warmem DPBS ohne Calcium und Magnesiumium. Anschließend geben Sie 10 Milliliter 37 Grad Celsius warmer 0,25 %igen Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Danach stellen Sie den Kolben für 10 bis 15 Minuten in einen Zellkulturinkubator.

Danach sollten etwa 90 % der Makrophagen abgerundet und sich gelöst haben. Anschließend 10 Milliliter RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS hinzufügen, um die Trypsinierung zu stoppen. Gegebenenfalls einen Zellabheber verwenden, um die Zellen vollständig zu entfernen.

Manchmal bleiben bei diesem Verfahren viele Makrophagen anhaftend zurück. Diese Makrophagen können nach der Trypsinisierung entfernt werden, indem man einen Zellabstreifer über die Fläschchenoberfläche führt. Anschließend überträgt man die Makrophagen-Zellsuspension vom Fläschchen in ein 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen.

Zentrifugieren Sie es fünf Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand. Wiederresuspendieren Sie die Makrophagen dann vorsichtig in einem Milliliter komplettem Medium. Basierend auf der Zellanzahl fügen Sie zusätzliches komplettes Medium hinzu, um die gewünschte Ansiedlungsdichte der Zellen zu erreichen.

Anschließend die Makrophagen in 1,5 Milliliter Medium pro Vertiefung einer 12-Loch-Platte ansäen. Eine Zellzahl von 1 × 10⁵ Zellen in 1,5 Milliliter Medium pro Vertiefung ergibt in der Regel eine nahezu konfluente Kultur. Nach der Aussaat die Makrophagen über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Zelladhäsion zu ermöglichen, bevor sie in Experimenten verwendet werden.

Diese Abbildung zeigt die kontrastverstärkten mikroskopischen Aufnahmen von kryokonservierten frischen Monozyten während ihrer durch MCSF induzierten Differenzierung in Makrophagen bei geringer Vergrößerung. Die Aufnahmen der Monozyten wurden am dritten und siebten Tag der Kultur im Kolben sowie am achten Tag, einem Tag nach ihrer Gewinnung und erneuten Aussaat in die 12-Loch-Kulturplatte, angefertigt. Dargestellt ist hier der Vergleich von frischen mit kryokonservierten Monozyten, die zur Erzeugung von Makrophagen verwendet wurden, bei hoher Vergrößerung.

Die aufgelockerten Vakuolen sind Makropinosomen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie humane Monozyten mittels MCSF in Makrophagen kryokonserviert und anschließend differenziert werden können. Anschließend können die Makrophagen bei gewünschten Zelldichten für Experimente kultiviert werden.