Name: Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Lernen Sie die intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie zur Untersuchung der Einwanderung und Engraftment-Dynamik hämatopoetischer Zellen in Knochenmarks-Nischen mithilfe genetischer Tiermodelle.

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Bildgebung erfolgte im Indiana-Zentrum für biologische Mikroskopie an der Indiana University, unter der Regie von Dr. Ken Dunn. Das stereotaxischen Gerät ist ein Prototyp entworfen und hergestellt von Mark Soonpaa, Brunnen-Zentrum für pädiatrische Forschung. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN Research Foundation (NC) und die CTSI kollaborative Projekt IUSM/Notre Dame (NC).

Alle Verfahren im Zusammenhang mit der Verwendung von Tieren wurden mit Genehmigung der Animal Care und verwenden Ausschuss der Indiana University School of Medicine durchgeführt. Sicherstellen Sie, dass die Einhaltung der Rechtsvorschriften über Tierversuche des Landes wo die Arbeit ausgeführt wird.
1. Vorbereitung des Mx1CreRBPJ- / - Empfänger Mäuse
<ol><li>Mx1-Cre+ Mäuse mit RBPJLox/Lox Mäusen10 Mx1-Cre zu überquerenpositive RBPJLox/Lox Mäusen12 und Mx1-Cre negative RBPJLox/Lox Wurfgeschwistern als Steuerelemente verwenden. Überprüfen Sie den Genotyp durch PCR-10.</li>
	<li>Verwenden Sie 6-8 Wochen-alte Mx1Cre+/RBPJLox/Lox und Mx1Cre–/RBPJLox/Lox Mäusen, die PolyI:C Induktion durchzuführen.</li>
	<li>
PolyI:C 200 µg i.p Cre+ und Cre– Mäuse zu injizieren. Geben Sie eine PolyI:C Injektion jeden zweiten Tag für 3 Tage in der ersten Woche. Geben Sie eine PolyI:C Injektion der zweiten Woche, 7 Tage nach der letzten Injektion (insgesamt vier Injektionen).
	<ol>
<li>Verwenden Sie RBPJKO (induzierte Mx1Cre+/RBPJLox/Lox) und RBPJWT (induzierte Mx1Cre–/RBPJLox/Lox) Mäuse als Empfänger 3 Wochen nach der letzten Injektion von PolyI:C. Hinweis: Es wird empfohlen, Mäuse induziert durch pI: pC 3 Wochen nach der Injektion zu verwenden. Die IFNα Reaktion ausgelöst durch PolyI:C erhebliche Veränderungen in der BM, was die Immunophenotypic-Erweiterung des HSC und verringerte Leistung von Reifen Stammväter in das periphere Blut16,17. Darstellung der hämatopoetischen Teilmengen ist normalisierte 3 Wochen nach der Injektion und die Mäuse ohne verwirrende Entzündungen genutzt werden können. Diese Induktion-Protokoll ist für RBPJ optimiert worden. Wenn ein anderes gen zu löschen, die Induktion Protokoll variieren das Konstrukt und Löschung muss überprüft werden. Wir validiert ~ 100 % Streichung der RBPJ Region zwischen LoxP-Standorten durch RT-PCR nach insgesamt vier PolyI:C Injektionen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung des Lys-EGFP Spenderzellen Knochenmark zur Transplantation
<ol><li>Einschläfern eine Lys-EGFP-Maus (Kohlendioxid gefolgt von zervikale Dislokation) 1 oder 2 h vor der Transplantation.</li>
	<li>Besprühen Sie die tierischen Körper-Oberfläche mit 70 % Ethanol.</li>
	<li>Können Sie chirurgische Scheren einen Hautschnitt an beiden Beinen um den Knöchel zu machen und mit chirurgischen Zangen wegziehen Haut und Fell zusammen, um saubere Muskelgewebe verfügbar zu machen.</li>
	<li>Verwenden Sie chirurgische Scheren, um so viel Muskelmasse wie möglich aus den Beinen zu entfernen. Mit einer Schere schneiden die Knochen (an Knie und Sprunggelenk) und alle übrigen Muskelgewebe aus dem Oberschenkelknochen und Schienbeine mit Gaze Schwämme reinigen. Legen Sie die Knochen (zwei Oberschenkelknochen und zwei Tibien) in einer 6-Well-Platte mit DMEM 10 % FBS.</li>
	<li>Zerdrücken Sie den Knochen in einem Mörser mit 10 mL kalten 2mM EDTA PBS und Pipettieren Knochenmarkzellen um die Zellen in einzellige Aussetzung zu bringen. Alternativ spülen Sie die Knochen mit 2 mM EDTA PBS 3 Mal von jeder Seite mit einer 1 mL Spritze.</li>
	<li>Filtern Sie die Knochenmarkzellen mit einem 70 µm-Filter in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Spülen Sie die Filter mit ca. 2-3 mL PBS. Drehen Sie die Zellen nach unten 10 min bei 460 X g, Aufschwemmen der Zellen in 10 mL frisches DMEM 10 % FBS.</li>
	<li>Zählen Sie Knochenmarkzellen auf ein Hemocytometer und passen Sie die Konzentration auf 1,5 x 107 Zellen/mL in IMDM ohne Serum. Verwenden Sie 3 x 106 Zellen pro Tier mit einem Volumen von 200 µL. Ca. 1/3 des gesamten BM myeloische GFP + Zellen sind. Lassen Sie die Zellen auf Eis, bis bereit zur Injektion. Verwenden Sie 0,5 x 105 Zellen GFP Ausdruck durch FACS9zu ermitteln.</li>
</ol>(3) Knochenmark-Transplantation von Lys-GFP Zellen in RBPJKO Mäuse
<ol><li>Empfängers Mäuse in einem Kreisdiagramm Käfig zurückhalten. Mäuse mit einer letalen Dosis von Gamma-Strahlung zu bestrahlen (1.200 Rad) auf eine Cs-137-Brutapparat. Verwenden Sie eine geteilte Dosis Protokoll: 900 rads am Abend gefolgt von 300 rads am nächsten Morgen (16 h auseinander).</li>
	<li>Transplant letal bestrahlten RBPJWT und RBPJKO Empfänger Mäuse 5-6 h nach der zweiten Dosis der Strahlung. BM injizieren Zellen geerntet von Lys-EGFP-Mäusen in einer Konzentration von 3 x 106 Zellen pro Tier über Heck Vene Injektion (siehe Details zum Ernten von Zellen in Abschnitt 2).</li>
	<li>Bild unabhängige Kohorten von transplantierten Mäusen durch IVFM zu verschiedenen Zeitpunkten: 24 h, und in der Woche 2, 4 und 6, wie beschrieben unten (siehe Abschnitt 4 & 5 für in-Vivo imaging-Verfahren).</li>
</ol>4. chirurgische Vorbereitung intravitalen Imaging
<ol><li>Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente. Zwei feine Pinzette (eine gerade, eine abgewinkelt), ein paar feine Schere und ein paar Nadelhalter. Bereiten Sie operativen Bereich mit allen Lieferungen für Verfahren benötigt.</li>
	<li>Geben Sie der Maus eine IP-Injektion von Ketamin cocktail Betäubung (Xylazin 2,5-5 mg/kg + Acepromazine 1,0-2,5 mg/kg + Ketamin 90-100 mg/kg) mit einer 26-28 G Nadel Spritze.  Tier wird alle 15 Minuten während des Eingriffs überwacht werden und Narkose wird nach Bedarf auf ¼ der ursprünglichen Dosis ergänzt werden.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf einer richtigen Wärmequelle (37 ° C Heizkissen, Tier geschützt vor direktem Kontakt mit Heiz-Pads) und überwachen Sie die Atemfrequenz visuell zu.</li>
	<li>Überprüfen Sie Reflexe mit dem Zeh Response kneifen. Sicherstellen Sie, dass das Tier vollständig unter Narkose ist, vor Beginn jeder chirurgischen Eingriffen.</li>
	<li>Verwendung eines 26-28 gauge Nadel Spritze Mäuse eine Rute Vene Injektion eines fluoreszierenden vaskuläre Marker (Dextran, 100 μL 20 mg/mL Lösung) geben.</li>
	<li>Tierarzt Augensalbe auf beiden Augen anwenden. Clip der dorsalen Oberfläche des Tierkopfes mit kleinen elektrischen Haarschneider. Wenden Sie eine Haarentfernung Creme für 5 min. Einsatz Gaze Schwämme, die Creme zu entfernen und dann mit Kochsalzlösung abspülen. Vorbereitung der sauberen Kopfhaut mit 70 % Alkohol mit einem Wattestäbchen.</li>
	<li>Verwenden Sie feine Pinzetten und Scheren zu einem kleinen Mittellinie Hautschnitt (10-20 mm) auf der Kopfhaut, die zugrunde liegenden dorsalen Schädel Oberfläche verfügbar zu machen. Verwenden Sie 5-0 chirurgische Seide um zwei Aufenthalt Nähte in der Haut auf jeder Seite des Schnittes, erstellen eine Klappe, die Calvarium für die Bildgebung aussetzen zu platzieren.</li>
	<li>Positionieren Sie die Mäuse auf den Rücken und Tauchen Sie die exponierten Kopfhaut in eine Glasschale unten mit Mikroskop Öl gefüllt. Das Tier der Mutiphoton imaging Raum zu transportieren.</li>
	<li>Legen Sie das Tier auf den Mikroskoptisch mit dem Calvarium positioniert auf die Glasschale über das Ziel und dann bedecken Sie mit einem 37° C Heizkissen (Tier muss vor direktem Kontakt mit Hitze geschützt werden).</li>
</ol>5. in Vivo hochauflösende Bildgebung der Maus Calvarium
<ol><li>Verwenden Sie ein umgekehrte konfokale System für multiphoton Bildgebung modifiziert (siehe Materialien Tabelle). Folgende Angaben des Herstellers tune einen 2-Photonen-Laser mit 830 nm, eine 20 X W, NA 0.95 Objektiv in das Mikroskop Nasenstück und überprüfen Sie den Laser-Strahl-Ausrichtung. Hinweis: Aufrechte Mikroskopsysteme werden am häufigsten für diese Studien verwendet, aber eine umgekehrte multiphoton-System kann auch genutzt werden. In dieser Studie wurde eine benutzerdefinierte gestaltete atraumatische stereotaktischen Gerät verwendet. Obwohl mehrere handelsübliche stereotaktischen Geräte für aufrechte Mikroskopsysteme vorhanden sind, gibt es keine handelsübliches stereotaktischen Gerät für ein umgekehrtes Mikroskopsystem zur Sicherung des Maus-Schädels. Als alternative zu einem benutzerdefinierten stereotaktischen Gerät kann der Schädel in Position über das Ziel, die Verwendung von Klebeband oder Klebstoff Methoden zur Stabilität gesichert werden.</li>
	<li>Öffnen Sie eine Bild-Datenerfassungs-Software. In den "Erwerb"Settings Panel überprüfen, ob eine direktionale Scan-Modus ausgewählt ist. Richten Sie die Geschwindigkeit des Scannens 4 µs/Pixel, Bildrate auf 512 x 512 Pixel und Zoomen Sie auf 1,5. Wählen Sie 20 X W Na 0,95 Ziel aus der Liste der verfügbaren objektiven entsprechend das Objektiv in der Nasensteg positioniert.</li>
	<li>Zugriff auf die "Dye-Liste" aus der "Image Acquisition Systemsteuerung" und wählen Sie "Zwei-Photon". Öffnen Sie das Fenster "Licht Weg & Farbstoffe" und wählen Sie DM690-980 Erregung DM Open der 2P-Laser-Verschluss durch Aktivierung des Kontrollkästchens in der Laser-Unit 2. Wählen Sie im Fenster "Mikroskop Controller" RDM690 Spiegel.</li>
	<li>Wählen Sie "EPI-Lampe", wählen Sie B/G-Epi-Filter-Cube und konzentrieren Sie das Ziel auf die Probe, Kreislauf fließen und die Calvarium Knochenmark Nische, mit als Referenz der Bifurkation der Zentralvene (a) und die koronare Naht (b) (Abb. 2A) zu visualisieren.</li>
	<li>
Sammeln Sie Bilder mit nicht descanned Modus. Wählen Sie drei externen Detektoren: PMT detector1 SHG Signal von Kollagen zu sammeln (Emission Filter - 430/100 nm), GaAsP detector2 sammeln GFP-Signal (Emission Filter - 525/50) und GaAsP detector3 Signal des TRITC-Dextran sammeln (Emission Filter - 605/90 nm).
	<ol>
<li>Durchführen Sie Bildgebung mit einer Scanrate von 4μs/Pixel mit keine Mittelung zur Minimierung von Phototoxizität. Sammeln Sie Bilder einen konstanten Laser Power und Detektor Gewinn so angepasst, dass um den volle Dynamikumfang des Detektors mit minimalen Sättigung zu nutzen.</li>
		<li>Sammeln Sie Serie Abschnitte durch die Tiefe des Gewebes (60 x 1 μm Z-Stapel) aus 6 Regionen Calvarium Knochenmark. Verwenden Sie Schritt Größeneinstellungen von 1 μm, zoom, 1,5 und 512 x 512 Pixel Rahmengröße (423 µm X 423 µm). Hinweis: Insgesamt ist total Zeitaufwand für eine Maus Bild 1-1,5 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(6) Quantitative Analyse
<ol><li>Die Bild-Quantifizierung und 3D Rekonstruktionen mit einer dedizierten 3D/4D Bild Quantifizierung und Visualisierung Software gemäß Herstellervorschrift auszuführen (siehe Materialtabelle). Z-Stacks in 3D mit maximaler Intensität Projection (MIP), Alpha-Mischung oder Schatten Projektion Volume Rendering Algorithmen interaktiv zu visualisieren.</li>
	<li>Segment GFP Zellen unter Verwendung der "Ort Objektmodul Segmentierung". Gelten Sie Stack arithmetischen Verarbeitung (Kanal Subtraktion) um falsche positive Zählung der GFP Zellen zu beseitigen (dadurch Signal von Knochenzellen, die starke Fluoreszenz im grünen und roten Kanäle anzeigen).</li>
	<li>Durchzuführen Sie Segmentierung der Gefäße und Knochen Oberfläche mit Hilfe des Moduls Oberfläche Segmentierung. Bei Bedarf berechnen Sie Entfernungen von Zellen zu einem der oben genannten Oberflächen durch X-Tension Algorithmen "Abstand von spot zu Oberfläche" genannt.</li>
</ol>

<ol><li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li>
<li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li>
<li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li>
<li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li>
<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Design so optimiert, dass die Kinetik der blutbildenden Zellen Engraftment studieren von fluoreszierendem intravitalen Mikroskopie. In dieser Studie wurde der Ausbau der myeloischen Vorläuferzellen in einer WT-BM oder in eine Kerbe, die Signalisierung defekt BM in den Knochen Calvarium von folgenden Lys-GFP positive myeloische Zellen nach BMT in RBPJWT oder RBPJKO Empfänger verfolgt. Dieser Ansatz wird vorgeschlagen, als ein Modell, das auf ähnliche Fragen, zum Beispiel ang...

Intravitalen multiphoton Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) ist ein leistungsfähiges bildgebendes Verfahren, das ermöglicht die hochauflösende, Echtzeit-Bildgebung von Geweben mit Tiefe bis zu 1mm, je nach Gewebe. Bei der Anwendung auf die Maus Calvarium ermöglicht es, beobachtet das Verhalten der hämatopoetischen Zellen innerhalb der BM in eine nicht-invasive Weise bis zu 60-100 μm11. Dieser Ansatz dient hier die Kinetik des Engraftment des normalen myeloische Vorfahren in den BM RBPJ Knock-out-Mäusen fehlt kanonische Kerbe Signalisierung zu bestimmen.
Neuere Arbeiten aus unserer Gruppe zeigten, dass Defekte kanonische Kerbe Signalisierung BM Mikroumgebung, führe zu einer myeloproliferative-ähnliche Erkrankung12. Verlust der Notch signaling erhielten bedingte Löschung der DNA-bindende Domäne der RBPJ, der kritischen Transkriptionsfaktor flussabwärts der kanonischen Kerbe Signalisierung mit Mx1-Cre Rekombination10induziert. In dieser Studie wurde die Mx1-Cre/RBPJLox/Lox Mäusen Modell verwendet. Bedingte Löschung des Motivs DNA-Bindung des RBPJ führt zum Verlust der Signalisierung von allen Notch Rezeptoren. In der Mx1-Cre-Modell, Cre Ausdruck durch den Mx1-Projektträger bei der Verabreichung von PolyI:C, wodurch die Induktion der gezielte gen Löschung in den Blutkörperchen sowie Stromazellen Komponenten mehrerer Organe aktiviert angetrieben wird einschließlich BM, Milz und Leber.
Mx1-Cre+/RBPJLox/Lox und Mx1-Cre–/RBPJLox/Lox Mäusen mit PolyI:C (hereon gekennzeichnet als RBPJKO und RBPJWT, beziehungsweise) induziert wurden tödlich bestrahlt und mit normalen, Wildtyp hämatopoetischen Zellen transplantiert. Ab 4. Woche nach der Transplantation, entwickelt RBPJKO Empfänger deutliche Leukozytose gefolgt von Splenomegalie. Obwohl RBPJKO Mäuse zunehmenden Anteils myeloischer Vorläuferzellen in der BM 8. Woche nach Transplantation und zu späteren Zeitpunkten vorgestellt, offenbart Analyse des BM 4 und 6 Wochen nicht auffällige Unterschiede inhaltlich myeloische Zellen im Vergleich zur Kontrolle RBPJWT Empfänger. Diese Beobachtung zusammen mit der Tatsache, dass Mx1-Cre in verschiedenen blutbildenden Organe exprimiert wird die Frage aufgeworfen, ob die BM Mikroumgebung direkten Einfluss auf die Einleitung der myeloproliferative Phänotyp hatten.
Um festzustellen, ob der BM eine kritische erste Website der Krankheitsentwicklung war, wurde IVFM von der Maus Calvarium in Kombination mit BM-Transplantation (BMT), RBPJ-Knock-Out-Modell und eine Linie tracking-System verwendet. Transgene Mäuse, die mit dem Ausdruck EGFP unter der Kontrolle der spezifischen Lysozym Promotor (Lys-GFP)9 wurden verwendet, um die Spenderzellen zu erhalten, die bei BM imaging nach BMT visualisiert werden können. Lysozym Ausdruck ist spezifisch für myeloische Zellen und Lys-GFP markiert Zellen aus der gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (CMP) zur Reife Granulozyten13.
IVFM des BM zu unterschiedlichen Zeitpunkten gezeigt, dass Lys-GFP Zellen ebenso an die BM der RBPJWT und RBPJKO Empfänger vernetzten, aber erweitert und schneller in der BM RBPJKO Empfänger aufgeprägt. Dieser Unterschied war dramatisch zum früheren Zeitpunkt (Woche 2) und verringerte sich im Laufe der Zeit (Wochen 4 und 6). Jedoch zu dieser späteren Zeitpunkten, Bewertung von hämatopoetischen Fach in den gleichen Empfänger zeigte eine stetige Zunahme der Zahl der myeloischen Zellen zirkulieren in der PB und lokalisiert in der Milz von Mäusen, RBPJKO, zeigt eine erhöhte Leistung von Zellen aus dem BM in den Blutkreislauf. Lys-GFP Zellen Lokalisierung in der BM von transplantierten Mäusen bei 6 Wochen ergab, dass myeloische Zellen weiter das Gefäßsystem in der Mikroumgebung RBPJKO als im Steuerelement wohnen würden.
Kollektiv, Einblicke die Kombination von IVFM mit dieser bestimmten Tiermodellen in der Engraftment Dynamik der myeloischen Zellen in die RBPJKO BM Mikroumgebung. Die Versuchsplanung und quantitative der hier beschriebene Ansatz wird vorgeschlagen, als ein Paradigma, die angewendet werden kann, um ähnliche Fragen beantworten. Beispielsweise gestatten die Verwendung der anderen Zelle spezifische Linie tracking-Modelle, wie RAG1-GFP14 oder Gata1-GFP15 Mäuse, im Anschluss an das Verhalten des lymphatischen oder erythroiden Vorläuferzellen, bzw. in dem BM.

<table><tbody><tr><td>Ketamin-Cocktail</td><td>IU School of Medicine</td><td></td><td>Ketamin 90-100 mg/kg, Xylazin 2,5-5,0 mg/kg, Acepromazin 1,0-2,5 mg/kg</td></tr><tr><td>TRITC Dextran</td><td>Tdb Consultancy</td><td>TD150-100mg</td><td>Es können auch andere Farbstoffe verwendet werden.</td></tr><tr><td>Andis Haarschneider</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-323 75</td><td></td></tr><tr><td>Mullschwamm</td><td>Med Vet International</td><td>PK224</td><td>4-lagig, 2 x 2</td></tr><tr><td>Nair Enthaarungscreme</td><td>Fachgeschäft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Med Vet International</td><td>RXSAL-POD1LT</td><td>0,9% Natriumchlorid Polyflasche</td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td>28 g, 1/2 cc</td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>00108-11, 00109-11</td><td>gerade Pinzette, abgewinkelte Pinzette</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Seidennaht</td><td>Fisher Scientific</td><td>MV-682</td><td>Andere nicht resorbierbare Nahtteile können verwendet werden</td></tr><tr><td>WillCo- Glasbodenschale</td><td>WillCo</td><td>GWSt-5040</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop Öl</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Tischeinsatz&nbsp;</td><td>IU School of Medicine</td><td>Kundenspezifisches Design</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1000 konfokales Mikroskopsystem&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 Objektiv&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleines Heizkissen</td><td>Handelsgeschäft</td><td></td><td>Zoo Med Heizkissen für Reptilien</td></tr><tr><td>Imaris 8.1 Bildgebungssoftware</td><td>Bitplane</td><td></td><td>3/4 D Software zur Bildvisualisierung und -analyse</td></tr></tbody></table>

kombination von intravitalen fluoreszenz-mikroskopie (ivfm) mit genetischen modellen engraftment dynamik der blutbildenden zellen des knochenmarks nischen zu studieren

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Erhöhung der Beweis zeigt an, dass die normale Blutbildung durch ausgeprägte microenvironmental Hinweise in der BM reguliert wird, darunter spezialisierte zelluläre Nischen modulierende kritische hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Funktionen1,2. In der Tat zeichnet sich ein genaueres Bild von der hämatopoetische Mikroumgebung jetzt bei dem bilden der endosteal und die endothelialen Nischen Funktionseinheiten für die Regulierung des normalen HSC und ihre Nachkommen3,4,5, . Neue Studien haben die Bedeutung der perivaskuläre, Adipozyten und neuronalen Zellen bei der Erhaltung und Regulierung der HSC Funktion6,7,8gezeigt. Darüber hinaus gibt es Beweise, dass Zellen aus verschiedenen Linien, d.h. myeloischen und lymphatischen Zellen, Haus und wohnen in speziellen Nischen innerhalb der BM Mikroumgebung. Allerdings ist eine vollständige Zuordnung der BM Mikroumgebung und seine Bewohner noch im Gange.
Transgenen Mausstämme Linie bestimmte fluoreszierende Markierungen oder Mäuse, die genetisch ausgeführt, um ausgewählte Moleküle in bestimmten Zellen der BM Nische fehlt auszudrücken sind jetzt verfügbar. Knock Out und Abstammung tracking-Modelle in Kombination mit Transplantation Ansätze bieten die Möglichkeit, das Wissen über die Rolle der spezifischen "Nische" zu verfeinern Zellen für definierte hämatopoetischen Bevölkerungen, wie HSC, B-Zellen, T-Zellen, myeloische Zellen und erythroiden Zellen. Diese Strategie kann weiter durch die Zusammenlegung des Einsatz von zwei-Photonen-Mikroskopie von den Calvarium verstärkt werden. Indem in Vivo hochauflösende Bildgebung und 3-d-Rendering von BM Calvarium, können wir jetzt genau die Position bestimmen, wo bestimmte hämatopoetische Teilmengen in BM zu Hause und die Kinetik der ihre Expansion im Laufe der Zeit zu bewerten. Hier werden Lys-GFP transgene Mäuse (Markierung myeloische Zellen)9 und RBPJ Knock-out-Mäusen (fehlender kanonische Notch signaling)10 in Kombination mit IVFM zur Engraftment myeloische Zellen eine Kerbe defekt BM Mikroumgebung zu bestimmen.

Kohorten von 2 RBPJKO und 2 RBPJWT Empfängern wurden in eine bildgebende Einzelsitzung zu unterschiedlichen Zeitpunkten abgebildet: 24 h und 2, 4 und 6 Wochen nach der Transplantation der BM Lys-GFP Zellen (Workflow abgebildet in Figur 1A).
In jeder Maus wurden Bilder aus 6 standard Regionen der BM Calvarium, gekennzeichnet durch ihre Position in Bezug auf die Zweiteilung der Zentralvene (Abb. 2A</strong...

Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die in vivo Transplantation von Blutzellen in die Knochenmarknischen des Empfängers sichtbar zu machen und zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung zellulärer Prozesse wie Homing, Expansion und Lokalisierung in verschiedenen Knochenmarknischen von hämatopoetischen Spenderzellen nach der Transplantation ermöglicht. In Kombination mit den manipulierten Tiermodellen kann dieser Ansatz bei der Definition molekularer Signalwege helfen, die für die hämatopoetische Zellregeneration entscheidend sind.Im Gegensatz zur Histologie oder anderen bildgebenden Verfahren ermöglicht die Intravitalmikroskopie die Erfassung von Zell-zu-Zell-Interaktionen in einem lebenden Tier auf zellulärer Ebene und in Echtzeit. Wir haben uns entschieden, diese Methode zu verwenden, um festzustellen, ob die Mikroumgebung des Knochenmarks der ursprüngliche Ort der Entwicklung der myeloproliferativen Erkrankung war, die durch den Verlust des Notch-Signalwegs verursacht wurde. Zu den Herausforderungen für Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, gehören die Minimierung von Atemartefakten, die optimale Positi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf...

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Die Art der Wechselwirkung zwischen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) und Knochenmark Nischen schlecht verstanden. Kundenspezifische Hardware-Modifikationen und eine mehrstufige Akquisitionsprotokoll ermöglichen den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie und konfokaler Bild ex vivo markierten HSPCs innerhalb des Knochenmarks Bereichen referenziert, Tracking-Wechselwirkungen und Bewegung.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Monozyten sind Schlüsselregulatoren der angeborenen Immunität und spielen eine entscheidende Rolle bei der Erneuerung des peripheren mononukleären phagozytischen Systems und im Falle von Entzündungen. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Echtzeit-Bildgebung des Schädeldachknochenmarks der Maus, um den Mobilisierungsmechanismus der Monozyten zu untersuchen.

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges Maus-Femur-Fensterkammermodell, das verwendet werden kann, um die Bewegung von Zellen im femoralen Knochenmark in vivo zu verfolgen. Die Intravital-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um drei Komponenten des femoralen Knochenmarks (Gefäße, Kollagenmatrix und Neutrophile) im Zeitverlauf abzubilden.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Eine Methode zum Erstellen und Lebendigen von verschiedenen humanisierten Knochenmarknischen in Mäusen wird vorgestellt. Basierend auf der unterstützenden Nische, die durch menschliche mesenchymale Zellen erzeugt wird, induziert die Zugabe von menschlichen Endothelzellen die Bildung von menschlichen Gefäßen, während die Zugabe von rhBMP-2 die Bildung von menschlichem Maus-chimären reifen Knochengewebe induziert.

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Dieses Protokoll beschreibt die intrafemorale Injektion einiger hämatopoetischer oder leukämischer Stammzellen, einschließlich geneditierter Zellen, in murine Xenotransplantatmodelle, die nicht nur eine schnelle und sichere Transplantation von Zellen, sondern auch serielle Analysen des Knochenmarks ermöglichen.

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

Intrafemorale Injektionen ermöglichen die Transplantation einer kleinen Anzahl von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), indem die Zellen direkt in der Knochenmarkhöhle platziert werden. Hier beschreiben wir ein experimentelles Protokoll zur intrafemoralen Injektion von humanen HSPCs in immundefiziente Mäuse.

Intrafemorale Injektion von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse 

Die Intravitalmikroskopie ermöglicht die Untersuchung dynamischer biologischer Prozesse wie Geweberegeneration und Tumorentwicklung. Das Schädeldachknochenmark, ein hochdynamisches Gewebe, bietet Einblicke in die Blutbildung und Gefäßfunktion. Die Verwendung eines biokompatiblen 3D-gedruckten Kopffixationsimplantats ermöglicht eine repetitive Längsbildgebung und verbessert so unser Verständnis der Gewebedynamik und der Mikroumgebung des Tumors.

Intravitale longitudinale Bildgebung der Gefäßdynamik im Schädeldachknochenmark

Lernen Sie die intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie zur Untersuchung der Einwanderung und Engraftment-Dynamik hämatopoetischer Zellen in Knochenmarks-Nischen mithilfe genetischer Tiermodelle.

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren (Video) | JoVE Journal

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