Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die in vivo Transplantation von Blutzellen in die Knochenmarknischen des Empfängers sichtbar zu machen und zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung zellulärer Prozesse wie Homing, Expansion und Lokalisierung in verschiedenen Knochenmarknischen von hämatopoetischen Spenderzellen nach der Transplantation ermöglicht. In Kombination mit den manipulierten Tiermodellen kann dieser Ansatz bei der Definition molekularer Signalwege helfen, die für die hämatopoetische Zellregeneration entscheidend sind.

Im Gegensatz zur Histologie oder anderen bildgebenden Verfahren ermöglicht die Intravitalmikroskopie die Erfassung von Zell-zu-Zell-Interaktionen in einem lebenden Tier auf zellulärer Ebene und in Echtzeit. Wir haben uns entschieden, diese Methode zu verwenden, um festzustellen, ob die Mikroumgebung des Knochenmarks der ursprüngliche Ort der Entwicklung der myeloproliferativen Erkrankung war, die durch den Verlust des Notch-Signalwegs verursacht wurde. Zu den Herausforderungen für Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, gehören die Minimierung von Atemartefakten, die optimale Positionierung und Stabilisierung des Kopfes und die Vermeidung von Bildsättigung.

Besprühen Sie eine lysierte EGFP-Maus ein bis zwei Stunden vor der Transplantation mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie als Nächstes eine chirurgische Schere, um einen Schnitt in die Haut jedes Beins um den Knöchel zu machen, und eine chirurgische Pinzette, um die Haut und das Fell zusammen zu entfernen, um das saubere Muskelgewebe freizulegen. Entferne so viel Muskeln wie möglich aus den Beinen.

Schneiden Sie dann die Knochen an den Knie- und Sprunggelenken ab und entfernen Sie mit Mullschwämmen das restliche Muskelgewebe aus den Oberschenkelknochen und Schienbein. Spülen Sie die gereinigten Knochen in einer Sechs-Well-Platte, die DMEM enthält, das mit 10 % FBS ergänzt ist. Übertragen Sie dann alle vier Hinterbeinknochen in 10 Milliliter kaltes EDTA in PBS in einen Mörser und zerkleinern Sie die Knochen mit einem Stößel.

Zerreiben Sie die Knochenmarkzellen, um eine einzellige Suspension zu erhalten, und seihen Sie die Aufschlämmung durch einen 70-Mikron-Filter in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie den Filter mit zwei bis drei Millilitern PBS. Zentrifugieren Sie dann die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern frischem DMEM plus 10 % FBS.

Für die Injektion zentrifugieren Sie die Zellsuspension, zählen Sie dann und stellen Sie die Konzentration der Zellen auf 1,5 mal 10 bis siebte Zellen pro Milliliter in IMDM ohne Serum ein. Lege die Zellen auf Eis. Fünf bis sechs Stunden nach der zweiten Bestrahlungsdosis injizieren Sie dreimal 10 bis sechs Knochenmarkzellen in die Schwanzvene jedes bestrahlten Empfängertieres.

Fügen Sie den entsprechenden Zeitpunkt nach der Transplantation hinzu. Legen Sie die anästhesierte Empfängermaus auf ein 37 Grad Celsius heißes Heizkissen und bestätigen Sie, dass es keine Reaktion auf das Einklemmen der Zehen gibt. Tragen Sie eine Salbe auf die Augen des Tieres auf und verabreichen Sie 100 Mikroliter des entsprechenden fluoreszierenden Markers über die Schwanzvene.

Verwenden Sie anschließend eine kleine elektrische Schermaschine, um die Haare von der Rückenfläche des Kopfes des Tieres zu entfernen, gefolgt von der Anwendung einer Enthaarungscreme. Entfernen Sie die Creme nach fünf Minuten mit Mullschwämmen und spülen Sie die restliche Lösung mit Kochsalzlösung ab. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit einem mit 70 % Ethanol getränkten Wattestäbchen.

Machen Sie dann mit einer feinen Pinzette und einer Schere einen 10 bis 20 Millimeter großen Hautschnitt in der Mittellinie auf der Kopfhaut, um die darunter liegende dorsale Schädeloberfläche freizulegen. Platzieren Sie mit 5-0 chirurgischer Seide zwei Stay-Nähte auf jeder Seite des Schnitts, wodurch ein Lappen entsteht, um das Schädeldach für die Bildgebung freizulegen. Tragen Sie einen Tropfen Öl auf den freiliegenden Schädel auf.

Tauchen Sie die freiliegende Kopfhaut mit der Maus in Rückenlage in eine mit Mikroskopöl gefüllte Glasbodenschale. Legen Sie das Tier dann auf einen Multiphotonen-Bildgebungstisch mit dem Schädel über dem Objektiv und bedecken Sie das Tier mit einem 37 Grad Celsius warmen Heizkissen. Es ist wichtig, dass der Kopf während der Multiphotonen-Bildaufnahme in der richtigen Position stabilisiert bleibt.

Verwenden Sie ein stereotaktisches Gerät oder sichern Sie die Maus gegebenenfalls mit Klebeband. Mit einem invertierten konfokalen System, das für die Multiphotonen-Bildgebung modifiziert wurde, können Sie den Zwei-Photonen-Laser auf 830 Nanometer abstimmen. Öffnen Sie als Nächstes die entsprechende Bilderfassungssoftware.

Vergewissern Sie sich, dass im Menü "Aufnahmeeinstellungen" der Modus "Einseitig gerichtetes Scannen" ausgewählt ist, und stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf vier Mikrosekunden pro Pixel, die Bildrate auf 512 x 512 Pixel und den Zoom auf 1,5 Pixel ein. Wählen Sie das 20-fache Watt in einem 0,95-Objektiv. Öffne das Fenster mit der Farbstoffliste und wähle zwei Photonen aus.

Wählen Sie dann den RDM690-Spiegel im Mikroskop-Controller-Fenster aus. Aktivieren Sie im Fenster "Lichtweg und Würfel" das Kontrollkästchen "Lasereinheit zwei", um zu überprüfen, ob der Zwei-Photonen-Laserverschluss geöffnet ist. Wählen Sie EPI-Lampe und wählen Sie den B/G EPI-Filterwürfel.

Fokussieren Sie dann das Objektiv auf die Probe, um den Gefäßfluss in der Knochenmarknische des Schädeldachs zu visualisieren, wobei die Bifurkation der Zentralvene und die Koronarnaht als Referenzpunkte verwendet werden. Wählen Sie im Non-Descan-Modus drei externe Detektoren aus und bilden Sie die Probe mit einer Abtastrate von vier Mikrosekunden pro Pixel ab, ohne Mittelwertbildung und mit konstanter Laserleistung und Detektorverstärkung, um den vollen Dynamikbereich des Detektors bei minimaler Sättigung zu nutzen. Nachdem Sie eine Reihe von Schnitten durch die Tiefe des Gewebes gesammelt haben, öffnen Sie die entsprechende spezielle 3- bis 4D-Bildquantifizierungs- und Visualisierungssoftware.

Visualisieren Sie die Z-Stacks interaktiv mit dem entsprechenden 3D-Rendering-Algorithmus gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie dann das Segmentierungsmodul für Spot-Objekte, um die GFP-Zellen zu segmentieren, und wenden Sie die arithmetische Stapelverarbeitung an, um die falsch positiven GFP-Zellen im grünen und roten Kanal zu eliminieren. Verwenden Sie schließlich das Oberflächensegmentierungsmodul, um die Segmentierung des Gefäßsystems und der Knochenoberfläche zu reformieren, indem Sie Algorithmen für den X-Spannungsabstand von Punkt zu Oberfläche anwenden, um die Abstände der Zellen zu einer der distalen Oberflächen nach Bedarf zu berechnen.

Hier wurden Z-Stacks, die aus jeder der sechs Standardregionen des Knochenmark-Schädeldachs gesammelt wurden, als 3D-Projektion mit maximaler Intensität, als 3D-Schattenprojektion einschließlich der Knochenkomponente und als segmentierte 3D-Bilder gerendert, was die Quantifizierung der Zellen und die Messung ihrer Abstände vom Knochen und den Gefäßen ermöglichte. In diesem Experiment zeigte die In-vivo-Bildgebung von myeloischen Zellen in der Mikroumgebung des Kerb-defekten Knochenmarks, dass gespendete lysierte GFP-Zellen 24 Stunden nach der Transplantation bei Wildtyp- und Knockout-Empfängern eine ähnliche Homing-Effizienz aufweisen, während sie zu späteren Zeitpunkten eine unterschiedliche Transplantation aufweisen. Die Analyse der Dynamik der myeloischen Vorläuferexpansion zeigte, dass sich adaptiv Knochenmarktransplantierte Zellen bei Knockout-Empfängern zwei Wochen nach der Transplantation schneller und in größerer Zahl vermehrten.

Die gespendeten Knochenmarkzellen bei Wildtyp-Empfängern expandierten später, aber in doppelt so hohen Zahlen wie die Spenderzellen und Knockout-Empfänger nach vier Wochen, einer Zeit, in der die Spenderzellen im Knockout-Knochenmark abgenommen haben, weil es schnell in den Kreislauf gelangt. Und dass sich nach sechs Wochen die Unterschiede in der Anzahl der Spenderzellen im Schädeldach des Knochenmarks ausgleichen. Darüber hinaus zeigt die 3D-Segmentierungsanalyse der unteren mittleren Region der Knockout- und Wildtyp-Kalvaria sechs Wochen nach der Knochenmarktransplantation, dass die lysierten GFP-Zellen bei beiden Arten von Empfängertieren in gleichem Abstand vom Knochen lokalisiert waren, aber interessanterweise bei den Knockout-Mäusen weiter vom Gefäßsystem entfernt waren.

Einmal gemeistert, kann die intravitale Knochenmarkbildgebung bei richtiger Durchführung in einer Stunde und 30 Minuten pro Maus abgeschlossen werden. Bei der Verwendung dieses Ansatzes ist es wichtig, daran zu denken, mehrere Bereiche des Knochenmarks des Schädeldachs pro Maus zu beproben und mindestens drei Mäuse pro Experiment zu analysieren, um etwaige Schwankungen innerhalb und zwischen den Proben zu berücksichtigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Knochenmarktransplantation und die intravitale Bildgebung kombinieren können, um die Kinetik der Transplantation einer bestimmten Blutsubpopulation in die Mikroumgebung des Knochenmarks zu bestimmen.