Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen
12. August 2016
Monozyten sind integrale Bestandteile des menschlichen angeborenen Immunsystems, die auf den glykolytischen Stoffwechsel angewiesen sind, wenn sie aktiviert werden. Wir beschreiben ein durchflusszytometrisches Protokoll zur Messung der Glukosetransporterexpression und der Glukoseaufnahme durch Gesamtmonozyten und Monozyten-Subpopulationen in frischem Vollblut.
Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die Aufnahme von Glukose und ihrem Transporter in verschiedenen Monozyten-Subpopulationen zu messen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, wie z. B. Welche Bedeutung hat der Stoffwechsel von Immunzellen für den Krankheitsverlauf? Die Hauptvorteile dieser Techniken sind, dass sie schnell und einfach durchzuführen sind, kein reaktives Material benötigen und nur ein kleines Blutvolumen benötigen.
Geben Sie die Blutproben innerhalb einer Stunde nach der Entnahme in Citrat-ACD-B-Antikoagulanzienröhrchen in eine biologische Sicherheitswerkbank. Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter Blut aus jeder Probe in einzelne Polypropylenröhrchen und behandeln Sie die Zellen mit zwei Millilitern 1X Lysinglösung auf Eis, indem Sie vorsichtig pipettieren, um sie zu mischen. Nach 15 Minuten zentrifugieren Sie die Zellen und folgen mit zwei weiteren Umdrehungen in Waschpuffer
.Entfernen Sie nach dem zweiten Waschen vorsichtig mit einer Pipette so viel wie möglich von den Überständen und suspendieren Sie die Pellets wieder in 100 Mikrolitern Waschpuffer auf Eis. Um die spezifischen Monozyten-Subpopulationen zu identifizieren, färben Sie die Zellen mit fünf Mikrolitern der entsprechenden Antikörper pro 100 Mikroliter Zellen 30 Minuten lang auf Eis im Dunkeln. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben zweimal in Waschlösung und fixieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 0,5% Formaldehyd in PBS.
Analysieren Sie dann die Zellen innerhalb von 24 Stunden mit einem Durchflusszytometer, das vier Farben erkennen kann. Um die Glukoseaufnahme der Monozyten-Subpopulationen zu beurteilen, überführen Sie 90 Mikroliter Blut aus jeder Probe in einzelne Polypropylenröhrchen und fügen Sie dem Blut 10 Mikroliter des fluoreszierenden Glukoseanalogons von Interesse hinzu. Schnippen Sie vorsichtig mit den Röhrchen, um sie zu mischen, und decken Sie die Proben mit Alufolie ab.
Dann werden die Zellen 15 bis 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius gelagert, gefolgt von ihrer sofortigen Überführung in Eis. Geben Sie anschließend vier Milliliter FACS-Lyselösung in die Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen. Führen Sie dann eine zweite Zentrifugation im Waschpuffer durch.
Dekantieren Sie den Überstand und färben Sie die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln mit den entsprechenden Antikörpern. Waschen Sie dann die Proben in vier Millilitern eiskaltem Waschpuffer, suspendieren Sie die Pellets wieder in 200 bis 300 Mikroliter eiskaltem PBS und analysieren Sie die Röhrchen innerhalb von 10 Minuten. Für die durchflusszytometrische Analyse verwenden Sie zunächst die ungefärbten und einzeln gefärbten Kontrollproben, um die Kompensation einzustellen.
Öffnen Sie anschließend in der entsprechenden Einzelzellanalysesoftware die erste Probe in einem Vorwärts-nach-Seite-Streudiagramm und störn Sie die Monozyten wie dargestellt. Doppelklicken Sie dann auf die abgegrenzte Monozytenpopulation, und gaten Sie die CD3-negative Population. Doppelklicken Sie nun auf die CD3-negative Population und stellen Sie die x-Achse so ein, dass die CD14-Färbung angezeigt wird, und die y-Achse, um die CD16-Färbung anzuzeigen.
Um die Aufnahme von Glukose oder deren Transporter in einer bestimmten Monozyten-Subpopulation zu messen, erstellen Sie die entsprechenden Histogramme. Wenn definierte Zellpopulationen vorhanden sind, verwenden Sie dann die FITC-IgG-Kontrollproben, um das Gate festzulegen und den Gesamtprozentsatz der CD14-positiven Monozyten in jeder Probe zu bestimmen. Hier wird die initiale Gating-Strategie zur Isolierung der Monozyten durch Zellstreuung und T-Zell-Ausschluss durch Gating innerhalb der CD3-negativen Population gezeigt.
Die Monozyten werden dann für die CD14-Expression allein oder in Kombination mit CD16 gegated, um die Gesamtmonozyten oder Monozyten-Subpopulationen zu identifizieren. Unterschiedliche Populationen von CD14-positiven Glut-1-Glukosetransporter-positiven Monozyten können beobachtet werden, vor allem in den zirkulierenden weißen Blutkörperchen, die von HIV-positiven Personen gewonnen wurden. CD14-positive Glut-1-positive Zellen können auch in spezifischen Monozyten-Untergruppen bei HIV-nicht infizierten Personen beobachtet werden, obwohl diese Populationen bei HIV-positiven Patienten stärker ausgeprägt sind.
Wie aus den Glukosetransporter-Expressionsdaten zu erwarten ist, wird auch das Glukoseanalogon 2-NBDG in höheren Mengen von Zellen von HIV-positiven Personen aufgenommen. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von eineinhalb Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Lichteinwirkung auf alle Bereiche zu begrenzen.
Nach der Aufnahme von Glukoseanaloga können Zellen mit Antikörpern auf der Zelloberfläche gefärbt werden, um bestimmte Immunpopulationen zu identifizieren, an denen Sie interessiert sind. Nach ihrer Entwicklung kann diese Methode verwendet werden, um zu bestimmen, wie HIV den Stoffwechsel von Immunzellen beeinflusst, und kann auch von anderen Forschern in verschiedenen Bereichen wie Immunologie, Virologie und Krebsforschung erforscht werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Glukosetransporter eins und die Glukoseaufnahme in Immunzellen nachweisen können.
Vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit Infektionserregern die üblichen Sicherheitsverfahren angewendet werden sollten.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Durchflusszytometrie-Protokoll zur Messung der Glucosetransporter-Expression und des Glucoseaufnahmevermögens in Monozyten vor, die wichtige Bestandteile des angeborenen Immunsystems darstellen. Die Methode ermöglicht die Analyse von Monozyten-Subpopulationen in frischem Vollblut und liefert Erkenntnisse zum Stoffwechsel der Immunzellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Zellstoffwechsel
- Durchflusszytometrie
Hintergrund
- Monocyten spielen eine entscheidende Rolle bei der menschlichen Immunantwort.
- Die glykolytische Stoffwechselaktivität ist für aktivierte Monozyten unerlässlich.
- Das Verständnis der Glukoseaufnahme kann Aufschluss über Krankheitsverläufe geben.
- Mittels Durchflusszytometrie ist eine detaillierte Analyse von Immunzellen möglich.
Zweck der Studie
- Um die Glukoseaufnahme in Monocyten-Subpopulationen zu messen.
- Um die Rolle des Stoffwechsels von Immunzellen bei Krankheiten zu untersuchen.
- Um eine schnelle und effiziente Methode für die Analyse bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Entnahme von Blutproben in Zitrat-ACD-B-Antikoagulanzienröhrchen.
- Behandlung der Zellen mit einer Lyse-Lösung auf Eis.
- Zentrifugation und Waschen der Zellen zur Analyse.
- Durchflusszytometrie zur Messung der Glukosetransporter-Expression.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Messung der Glukoseaufnahme in Monozyten.
- Identifizierung von Unterschieden in der Expression von Glukosetransportern.
- Erkenntnisse über Stoffwechselwege bei Immunantworten.
- Nachweis der Effizienz und Benutzerfreundlichkeit der Methode.
Schlussfolgerungen
- Die Methode liefert wertvolle Daten zum Stoffwechsel von Monozyten.
- Das Verständnis der Glukoseaufnahme kann bei der Krankheitsforschung helfen.
- Dieses Protokoll kann auf verschiedene immunologische Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine schnelle Beurteilung der metabolischen Neuprogrammierung von Monozyten in Vollblut und unterstützt die Zielvalidierung in der Immunmetabolismus- und Entzündungsforschung. Durch die Quantifizierung der Glukoseaufnahme und der Transporterexpression in verschiedenen Monozyt-Subpopulationen liefert sie mechanistische Entlastung für therapeutische Hypothesen, die den Stoffwechsel immunologischer Zellen mit Krankheitsverläufen verknüpfen. Der Arbeitsablauf erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er die funktionelle Validierung glykolytischer Verschiebungen in primären humanen Zellen ohne ex-vivo-Manipulation ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die funktionelle Glukoseaufnahme in Monozyt-Subpopulationen während der Homöostase und unter entzündlichen Bedingungen gemessen wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht die biologische Entlastung von Zielstrukturen, die an immunmetabolischen Wegen beteiligt sind, mithilfe primärer humaner Monozyten aus Vollblut.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem die Expression von Glukosetransportern (z. B. Glut-1) mit Krankheitszuständen wie einer HIV-Infektion korreliert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte Monozyten-Subpopulationen für die nachgeschaltete Untersuchung vor, indem Baseline-Werte des Glukoseaufnahmevermögens bei Gesundheit und Krankheit etabliert werden.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt durchflusszytometrische Histogramme der 2-NBDG-Aufnahme und der Oberflächenmarkerdarstellung für standardisierte, reproduzierbare Messungen.
- Skalierbarkeit: Verwendet geringe Blutvolumina und die übliche Durchflusszytometrie-Ausstattung, wodurch eine Hochdurchsatz-Anpassung über verschiedene Spenderkohorten hinweg ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckung und präklinische Validierung, indem glykolytische Verschiebungen in Monozyten über verschiedene Krankheitsmodelle und therapeutische Interventionen hinweg überwacht werden.
- Biomarker-Korrelation: Unterstützt die Identifizierung metabolischer Biomarker (z. B. CD14+/Glut-1+ Monozyten), die mit trainierter Immunität und chronischer Entzündung assoziiert sind.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Leitet Go/No-Go-Kriterien ab, indem metabolische Aktivierungszustände quantifiziert werden, die funktionelle Immunantworten vorhersagen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Evaluation ein und ermöglicht die metabolische Phänotypisierung primärer humaner Immunzellen in frühen Stadien.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung immunometabolischer Mechanismen durch Isolierung und Quantifizierung der Glukoseaufnahme in definierten Monozyten-Subpopulationen (klassisch, intermediär, nicht-klassisch).
- Screening: Liefert betriebsfertige, reproduzierbare Messgrößen zur glykolytischen Aktivität mittels Aufnahme eines fluoreszierenden Glukose-Analogons, standardisiert über verschiedene Proben hinweg.
- Analytik: Bietet quantitative Durchflusszytometrie-Messgrößen (Prozentsatz der Aufnahme, mittlere Fluoreszenzintensität), die den Vergleich metabolischer Zustände zwischen unterschiedlichen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht den Anschluss an präklinische Arbeiten, indem metabolische Veränderungen von Monozyten verfolgt werden, die mit dem Fortschreiten entzündlicher Erkrankungen korrelieren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur immunmetabolischen Profilierung, die auf verschiedene Leukozyten-Typen und Krankheitskontexte anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen in der Immunometabolik, indem die Expression von Glukosetransportern mit dem funktionellen Aufnahmeverhalten in primären humanen Monozyten verknüpft wird.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Färbeprotokolle, Gating- und Analyseverfahren unter Verwendung gängiger Durchflusszytometrie-Ausrüstung.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem eine frühe metabolische Validierung von Zielstrukturen ermöglicht wird, wodurch das Risiko von Fehlschlägen in fortgeschrittenen Phasen immunologischer und virologischer Programme reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen oder Biologika basierend auf deren Auswirkungen auf den glykolytischen Fluss und die Immunaktivierung in Monozyten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kompensation der mehrfarbigen Durchflusszytometrie und in Strategien zur Gating von Monozyten-Subpopulationen.
- Setzt den Zugang zu einem 4-Farben-Durchflusszytometer und einem biologischen Sicherheitswerkbank für die Blutverarbeitung voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Färbeprotokolle und der ischämischen Zeiten über verschiedene Standorte hinweg bei multizentrischen Studien.
- Die Anpassung an andere Leukozyten-Subpopulationen erfordert die Validierung von Markerpanelen und der Kinetik der Glucose-Analog-Aufnahme.
- Eingeschränkt durch das Stabilitätsfenster von 24 Stunden für fixierte Proben und die Notwendigkeit einer zügigen Verarbeitung nach der Probennahme.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Monocyte and Monocyte Subpopulation Glucose Transporter 1 (Glut1) Cell Surface Detection
2:07
Monocyte Glucose Uptake Analysis
3:11
Data Acquisition and Analysis
4:16
Results: Representative Monocyte Subpopulation Glucose Uptake Analysis
5:22
Conclusion
