Name: In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Lernen Sie In-vitro-Transkriptionsassays zur Untersuchung regulatorischer Schritte bei der Transkription. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung von Transkriptionsprodukten auf einem RNA-Sequenzierungsgel.

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Diese Arbeit würdigt ein Faculty Early Career Grant der University of Newcastle (CM).

Achtung: Die Experimente umfassen die Verwendung des radioaktiven Isotops 32 P und keine Arbeit sollte , bis alle entsprechenden Sicherheitsbedingungen erfüllt sind durchgeführt werden. Im Allgemeinen Personal sind verpflichtet, einen Sicherheitskurs zu besuchen und überwachten Praxis vor den Experimenten mit radioaktiven Reagenzien unterzogen werden. Bitte tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (Thermolumineszenzdosimeter, Schutzbrille, Handschuhe, Bestrahlungsraum Kitteln, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe), wenn die Reaktion durchgeführt wird. 1. Herstellung von Assay Materials <ol><li> Besorgen Sie sich die Proteine ​​Erforderlich für die Transcription-Test. <ol><li> Für die hier beschriebenen Experiment, überproduzieren und E. reinigen coli RNAP im Labor als 11 beschrieben, oder erhalten aus einer kommerziellen Quelle (Materialliste). Hinweis: Beide ähnliche Ergebnisse liefern. Andere Verfahren zur Reinigung von nativen oder Affinität markierten RNAP kann auch 12,13 verwendet werden. Sigma / NusA Faktoren können als d erhalten werdenescribed 14,15 in früheren Arbeiten. </li></ol></li><li> Herstellung von Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser Hinweis: Alternativ RNase-freies Wasser kann aus kommerziellen Quellen (Materialliste) erhalten werden. <ol><li> 1 ml Diethylpyrocarbonat (DEPC) auf 1 l gereinigtem Wasser (0,1% v / v) und über Nacht mischen. </li><li> Autoklav DEPC Wasser und Tipps zweimal. </li></ol></li><li> DNA-Vorlage Vorbereitung <ol><li> Reinige Plasmid pSG1154 16 und / oder pIA226 17 ein Plasmid - Reinigungskits (Materialliste) unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Um die Vorlage für Run-off - Transkriptionsassays (ein 360 - bp - Fragment umfasst den P xyl - Promotor - Region) zu verstärken, bauen sie zusammen eine PCR - Reaktion auf Eis mit 25 ul 2x PCR - Mix (Materialliste), 2 ul jeweils der Primer (5 uM) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(vorwärts) und 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (rückwärts), 1 ul pSG1154 Plasmid preparation (250 &amp; mgr; M) und 20 &amp; mgr; l gereinigtes Wasser). <ol><li> Oder alternativ, für einzelne Runde Transkriptionsassays, verstärken , um eine 447 - bp - Fragment umfasst die λ P R - Promotorregion von pIA226 17. Richten Sie eine PCR-Reaktion auf Eis unter Verwendung von 25 &amp; mgr; l 2x PCR-Mix, 2 &amp; mgr; l von jedem der Primer (5 uM): 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(vorwärts) und 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (rückwärts), 1 ul pIA226 17 Plasmidpräparation (250 &amp; mgr; M) und 20 &amp; mgr; l gereinigtes Wasser). Hinweis: Diese Vorlage Cytosin , bis die 26 nt - Position fehlt, die das 26. Nukleotid von der Transkriptionsstartstelle ist. Daher Transkription unter Verwendung dieser Vorlage Initiierung ermöglichen, Promoter-Clearance und Abwürgen am +26 nt eine stabile Transkriptionselongation-Komplex (EG) zu bilden, wenn nur ATP, UTP und GTP in der Reaktion vorhanden sind. </li></ol></li><li> Stellen Sie eine PCR-Reaktion mit den folgenden Bedingungen auf: 95 °; C für 30 sec, 50 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 sec, 30 Zyklen wiederholen. </li><li> Reinige das Produkt einer PCR Clean-up Kit (Materialliste) gemäß den Anweisungen des Herstellers und eluieren in 100 &amp; mgr; l Transkriptionspuffer für den Transkriptionsassay. </li><li> Bestimmen Sie die Template-DNA-Konzentration unter Verwendung eines Fluorospektrometer (Materialliste). </li></ol></li><li> NTP Vorbereitung Hinweis: NTPs können aus verschiedenen kommerziellen Quellen (Materialliste) erhalten werden. <ol><li> Man löst NTPs (≥99% rein) in DEPC-behandeltem Wasser zum 1 M Lager, aliquoten 1 ml der Lösung in 1,5-ml-Röhrchen (50 &amp; mgr; l in jedes Röhrchen) und bei -20 ° C. </li><li> Um α- 32 P - UTP (3000 Ci / mmol) vor dem Experiment. 32 P hat eine kurze Halbwertszeit von 14,29 Tage. Hinweis: Die Verwendung alpha-markiertem UTP vermeidet die Intensität der Bänder mit unterschiedlicher Länge zu vergleichen. </li></ol></li><li> RNA Ladder Vorbereitung <ol><li> Bauen Sie die Folgeing Reaktion bei Raumtemperatur: 0,5 &amp; mgr; g RNA - Matrize Mix (Materialliste), 80 mM HEPES - Puffer pH 7,5, 12 mM MgCl 2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, 0,5 mM UTP, 2 ul a- 32 P UTP, 0,5 ul T7 RNAP (Materialliste), Wasser auf 20 &amp; mgr; l DEPC-behandelt. </li><li> Erlauben Reaktion bei 37 ° C für 1 Stunde fortschreiten. Verwenden Sie sofort oder lagern bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von RNA-Sequencing Gel <ol><li> Gelzubereitung <ol><li> Reinigen Sie die Platten aus einer Sequenzierungs Gelapparatur (Materialliste) zweimal mit 70% Ethanol und gereinigtem Wasser, und montieren Sie die Zelle mit einem Kamm und zwei Abstandshalter. Hinweis: Eine Platte kann mit Silizierverfahren Reagenz (Materialliste) beschichtet werden, um Gelentfernung in Schritt 4.2 erleichtern. </li><li> Man löst 33,6 g Harnstoff in 22 ml Wasser und 16,4 ml 5x Tris / Borat / EDTA (TBE) -Puffer (54 g Tris (hydroxymethyl) aminomethan, 27,5 g Borsäure, 10 ml 1 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 7,4 in 1 l Wasser) mit einem Magnetrührer. </li><li> 16 ml von 40% Acrylamid / Bisacrylamid-Lösung (19: 1) zu der Harnstofflösung und filtriert durch ein 0,45 um-Filter. </li><li> Hinzufügen , 514 &amp; mgr; l 10% (w / v) frisch hergestelltem Ammoniumpersulfat in Wasser , gefolgt von 51,4 ​​ul N, N, N &#39;, N&#39; N&#39; - Tetramethylethylendiamin (TEMED) zu der filtrierten Lösung. </li><li> invertieren vorsichtig die Gel-Lösung zu einer übermäßigen Belüftung vermeiden und injizieren sofort und nahtlos in die horizontal positioniert abgepackten Sequenzierung Zelle aus dem unteren Einspritzloch. Achten Sie darauf, machen Blasen während der Injektion zu vermeiden. </li><li> Lassen Sie 1-1,5 h, bis das Gel vollständig vor der Verwendung in einer Transkription Assay eingestellt ist. Das Gel kann für zwei oder drei Tage bei Raumtemperatur gelagert werden, wenn sie mit wasserfeuchten Gewebe auf der Oberseite der Sequenzierungs Zelle gewickelt. </li></ol></li></ol> 3. Transkriptionsreaktion <ol><li> Transkriptionselongation Pausieren Assay <ol><li> Die Bildung eines Transkriptions Elongationskomplexes <ol><li> 1 ul RNAP Core-Enzym (1 uM Lager in Transkriptionspuffer) in ein 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> 1 &amp; mgr; l gereinigtem Sigma-70 - Faktor (σ 70; 3 &amp; mgr; M Lager in Transkriptionspuffer) an die RNAP und Inkubation auf Eis für 10 min RNAP Holoenzym zu bilden. </li><li> Werden 3 ul 500 nM gereinigtem Templat - DNA (λ P R Promotor aus dem pIA226 PCR - Produkt) in Transkriptionspuffer zum RNAP Holoenzym und Inkubieren bei 37 ºC für 5 min die offene Komplex zu bilden. </li><li> Bereiten einer Mischung von Reaktionskomponenten in einem anderen 1,5 ml - Röhrchen unter Verwendung von 5 ul 10fach Transkriptionspuffer (Materialliste: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCl, 100 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 50% Glycerin, pH 7,9 in DEPC behandeltem Wasser), 2 ul 250 uM jedes GTP und UTP, 1 ul 1 mM ATP und 1 ul α- 32 P - UTP (3000 Ci / mmol). In DEPC behandeltem Wasser auf 41 &amp; mgr; l. Neinte: RNase-Inhibitor (Materialliste) kann verwendet werden, um die RNase Kontamination zu minimieren. </li><li> Übertragen Sie die Mischlösung in das Röhrchen des offenen Komplex enthält, und Inkubation bei 37 ° C für 15 min die Transkriptionselongation Komplex zu bilden nt bei +26 gestoppt. </li><li> Bewegen, um die Reaktion auf Raumtemperatur (~ 21 ° C) und füge 1 ul von 2,5 mg / ml Rifampicin zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml. </li><li> 1 ul 0,1 mM NusA dem Reaktionsgemisch gereinigt und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen 2 ul 250 uM CTP in das Reaktionsgemisch ein Endvolumen von 50 ul und zu messen, die Reaktionszeit mit Hilfe eines Timers zu machen. </li><li> Transfer 5 ul der Reaktionslösung in 2 ul Gelladepuffer RNA (95% Formamid, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylencyanol) bei 30, 60, 120, 240, 480 und 1.200 sec die Reaktion zu quenchen. </li><li> Entsorgen Sie die 32 P - UTP - Tipps und Rohre in einem radioaktiven Abfällen Fortsetzungainer. </li></ol></li></ol></li><li> Der Transkriptionsinitiations Assay <ol><li> Die Bildung des Open-Komplex <ol><li> Verdünnter gereinigter σ 70-0,5 uM. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1.1 bis 3.1.1.3 unter Verwendung von 0,5 uM (anstelle von 3 uM) gereinigt σ 70 und die DNA - Matrize (die P xyl - Promotor - Region von pSG1154 PCR - Produkt). </li></ol></li><li> Hemmung der Transkriptionsinitiations Assay <ol><li> Fügen den Inhibitor entwickelt , um RNAP Holoenzym Bildung RNAP Kern Enzym vor der Zugabe von σ 70 (nach Schritt 3.1.1.1), gefolgt von den Schritten 3.1.1.2 und 3.1.1.3 verhindern , zu untersuchen , ob der Inhibitor der Lage ist , Holoenzym Bildung zu stören. </li><li> Alternativ kann nach Schritt 3.1.1.2, fügen Sie den Inhibitor zu prüfen , ob es in der Lage ist zu wettbewerbsfähigen σ 70 hemmen zu RNAP Bindung. </li><li> Verwenden, um die gleiche Menge an DMSO, das Lösungsmittel des Inhibitors, anstelle des Inhibitors stock in Kontrollreaktionen. </li></ol></li><li> Beendigung der Reaktion <ol><li> Man löst Heparin in Wasser zu einer Stammkonzentration von 1 mg / ml und Lager bei -20 ° C. Hinweis: Heparin ist ein Konkurrent von DNA, die RNAP absondern können, die keinen offenen Komplex gebildet hat. Sobald der offenen Komplex gebildet wird, Heparin kann die DNA-Bindungsstelle von RNAP nicht eingeben und hemmen die Transkription von vorgeformten offenen Komplex. Daher wird Heparin nur für Single-Runde Tests erforderlich; es ist nicht für Multi-Runde Assays benötigt. </li><li> Bereiten Sie die Reaktionsmischung unter Verwendung von 5 ul 10fach Transkriptionspuffer (Materialliste), 1 ul 1 mg / ml Heparinlösung, 1 ul 10 mM jeweils ATP, GTP und CTP, 2,5 mM UTP, und 1 ul 32 α- P UTP (3000 Ci / mmol). In DEPC behandeltem Wasser auf 45 &amp; mgr; l. </li><li> Mischen Sie das Reaktionsgemisch mit der Transkription offenen Komplex, Puls Spin und Inkubation bei 37 ° C für 20 min. </li><li> Übertragung von 10 ul der Reaktions sosung in 5 ul Gelladepuffer RNA (95% Formamid, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylencyanol), um die Reaktion zu quenchen. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. RNA-Gel-Lauf und Entwicklung <ol><li> Das Ausführen des denaturierendes Polyacrylamidgel <ol><li> Laufen um das Gel bei 50 ºC und 50 W in 1x TBE-Puffer für etwa 1,5 Stunden, bis die Temperatur des Gels und der Puffer bei 50 ºC stabil. </li><li> Wärme Proben bei 90 ° C für 30 Sekunden und sie auf Eis auf das Gel vor Belastung zu bewegen. </li><li> Laden Sie die Proben in die Vertiefungen auf der Oberseite des Gels neben einer Spur, die 2 &amp; mgr; l RNA-Leiter (1: 100 Verdünnung). </li><li> Führen Sie das Gel bei 50 W und 50 ºC in 1x TBE-Puffer, bis der Bromphenolblau-Farbstoff erreicht ~ 03.02 durch das Gel. </li></ol></li><li> Gel-Behandlung <ol><li> Öffnen Sie langsam und vorsichtig trennen die obere Platte aus der Sequenzierung Zelle. Achten Sie besonders darauf, das Gel zu brechen zu vermeiden. </li><li> Cut chromatography Papier (Materialliste) von oben nach Bromphenolblau Farbstoff die Gelgröße übereinstimmen. Verwenden Sie einen Geigerzähler die ungefähre Position von radioaktiv markierten RNA-Transkripte zu bestätigen. </li><li> Deckel vorsichtig das Gel mit dem Filterpapier, und drücken Sie sie fest, bis das Gel auf das Filterpapier haftet. Abgeschnitten und die Unterseite des Gels zu radioaktivem Abfall entsorgen, da die nicht eingebauten NTPs an der Unterseite des Gels laufen, die sehr heiß werden kann. </li><li> Legen Sie ein ähnlich großes Stück Filterpapier auf dem Trockenbett eines Vakuum-Trocknungsmaschine und sorgfältig legen Sie das Gel beschichteten Papier auf sie mit dem Gel Seite nach oben. </li><li> Decken Sie das Gel mit einer Plastikfolie und trocken bei 60 ° C für 1,5 Std. </li><li> Wickeln Sie die andere Seite des Gels beschichteten Filterpapier mit Plastikverpackung, und legen Sie auf einer photostimulierbaren Phosphorplatte im Abbildungs ​​Fall mit dem entsprechenden Belichtungszeit, die von 1 Stunde variieren kann über Nacht in Abhängigkeit von der Reaktionseffizienz. </li><li> Bild der Leuchtstoffplatte mitImager Abtaster nach den Anweisungen des Herstellers. Zur Ermittlung der relativen Bandenintensität mit ImageJ Software entsprechend dem Software-Handbuch. </li><li> Verwenden Sie einen Geigerzähler die radioaktive Kontamination im Arbeitsbereich zu überprüfen, reinigen Sie die vermuteten Elemente und Bereich mit Gewebe und Reinigungsmittel und entsorgen das Gewebe in dem Entsorgungsbehälter. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In allen Organismen ist die Transkription eines stark regulierten Prozess. In vitro Transkriptionsassays eine Plattform zum Testen der Wirkung von Transkriptionsfaktoren, kleine Moleküle und Transkriptionsinhibitoren bereitzustellen , wurden entwickelt. Bei diesem Verfahren wird Papier, wurde ein Test für die allgemeine bakterielle Transkriptions beschrieben. Transkriptionsassays mit Sequenzierung Gelelektrophorese von Transkripten kombiniert sind sehr wichtig für mechanistische Studien, wie sie Visualisierung ...

Transcription ist der Prozess, in dem RNA von einer spezifischen DNA-Matrize synthetisiert wird. In eukaryotischen Zellen gibt drei verschiedene RNAPs sind: RNAP I transkribiert rRNA Vorläufern ist RNAP II verantwortlich für die Synthese von mRNA und bestimmte kleine nukleare RNAs, und die Synthese von 5S-rRNA und tRNA wird durch RNAP III durchgeführt. In Bakterien, gibt es nur eine RNAP, die für die Transkription aller Klassen von RNA. Es gibt drei Stufen der Transkription: Initiation, Elongation und Termination. Transcription ist eine der am stärksten regulierten Vorgänge in der Zelle. Jede Stufe in der Transkriptionszyklus stellt einen Prüfpunkt für die Regulation der Genexpression 1. Zur Initiierung hat RNAP mit einem Sigma - Faktor zu assoziieren Holoenzym zu bilden, die das Enzym an spezifische Stellen Promotoren genannt 2 zu leiten erforderlich einen offenen Promotorkomplex zu bilden. Anschließend werden eine große Suite von Transkriptionsfaktoren, die für die Regulierung of RNAP Aktivitäten während der Verlängerung und Beendigung Phasen. Der Transkriptionsfaktor hier untersucht ist die hoch konserviert und essentielles Protein, NusA. Es wird bei der Regulierung der Transkription Pausieren und Beendigung, sowie Anti-Abbruch bei rRNA Synthese 3-5 beteiligt. In - vitro - Transkriptionsassays wurden als leistungsstarke Werkzeuge zur Untersuchung der komplexen regulatorischen Schritte während der Transkription 6 entwickelt. Im allgemeinen wird ein lineares Fragment von DNA, die eine Promotorregion wird als Matrize für die Transkription erforderlich. Die DNA-Matrize wird gewöhnlich erzeugt durch PCR oder durch ein Plasmid linearisieren. Gereinigte Proteine ​​und NTPs (einschließlich eines radioaktiv markierten NTP für Detektionszwecke) werden dann zugegeben und Produkt nach der erforderlichen Inkubationszeit analysiert. Unter Verwendung geeigneter Vorlagen und Reaktionsbedingungen, alle Stufen der Transkription wurden mit diesem Ansatz untersucht, die detaillierte molekulare Charakterisierung von transcr ermöglicht hat,iption im letzten halben Jahrhundert 7. In Kombination mit Informationen über die 3-dimensionale Struktur von RNAP ist es auch möglich, den molekularen Mechanismus der Transkriptionshemmung durch Antibiotika und Antibiotika führt zu untersuchen, und diese Informationen in der Entwicklung neuer, verbesserter Arzneimittel 8-10. In dieser Arbeit stellen wir Beispiele für Transkriptionsassays verwendet werden können, um den Mechanismus der Regulierung von Transkription Expansions- / Terminationsfaktor NusA, und wie die Wirkungsweise eines neuartigen Transkriptionsinitiationsinhibitor führen zu bestimmen, bestimmt werden.

<table><tbody><tr><td>Gewinnung der für den Transkriptionsassay</td><td></td><td></td><td></td> erforderlichen</tr> <tr><td>ProteineE. coli RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>Herstellung von DEPC-behandeltem</td> Wasserdiethylpyrocarbonat <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(DEPC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNasefreies Wasser&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nukleasefreies Wasser</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Assistent zur Vorbereitung</td><td></td><td></td><td></td>von DNA-Templates</tr><tr><td>&nbsp; Plus&nbsp;SV Minipreps DNA-Aufreinigungssystem,</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Primer,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel und PCR-Clean-Up System&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 Fluorspektrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Vorbereitung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>rNTPs mit hoher Reinheit</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-32P UTP&nbsp;</td><td>PerkinElmer&nbsp; &nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td> Vorbereitung der RNA-Leiter für <td>radioaktive Verbindungen</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&ndash; 1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Gelvorbereitung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT Nukleinsäure-Sequenzierungszelle &nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp; &nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>154563</tr><tr><td>Borsäure&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamid/Bis-Acrylamid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Transkriptionsassay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Formamid&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Xylol-Cyanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>Heparin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin-Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Transkriptionspuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DVB-Ton &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; 3MM Chr Chromatographie Papier</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Radioaktives Dekontaminationsmittel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon</td><td>Decon90</td><td></td></tr><tr><td>Gel Treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio+ Imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in - vitro - transkriptionsassays und ihre anwendung in der drug discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In - vitro - Transkriptionstests wurden seit vielen Jahren zur Untersuchung der molekularen Mechanismen , die in Transkriptions entwickelt und weit verbreitet. Dieses Verfahren erfordert Multi-Untereinheiten-DNA-abhängige RNA-Polymerase (RNAP), und eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, die die Aktivität von RNAP während Genexpression zu modulieren wirken. Sequencing-Gelelektrophorese von radiomarkiertem Transkripte wird verwendet, auf detaillierte mechanistische Informationen zu geben, wie die Transkription und welche Parameter können sie beeinflussen. In diesem Dokument beschreiben wir das Protokoll zu untersuchen, wie die wesentliche Elongationsfaktor NusA Transkriptions Pausieren regelt, sowie ein Verfahren, ein antibakterielles Mittel Targeting Transkriptionsinitiations durch Hemmung der RNAP Holoenzym Bildung zu identifizieren. Diese Verfahren können als eine Plattform für die Entwicklung von zusätzlichen Ansätze verwendet werden, um den Wirkungsmechanismus der Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die noch unklar bleiben, sowie neue antibakterielle agents Targeting Transkription, die ein nicht ausgelastete Medikament Ziel in der Antibiotika-Forschung und Entwicklung ist.

Transkriptionseffizienz kann durch Messen der Strahlungspegel in den Frequenzbändern zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt werden. Die Pause - Test die Funktion NusA Faktor aktiviert Visualisierung der Pause, Abbruch zu testen und Run-off - Produkte (1A). In der Gegenwart des N-terminalen Domäne von NusA (NusA NTD; Aminosäurereste 1-137), Aussehen der RNA-Produkte war signifikant im Vergleich zu dem Kontrollversuch verzögert fehlt NusA. Deletion der Aminosäurereste 104-1...

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur funktionellen Untersuchung der Transkription und der inhibitorischen Aktivität von antibakteriellen Wirkstoffen, die auf die bakterielle Transkription abzielen.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Das übergeordnete Ziel dieses In-vitro-Transkriptionsassays besteht darin, die komplexen regulatorischen Schritte während der Transkription zu untersuchen, indem eine Plattform bereitgestellt wird, um die Wirkungen von Transkriptionsfaktoren, kleinen Molekülen und Transkriptionsinhibitoren zu testen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Molekularbiologie zu beantworten, beispielsweise die genauen Mechanismen, die mit der Transkriptionsregulation verbunden sind, die Funktion von Transkriptionsfaktoren mit unbekannten Wirkmechanismen sowie die Effekte herkömmlicher Transkriptionsinhibitoren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine direkte Visualisierung aller Transkriptionsprodukte entlang einer Zeitachse anhand eines einzelnen RNA-Sequenzierungsgelels ermöglicht.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Platten einer Sequenziergelelektrophoreseapparatur zweimal mit 70 %igem Ethanol und gereinigtem Wasser reinigen. Bauen Sie die Zelle mit einem Kamm und zwei Abstandshaltern zusammen. Lösen Sie 33,6 Gramm Harnstoff in 22 Milliliter Wasser und 16,4 Milliliter fünfmal konzentrierter TBE-Pufferlösung unter Verwendung eines Magnetrührers auf.Geben Sie 16 Mi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir entwickelten eine quantitative DNA-bindenden, ELISA-basierten Assay Transkriptionsfaktor-Interaktionen mit DNA zu messen. Hohe Spezifität für das RUNX2 Protein wurde mit einer Consensus-DNA-Oligonukleotid und Erkennung spezifischer monoklonaler Antikörper erreicht. Kolorimetrischen Nachweis mit einem Enzym-gekoppelten Antikörper Substrat-Reaktion wurde in Echtzeit überwacht.

Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

Gallium (III) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole und seine Freebase analogen aufweisen niedrigen mikromolaren Zell-Zytotoxizität. Diese Handschrift beschreibt ein RNA-Transkriptionsreaktion, Imaging-RNA mit einem Ethidiumbromid-gefärbten Gel und Quantifizierung RNA mit UV-Vis-Spektroskopie, um die Transkription Hemmung durch Corrolen bewerten und zeigt eine einfache Methode zur Bewertung Krebskandidat Eigenschaften.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Enzymatic Assay zur Transcription Hemmung durch Gallium (III) und H messen<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) Corrole

Hier wird die Echtzeitüberwachung des Tumorzellstoffwechsels, kombiniert mit einem in vivo Modell der Chorio-Allantoismembran (CAM) der Metastasierung von Hühnerembryonen, verwendet, um neuartige Anti-Krebs-Ziele/Wirkstoffe auf ihre Fähigkeit hin zu bewerten, Tumorzellen für DNA-schädigende Chemotherapeutika zu sensibilisieren.

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Hier beschreiben wir einen zellbasierten Reportergen-Assay als wertvolles Werkzeug zum Screening chemischer Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen modulieren, die durch 3' UTR ausgeübt werden.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Drug Resistenz gegen gezielte Therapeutika ist weit verbreitet und die Notwendigkeit, die Mechanismen der Resistenz zu identifizieren - vor oder nach dem klinischen Einsetzen - ist entscheidend für die Führung alternative klinische Management-Strategien. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu koppeln, Ableitung von Medikamenten-resistenten Linien in vitro mit Sequenzierung zur Entdeckung dieser Mechanismen zu beschleunigen.

Implementierung von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Drug Resistance Assays: Maximierung des Potenzials für die Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen

In dieser Arbeit stellen wir einen experimentellen Workflow zur Verfügung, wie aktive Enhancer identifiziert und experimentell validiert werden können.

Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung

Wir präsentieren in der aktuellen Studie eine neuartige fluoreszenzbasierten Assays von einer transgenen Maus abgeleiteten Lymphozyten. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening (HTS) von kleinen Molekülen dotiert mit einer Kapazität von entweder Hemmung oder Förderung der Lymphozytenaktivierung geeignet.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

Wir legen ein Protokoll vor, um die mRNA-Übersetzungsverordnung in poxvirus-infizierten Zellen zu untersuchen, die in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter Assay verwendet werden. Der Test kann für das Studium der Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente einer mRNA verwendet werden, einschließlich 5 '-unübersetzter Region (UTR) und 3 '-UTR. Mit dieser Methode können auch verschiedene Übersetzungsinitiationsmodi untersucht werden.

In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vitro Selektion von technisch hergestellten Transkriptionsrepressoren (ETRs) mit hoher, langfristiger, stabiler On-Target-Silencing-Effizienz und geringer genomweiter Off-Target-Aktivität vor. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht es, ein anfängliches, komplexes Repertoire von ETR-Kandidaten auf eine kurze Liste zu reduzieren, die für die weitere Evaluierung in therapeutisch relevanten Umgebungen geeignet ist.

In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf von Ex-vivo - oder In-vitro-Zellkulturen bis hin zur transkriptomischen Datenvorverarbeitung für ein kostengünstiges Transkriptom-basiertes Wirkstoff-Screening.

Kosteneffizientes transkriptomisches Wirkstoff-Screening

Lernen Sie In-vitro-Transkriptionsassays zur Untersuchung regulatorischer Schritte bei der Transkription. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung von Transkriptionsprodukten auf einem RNA-Sequenzierungsgel.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

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