Name: Umsetzung einer kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS)-System auf einem Ti: Saphir und OPO-Laser-basierte Standard-Laser-Scanning-Mikroskop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Lernen Sie die Implementierung von CARS-Mikroskopie für markierungsfreie, chemisch selektive Bildgebung lebender Zellen auf Standard-Laser-Scanning-Mikroskopen mit Ti:Saphir- und OPO-Lasern.

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Die Autoren danken Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, Frankreich) für die Leihgabe des schnellen Oszilloskops und bedanken sich für die finanzielle Unterstützung durch Montpellier RIO Imaging (MRI). HR erkennt an, dass die ANR die Infrastrukturnetzwerke von France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) und France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) für kohärente Raman-Imaging-Entwicklungen bewilligt. Diese Arbeit wurde hauptsächlich durch ein Stipendium des Europäischen Forschungsrats (FP7-IDEAS-ERC 311610) und ein INSERM - AVENIR Stipendium für NT unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Der schwierigste Teil der Arbeit ist die zeitliche Synchronisation der Laserstrahlen. Es erfordert eine schnelle Photodiode mit einem schnellen Oszilloskop kombiniert, aber nur eine grobe zeitlich überlappend auf den ersten durchgeführt werden. Dann wird eine weitere Einstellung von wenigen cm erforderlich. Schließlich Mikrometer bewegt sich durch eine lineare Translationsstufe ermöglicht die Durchführung der endgültigen Feineinstellung der Verzögerungsleitungslänge, um die CARS-Signal auszulösen. Dieses Signal wird in ...

Optische Mikroskopie hat in lebenden biologischen Systemen mit subzellulärer Auflösung eine wichtige Technik zur zerstörungsfreien Visualisierung dynamischer Prozesse geworden. Die Fluoreszenzmikroskopie ist derzeit der beliebteste Bildgebungskontrast in lebenden Zellen verwendet aufgrund seiner hohen Spezifität und Sensitivität 1. Eine große Palette von Fluoreszenzsonden entstanden (exogene Farbstoffe, genetisch kodierten Proteine, Halbleiter-Nanopartikel). Verschiedene Probenbeleuchtung Fluoreszenzgestützte Techniken blühten haben (wie konfokaler oder Zweiphotonenmikroskopie) 3D - Bildgebung durchzuführen und einen Hauptnachteil dieser Technik zu verringern , die 2 Photobleaching. Weitere Einschränkungen sind das Erfordernis der Markierungsfluorophor, weil die meisten molekularen Spezies sind nicht eigen fluoreszierende und daher sind diese Fluorophore müssen künstlich in der abgebildeten Probe eingeführt werden. Diese künstliche Manipulation kann störend sein, vor allem für kleine Moleküle oder Topf induziertzielle Phototoxizität. Diese Gründe machen Fluoreszenzmikroskopie nicht gut geeignet für die In-vivo - Beobachtungen. Daher ist die Verwendung von optischen Abbildungstechniken mit hoher Empfindlichkeit und spezifische molekulare Kontraste ohne die Verwendung von Fluoreszenzmolekülen äußerst wünschenswert, in der biomedizinischen Wissenschaft. Mehrere nichtlineare optische Bildgebungsverfahren ohne Kennzeichnung oder Färbung entstanden, einschließlich Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) 3,4 und der dritten Harmonischen (THG) 5. SHG - Mikroskopie wurde an Bild strukturelle Anordnungen auf supramolekularer Ebene wie Mikrotubuli oder Kollagen 6 verwendet. THG erzeugt aus optischen Heterogenitäten wie Schnittstelle zwischen einem wässrigen Medium und Lipiden 7. THG wurde auch auf Bild Myelin 8,9 demonstriert. Beide Techniken können auf einem Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskop und erfordern nur einen Laserstrahl durchgeführt werden. Allerdings erfordern sie hohe Leistung Laserintensität (in der Regel 50mW bei 860 nm für SHG 10, 25 - 50 mW bei 1,180 nm für THG 9), die in lebenden Proben schädlich ist, und zwar um die chemische Spezifität nicht liefern, die eindeutig Bild spezifische biologische Strukturen erforderlich ist. Chemisch selektive Bildgebung kann von inhärenten molekularen Schwingungssignale auf Basis von Raman-Streuung erhalten werden. Wenn ein Lichtstrahl Materie auftrifft, können Photonen, die von Atomen oder Molekülen absorbiert und gestreut werden. Die meisten der gestreuten Photonen die gleiche Energie haben, das heißt, die Frequenz, wie die einfallenden Photonen. Dieser Vorgang wird als Rayleigh-Streuung genannt. Bezeichnet die Raman - Streuung eine geringe Anzahl von Photonen wird jedoch mit einem unelastischen Streuprozeß unterscheidet sich von der Frequenz der einfallenden Photonen, dh bei einer optischen Frequenz gestreut. Der Unterschied in der Energie stammt aus Anregung von Schwingungsmoden auf molekularen Struktur und Umgebung abhängt. Daher spontane Raman-Streuung provchemisch selektive Iden Bildgebung wie verschiedene Moleküle haben spezifische Schwingungsfrequenzen. Jedoch ist es wegen der extrem schwachen Signals begrenzt. Die konfokale Raman - Mikroskopie wurde entwickelt und bietet räumliche 3D - Auflösung, aber es erfordert eine hohe mittlere Leistung und lange Aufnahmezeit 11. Zur Überwindung dieser Schwierigkeiten, die jüngsten Fortschritte in der Lasertechnologie der Anstieg der nicht - linearen optischen Schwingungs Mikroskopie erlaubt, insbesondere kohärente Anti-Stokes - Raman - Streuung (CARS) 11,12,13. CARS ist ein dritter Ordnung nichtlinearen optischen Prozess. Drei Laserstrahlen, bestehend aus einem Pumpstrahl bei der Frequenz ω P, ein Stokes - Strahl bei der Frequenz ω S und einen Sondenstrahl (meistens ist die Pumpe) in einer Probe fokussiert und erzeugen eine Anti-Stokes - Strahl bei der Frequenz ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. Der Anti-Stokes-Signal kann wesentlich verbessert werden, wenn die Frequenzdifferenzzwischen der Pumpe und der Stokes - Strahlen auf eine Raman molekulare Schwingung Ω R = abgestimmt ist (ω P - ω S). CARS-Signal wird auf mehreren Photon-Wechselwirkung basiert. Es erzeugt daher ein kohärentes Signal Größenordnungen stärker als spontane Raman-Streuung. CARS - Mikroskopie wurde erstmals experimentell durch Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Verbessert dann die Technik, durch Verwendung von zwei fokussierten Nahinfrarot-Femtosekundenlaserstrahlung mit einer Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur, so dass die Phasenanpassungsbedingung von PKW und vermeidet die Zwei-Photonen nicht-resonanten Hintergrund 16. Daher CARS - Mikroskopie hat sich als ein mächtiges Werkzeug für die lebenden Zellen und Gewebe - Bildgebung, die durch chemische Moleküle wie Lipide (über CH - Streckschwingung) 17,18, Wasser (über OH - Streckschwingungen) Nachweis, Proteine, DNA in lebenden Zellen 19,20 sondern auch chemische Verbindung deuteriertems für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen 21 22. Die Hauptbeschränkung der nichtlinearen Mikroskopie stammt von der Kompliziertheit und die Kosten der optischen Quellen. Ein CARS System erfordert zwei Wellenlänge durchstimmbare Laser mit kurzen Pulsdauern und mit zeitlich und räumlich synchronisierte Impulsfolgen. Frühe CARS Mikroskope wurden auf Basis von zwei synchronisierten Pikosekunden - Ti: Saphir - Laser 20. Saphir - Laser zum Erzeugen eines Superkontinuum- Lichtquelle 23: CARS Bildgebung wurde ebenfalls aus einem einzigen Femtosekunden Ti erhalten. Vor kurzem zusammengesetzt Laserquellen eines einzelnen Femtosekunden Ti: Saphir-Laser eine abstimmbare optische parametrische Oszillatoren (OPO) Pumpen wurden für die CARS-Mikroskopie verwendet. Dieser Aufbau ermöglicht eigen zeitlich synchronisierten Strahlen mit einer Differenz von Frequenz zwischen der Pumpe und dem Stokes - Strahl die das gesamte molekulare Schwingungsspektrum 24. Darüber hinaus Laser-Scanning-Mikroskope auf der Basis eines Dreh-Schlüssel fs-Laser und ein OPO, in erster Linie für die Zwei-Photonen-Fluoreszenz (TPF) verwendet werden, sind jetzt nicht die Physiker zur Verfügung. Das Potential solcher Aufbauten können erheblich, ohne Ergänzungsanlage durch den Einbau von anderen nichtlinearen optischen Abbildungs ​​verbessert werden, da jede nichtlineare (NLO) Bildgebungsmodalität zu spezifischen Strukturen oder Molekülen empfindlich ist. Multimodale NLO - Bildgebung nutzt daher das Potenzial von NLO - Mikroskopie für komplexe biologische Proben 25. Die Kopplung dieser Techniken hat die Untersuchung vieler biologischer Fragestellungen erlaubt, insbesondere auf Fettstoffwechsels, Haut oder Krebsentwicklung 26, Entwicklung Skelettmuskel 27, atherosklerotische Läsionen 28. Darüber hinaus gibt die Implementierung von Laserstrahlabtastung mit CARS die Fähigkeit , mit hoher Rate Bildgebung, dh ein ansprechendes Werkzeug dynamische Prozesse in vivo zu untersuchen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, jeden Schritt zu zeigen, t zu implementierener CARS Technik auf einem Standard-Multi Laser-Scanning-Mikroskop. Das Mikroskop wird basierend auf einem fsec Ti: Saphir-Laser und ein OPO (vom Ti gepumpt: Laser Saphir) für Biologen durch eine Software betrieben. Die Integration wurde durch Einstellen der Länge von einer der Laserstrahlpfad, um in der Zeit, die zwei Strahlen zu synchronisieren ausgeführt. Wir beschreiben die Schritt-für-Schritt Durchführung dieser Technik, die nur grundlegende Hintergrund in experimentellen Optik erfordert. Wir zeigen auch CARS auf Myelinscheiden von Ischiasnerv von Nagetieren gewonnen Bildgebung, und wir zeigen diese Bildgebung können mit anderen nichtlinearen optischen Bildgebung, wie Standard-Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Technik und Erzeugung der zweiten Harmonischen gleichzeitig ausgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>Oszilloskop</td><td>Tektronix</td><td>TDS 520D</td><td>500 MHz&nbsp;</td></tr><tr><td>Photodetektor</td><td>Thorlabs</td><td>DET08C/M, T4290</td><td>5 GHz InGaAs, 800 - 1.700 nm</td></tr><tr><td>Ti:Saphir Laser Chamäleon Ultra Family II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optischer parametrischer Oszillator OPO Compact Family</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Prüfer Mikroskop LSM 7 MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Motorisiertes Periskop</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektiv W Plan-Apochromat 20X/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strahlkombinierer</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akustooptischer Modulator</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO Leistungsdämpfungsglied</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier-Röhre</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandpass Filter</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM BiG 1935-176</td><td>400 - 480 nm; 500 - 550&nbsp; Nm; 465 - 610&nbsp; nm</td></tr><tr><td>dichroitischer Spiegel</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Grenzwellenlänge 760&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Silber spiegelt</td><td>Newport</td><td>10D20ER.2&nbsp;</td><td>&lambda;/10, 480 - 20.000&nbsp; nm, Anzahl 4</td></tr><tr><td>Einachsiger Translationstisch mit Standard-Mikrometer</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>Menge 1</td></tr><tr><td>Aluminium-Steckbrett</td><td>Thorlabs</td><td>MB1015/M&nbsp;</td><td>Menge 1</td></tr><tr><td>Spiegelhalterung</td><td>Thorlabs</td><td>KMSS/M&nbsp;</td><td>Menge 4</td></tr><tr><td>Spiegelhalter für &Oslash; 1" Optik&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>MH25</td><td>Menge 4</td></tr><tr><td>Irisblenden&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>ID8/M</td><td>Menge 3</td></tr><tr><td>Schutzbox</td><td>Thorlabs</td><td>TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S</td><td>Menge 1</td></tr><tr><td>Optische Stifte</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M</td><td>Menge 8 (Längen je nach Aufbau)</td></tr><tr><td>661 - 690 nm Bandpassfilter</td><td>Semrock</td><td>676/29 nm BrightLine&reg; Einband-Bandpassfilter</td><td>Menge 1</td></tr><tr><td>Fluoreszierende Kügelchen</td><td>ThermoFisher</td><td>TetraSpeck&trade; Fluoreszierendes Mikrosphären-Größen-Kit</td><td></td></tr><tr><td>Laser-Betrachtungskarte</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>IR-Laser-Betrachtungskarte</td></tr><tr><td>Laser-Sicherheitsglas</td><td>Newport</td><td>LV-F22. P5L07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FluorMyelin&Handel; Rot fluoreszierender Myelin-Fleck</td><td>ThermoFisher</td><td>F34652</td><td></td></tr></tbody></table>

umsetzung einer kohärenten anti-stokes-raman-streuung (cars)-system auf einem ti: saphir und opo-laser-basierte standard-laser-scanning-mikroskop

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser-Scanning-Mikroskope ein Femtosekunden Ti kombiniert: Saphir-Laser und ein optischer parametrischer Oszillator (OPO), um die Laserlinie zu duplizieren sind für Biologen zur Verfügung stehen. Diese Systeme werden hauptsächlich für Mehrkanal-Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie. Jedoch ohne jegliche Modifikation, komplementäre nichtlineare optische Mikroskopie wie Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) oder Erzeugung der dritten Harmonischen (THG) kann auch mit diesem Set-up durchgeführt werden, so dass die markierungsfreie Abbildung von strukturierten Molekülen oder wässrigen mittel- Lipid-Grenzflächen. Diese Techniken sind gut geeignet für die in-vivo - Beobachtung, sondern sind in der chemischen Spezifität beschränkt. Chemisch selektive Bildgebung kann aus inhärente Schwingungssignale auf Basis von Raman-Streuung erhalten werden. Die konfokale Raman-Mikroskopie liefert räumliche 3D-Auflösung, aber es erfordert eine hohe mittlere Leistung und lange Aufnahmezeit. Zur Überwindung dieser Schwierigkeiten, die jüngsten Fortschritte in der Lasertechnik die Entwick erlaubtwicklung von nichtlinearen optischen Schwingungsmikroskopie, insbesondere kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS). daher CARS-Mikroskopie hat sich als ein mächtiges Werkzeug für die biologische und Live Cell Imaging, durch chemisch-Mapping Lipide (über CH-Streckschwingung), Wasser (über OH-Streckschwingungen), Proteine ​​oder DNA. In dieser Arbeit beschreiben wir die Umsetzung der CARS-Technik auf einem Standard-OPO-gekoppelten Multi Laser-Scanning-Mikroskop. Es basiert auf dem in Zeitsynchronisation der beiden Laserlinien, die durch die Länge von einer der Laserstrahlpfad eingestellt wird. Wir stellen eine Schritt-für-Schritt-Implementierung dieser Technik auf einem bestehenden Multisystem. Eine grundlegende Hintergrund in der experimentellen Optik ist hilfreich, und das vorgestellte System keine teuren Zusatzausstattung erforderlich. Wir zeigen auch, CARS Abbilden auf Myelinscheiden der Ischiasnerv von Nagetier erhalten, und wir zeigen, dass diese Abbildungs ​​gleichzeitig mit anderen nichtlinearen optischen Abbildungsdurchgeführt werden kann, wie beispielsweise Standard-two-Photonen-Fluoreszenz-Technik und Erzeugung der zweiten Harmonischen.

<html> Die Pulsfolgefrequenz von Standard-Ti: Saphir-Laser ist in der Regel etwa 80 MHz. Der OPO hat die gleiche Frequenz, da es durch die Ti gepumpt wird: Saphir-Laser. Ein schnelles Oszilloskop von mindestens 200 MHz ist daher erforderlich. Eine schnelle Photodiode im Bereich von 600 bis 1.100 nm ist ebenfalls erforderlich. Die maximale zeitliche Verschiebung tritt auf, wenn die Ti: Saphir und die OPO - Signale von 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6,2 ns verschoben sind. Es entspricht e...

Coherent Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) Mikroskopie auf Basis von Eigenschwingung von Molekül Bindungen erlaubt die markierungsfreie chemisch selektive Live Cell Imaging. Diese Arbeit stellt die Implementierung einer komplementären Mikroskopietechnik auf einem Standard-Multiphotonen-Laserrastermikroskop auf Basis eines Femtosekunden- Ti: Saphir-Laser und einem OPO-Laser.

Umsetzung einer kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS)-System auf einem Ti: Saphir und OPO-Laser-basierte Standard-Laser-Scanning-Mikroskop

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Implementierung einer komplementären Mikroskopietechnik namens CARS, die eine markierungsfreie, chemisch selektive, lebende Bildgebung auf einem Standard-Multiphotonen-Laserscanningmikroskop ermöglicht, das auf einem Femtosekunden-Titansaphir-Laser und einem optischen Parametrischen Oszillator basiert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biologie oder der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise das Verständnis von lipidbezogenen Erkrankungen, Mechanismen der Hautpenetration oder Hautstörungen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einfach auf einem Standard-Laserscanningmikroskop mit Ti:Saphir- und OPO-Lasern implementiert werden kann.Den Ablauf wird Hassan Boukhaddaoui, wissenschaftlicher Mitarbeiter und Leiter der Bildgebungsplattform des Labors, sowie Vasyl Mytskaniuk demonstrieren. Schalten Sie den Titan-Saphir- und den OPO-Laser gemäß dem schriftlichen Protokoll ein. Schalten Sie den Mikroskop-Computer ein.Schalten Sie die Mikroskop-Komponenten ein. Starten Sie die Software, indem Sie das Symbol auf dem Desktop doppelt anklicken, und richten Sie sie gemäß dem Textprotokoll ein. Bringen Sie dann einen dichroitischen Spiegel mit einer Grenzwellenlänge von 760 Nanometern im Seitenport-Schieber an.Positionieren Sie es im Unendlichkeitsraum oberhalb des Objektivrevolvers. Stellen Sie den schmalbandigen Filter und den Umlenkprismenwürfel vor PMT1, um ausschließlich das CARS-Signal bei 670 Nanometern zu erfassen und die dargestellten Ergebnisse zu reproduzieren. Anschließend platzieren Sie spezifische schmalbandige Filter vor PMT3 zur Fluoreszenzbeobachtung des Myelins und vor PMT4 zur SHG-Beobachtung.Stellen Sie im Software das Signal am Detektor mit einem speziell angepassten Bandpassfilter ein. Öffnen Sie das Lichtweg-Tool im Setup-Manager-Menü auf der Registerkarte „Acquisition“ und aktivieren Sie dann den gewünschten PMT sowie eine Farbe für den Kanal. Verwenden Sie beispielsweise Grün für CARS und Magenta für SHG.Die beiden Strahlen, die von demselben Titan-Saphir-Laser ausgehen, sind nicht synchron, wenn sie am Mikroskop ankommen, da der OPO-Strahl verzögert wird, wenn er erzeugt wird. Führen Sie dieses Verfahren durch, um sie zu resynchronisieren, indem Sie die Länge eines der Laserstrahlpfade anpassen, indem Sie eine Verzögerungsleitung einbauen. Dazu ist die Verwendung einer schnellen Fotodiode und eines schnellen Oszilloskops erforderlich.Zunächst verbinden Sie mithilfe von BNC-Kabeln den Eingangskanal CH1 des Oszilloskops mit dem elektrischen BNC-Laser-Ausgangssynchronausgang. Anschließend schließen Sie den Eingangskanal CH2 an die Foto-Diode an. Wählen Sie dann den Kanal CH1 als Trigger aus, indem Sie die Taste „Trigger-Menü“ drücken, danach die Hauptmenü-Taste „Source“ und anschließend die Seitentaste, die dem als CH1 ausgewählten Kanal entspricht.Positionieren und fixieren Sie nun mit optischen Haltevorrichtungen den Fotodioden in der Fokalebene eines 10x-Luftmikroskopobjektivs. Definieren Sie im Kanal-Tool die Wellenlänge des Titan-Saphir-Lasers bei 830 Nanometern mit geringer Leistung, die weniger als 1 % der maximalen Leistung beträgt. Verringern Sie im Werkzeug für den Aufnahmemodus die Scan-Fläche auf einen einzigen Punkt, um die Fotodiode mit dem kleinstmöglichen Strahl zu beleuchten.Schalten Sie dann den Laserscan durch Klicken auf die Taste „Kontinuierlich“ ein. Drücken Sie „Autoset“ auf dem Oszilloskop und bewegen Sie manuell die Photodiode, um eine Impulsfolge auf dem Oszilloskopbildschirm zu erhalten. Drücken Sie die „Run/Stop“-Taste, um die Anzeige anzuhalten.Als Nächstes schalten Sie den Titan-Saphir-Laser-Scan aus. Klicken Sie in der Software auf das Werkzeug „Channels“, deaktivieren Sie den 830 Nanometer-Laser und stellen Sie das OPO-Signal auf 1107 Nanometer und geringe Leistung ein. Schalten Sie dann den OPO-Laser-Scan ein, nehmen Sie die Impulszüge des OPO-Lasers am Oszilloskop auf und schalten Sie den OPO-Laser-Scan wieder aus.Vergleichen Sie nun die zeitliche Verzögerung zwischen den Signalen des Titan-Saphir-Lasers und des OPO. Berechnen Sie die Länge der Verzögerungsstrecke, die zur Positionierung der Spiegel verwendet wird. Bevor Sie fortfahren, setzen Sie Sicherheitsbrillen auf und entfernen Sie Halsketten, Armbänder oder Uhren von den Handgelenken.Öffnen Sie nun die Laser-Titansaphir-Linie, in der die Verzögerungsleitung realisiert wird, indem Sie die Schutzrohre entfernen. Wählen Sie dann eine Wellenlänge im sichtbaren Bereich, um den Laserstrahl leicht beobachten zu können, beispielsweise 700 Nanometer bei geringer Leistung, und schalten Sie den Laserscan ein. Setzen Sie nun zwei Irisblenden mithilfe der optischen Haltevorrichtungen in die offene Laserlinie ein.Platzieren Sie eine Blende am Ausgang der Verzögerungsleitung und die andere Blende am Eingang des Umlenkprismas. Verringern Sie anschließend die Blendenöffnung und justieren Sie die Positionen der Blenden, sodass sie der Laserstrahlbahn entsprechen, und befestigen Sie sie dann auf dem optischen Tisch. Stellen Sie abschließend die vertikale Position einer dritten beweglichen Irisblende ein.Die Größen-Blenden dienen als Kontrolle für den Neuausrichtungsprozess, um die Position des Laserstrahls während der sukzessiven Positionierung der vier Spiegel der Verzögerungsleitung zu überprüfen. Platzieren Sie nun den Spiegel M1 auf einer kompakten, kinematischen Spiegelhalterung am Eingang der Verzögerungsleitung und justieren Sie seine Position sowie seine Ausrichtung unter Verwendung der mobilen Irisblende, um die Strahlhöhe beizubehalten. Danach werden die Spiegel M2 und M3 im 90-Grad-Winkel auf der Verfahreinheit entsprechend der berechneten Länge der Verzögerungsleitung positioniert und ihre Ausrichtung mithilfe der mobilen Irisblende angepasst.Platzieren Sie M4 am Ausgang der Verzögerungsleitung direkt vor der Blende und justieren Sie sorgfältig seine Position und Winkelstellung, um den Laserstrahlverlauf durch die beiden feststehenden Irisblenden anzupassen. Bringen Sie nun die Laser-Anzeigekarte am Ausgang des Mikroskopobjektivs an und überprüfen Sie das Profil des Laserstrahls. Falls erforderlich, passen Sie die Ausrichtung von M4 leicht an, um eine gleichmäßige, helle Scheibe zu beobachten.Zuletzt das schnelle Photodioden unter dem Laserstrahl in der Fokusebene der Probe neu positionieren. Anschließend die zeitliche Verschiebung zwischen dem Titan-Saphir-Laserstrahl und dem OPO-Strahl auf dem Oszilloskop beobachten. Gegebenenfalls die Länge der Verzögerungsleitung ändern, indem die gesamte Translationsstufe verschoben wird, um die Pulse zu synchronisieren.Die räumliche Überlagerung der beiden Strahlen, die für ein CARS-Signal erforderlich sind, wird erreicht, indem fluoreszierende Polystyrolkügelchen visualisiert werden, die auf einem Objektträger fixiert sind. Fokussieren Sie die Kügelchen mit einem 20x-Wasserobjektiv. Fügen Sie nun im Kanalwerkzeug des Erfassungsreiters Spur eins hinzu oder verwenden Sie die vorhandene Spur.Wählen Sie die Wellenlänge bei 830 Nanometern und niedrige Leistung für den Titan-Saphir-Laserstrahl. Schalten Sie im Fenster „Channels“ im Kästchen „Track one“ die Farbe auf Grün um und aktivieren Sie im Lichtpfadfenster das Kästchen PMT3 oder PMT4. Fügen Sie anschließend einen zweiten Track für den OPO-Laserstrahl hinzu und stellen Sie die Wellenlänge auf 1107 Nanometer und niedrige Leistung ein.Schalten Sie die Farbe im Kanal-Fenster im Feld für Spur zwei und im Lichtpfad-Fenster im Feld für PMT3 oder PMT4 auf Rot um. Wählen Sie nun den maximalen Scan-Bereich aus und stellen Sie den Verstärkungsfaktor beider Spuren auf 600 ein. Anschließend starten Sie nacheinander den Scan der beiden Strahlen auf der Probe, indem Sie auf „Weiterscannen“ klicken.Beobachten Sie das Bild im Bildschirmbereich in der 2D-Ansicht. Erhöhen Sie die Leistung beider Laser. Falls erforderlich, bewegen Sie den Fokusteller leicht, um die Fokusebene der Perlen zu finden.Passt abschließend den Ausschnitt an und zoomt das Bild auf eine einzelne Perle oder auf eine Gruppe benachbarter Perlen heran. Überlappt anschließend mithilfe des Periskop-Controllers die Strahlen in der XY-Ebene. Öffnet im Softwareprogramm die Registerkarte „Maintain“.Klicken Sie auf die Systemoptionen und öffnen Sie das Werkzeugfenster für das motorisierte Periskop. Weitere Einzelheiten werden im Textprotokoll erläutert. Nach dem Überlappen der Bilder beider Laserstrahlen wird die Synchronisation erreicht.Um die präzise zeitliche Abstimmung zur Aktivierung von CARS zu erreichen, bereiten Sie einen Objektträger mit einem Tropfen Olivenöl und einem Deckglas vor. Fokussieren Sie dann mit einem 20x-Wasserimmersionsobjektiv auf die Kante des Deckglases. Stellen Sie anschließend auf Spur eins die Wellenlänge auf 830 Nanometer für den Titan-Saphir-Laserstrahl und auf 1107 Nanometer für den OPO ein.Schalten Sie beide Laser in Spur eins um, um eine gleichzeitige Aufnahme zu erhalten. Beginnen Sie mit beiden Lasern auf niedriger Leistung. Deaktivieren Sie anschließend im Fenster „Lichtpfad“ die Option PMT4 und wählen Sie PMT1 aus.Wählen Sie dann den maximalen Scan-Bereich aus und schalten Sie die Laserscans durch Klicken auf die Taste „fortlaufend“ ein. Stellen Sie den Verstärkungsfaktor auf 600 ein und erhöhen Sie gegebenenfalls die Leistung beider Laser. Passen Sie anschließend die Anzeigeintensität im Steuerblock der Anzeigeansichtsoption an.Bewegen Sie dann langsam die Translationsstufe der Verzögerungsleitung, bis das Signal deutlich verstärkt wird. Verringern Sie anschließend die Leistung beider Laser. Überprüfen Sie nun, ob es sich bei dem Signal um ein CARS-Signal handelt, indem Sie abwechselnd einen der beiden Laser ausschalten.Wenn die Signalintensität schwächer wird oder verschwindet, wurde ein CARS-Signal erhalten. Da das endgültige System für Nicht-Physiker gedacht ist, sollte der Lichtweg der Verzögerungsleitung mit einer Abschirmbox und Rohren umschlossen werden, um direkten Zugang zu einem schädlichen, unsichtbaren Laserstrahl mit hoher Spitzenleistung zu vermeiden. Stellen Sie jedoch Zugang zum Verstellrad des Translationsstages bereit.Eine fluoro-myelinrote Färbung, die eine Selektivität für Myelin aufweist, wurde verwendet, um die Myelinscheide zu beobachten. Eine gleichzeitige Anregung bei 830 und bei 1095 Nanometern erzeugt ein CARS-Signal. Die Kreise entsprechen der Myelinscheide, die Axone in einem Querschnitt umgibt.Dieselbe Struktur ist bei der Überlagerung von CARS- und Fluoreszenzbildern zu beobachten. Der Detaillierungsgrad von CARS und der fluoreszenten Markierung ist sehr ähnlich. Dies könnte die Verwendung von Farbstoffen möglicherweise überflüssig machen.Das System kann außerdem gleichzeitig ein zweites harmonisches Signal aus den Kollagenfasern an der äußeren Oberfläche des Nervus ischiadicus erzeugen. Ein anderer Detektor wird verwendet, um ein Signal bei 550 Nanometern aufzuzeichnen, da ein schmaler Bandpassfilter bei 670 Nanometern für die CARS-Signalregistrierung verwendet wird. Die Fasern werden durch eine falsche Magentafarbe dargestellt.Das CARS-Signal zeigt allein deutlich die Myelinscheiden. Durch die gleichzeitige Visualisierung beider Signale erscheinen die Myelinscheiden in Grün umgeben von Kollagenfasern in Magenta. Ein CARS-Signal benötigt weniger Energie als SHG- oder THG-Signale.CARS-Signale wurden mit vier Milliwatt bei 830 Nanometern und 13 Milliwatt bei 1095 Nanometern erzielt, während 50 Milliwatt bei 1095 Nanometern erforderlich waren, um ein SHG-Signal zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man Schritt für Schritt einen der Laserstrahlengänge modifiziert, um beide Laserstrahlen zeitlich zu synchronisieren. Die Implementierung der Verzögerungsleitung kann innerhalb weniger Wochen von Biologen mit grundlegenden Kenntnissen in experimenteller Optik oder in Zusammenarbeit mit Physikern durchgeführt werden.Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit leistungsstarken, unsichtbaren Laserstrahlen äußerst gefährlich sein kann. Es sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie das Tragen von Schutzbrillen während der Durchführung des Verfahrens und die endgültige Abschirmung des Laserstrahlengangs.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Kombination von drei einzigen Wellenlänge kurz gepulsten Lasern wird verwendet, um kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS) und doppelt-Resonanz-CARS (DR-CARS) zu generieren. Die Differenz zwischen diesen Signalen bietet eine verbesserte Empfindlichkeit für sonst schwer kohärente Raman-Signale zu erkennen, so dass bildgebende der schwachen Raman Streuer.

Differential Imaging biologischer Strukturen mit doppelt-resonanten kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS)

Quelle: Espinoza, R., et al. Zweifarbige, zweifarbige Raman-Streubildgebung des Gehirns von Mäusen für die Gewebediagnostik. J. Vis. exp. (2022).  Das Video zeigt die zweifarbige Bildgebung der stimulierten Raman-Streuung (SRS) von Hirngewebeschnitten von Mäusen. Zwei synchronisierte Laserstrahlen werden auf den Gewebeschnitt gerichtet, um molekulare Schwingungen anzuregen, was zu einer relativen Intensitätsänderung der Strahlen führt. Lipide und Proteine im Gewebe werden mit Hilfe...

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Visualisierung und Quantifizierung pharmazeutischer Verbindungen in der Haut mittels kohärenter Raman-Streubildgebung

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Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine leistungsstarke, zerstörungsfreie und markierungsfreie Bildgebungstechnik. Eine aufkommende Anwendung ist die stimulierte Raman-Histologie, bei der die zweifarbige SRS-Bildgebung an den Protein- und Lipid-Raman-Übergängen verwendet wird, um Pseudo-Hämatoxylin- und Eosin-Bilder zu erzeugen. Hier demonstrieren wir ein Protokoll für die zweifarbige SRS-Bildgebung in Echtzeit für die Gewebediagnose.

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Die elektronische präresonanzstimulierte Raman-Streuung (epr-SRS) Bildgebung von regenbogenartigen Raman-Farbstoffen ist eine neue Plattform für die hochgradig gemultiplexte Epitop-basierte Proteinbildgebung. Hier stellen wir einen praktischen Leitfaden vor, der die Antikörpervorbereitung, die Gewebeprobenfärbung, die SRS-Mikroskopmontage und die EPR-SRS-Gewebebildgebung umfasst.

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Dieser Artikel stellt die Integration eines spektralfokussierenden Moduls und eines Dual-Output-Pulslasers vor, der eine schnelle hyperspektrale Bildgebung von Goldnanopartikeln und Krebszellen ermöglicht. Diese Arbeit zielt darauf ab, die Details multimodaler nichtlinearer optischer Techniken auf einem Standard-Laserscanning-Mikroskop zu demonstrieren.

Biomolekulare Bildgebung der zellulären Aufnahme von Nanopartikeln mittels multimodaler nichtlinearer optischer Mikroskopie

Dieses Papier vergleicht direkt die Auflösung, Empfindlichkeit und Bildkontraste der stimulierten Raman-Streuung (SRS) und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS), die in dieselbe Mikroskopplattform integriert sind. Die Ergebnisse zeigen, dass CARS eine bessere räumliche Auflösung hat, SRS bessere Kontraste und spektrale Auflösung liefert und beide Methoden eine ähnliche Empfindlichkeit aufweisen.

Direkter Vergleich der hyperspektralen stimulierten Raman-Streuung und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie für die chemische Bildgebung

Die Visualisierung der Myelinisierung ist ein wichtiges Ziel für viele Forscher, die das Nervensystem untersuchen. CARS ist eine Technik, die mit der Immunfluoreszenz kompatibel ist und nativ Lipide in Geweben wie dem Gehirn abbilden kann, die spezialisierte Strukturen wie Myelin beleuchten.

Kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) Anwendung zur Bildgebung der Myelinisierung in Gehirnschnitten

Lernen Sie die Implementierung von CARS-Mikroskopie für markierungsfreie, chemisch selektive Bildgebung lebender Zellen auf Standard-Laser-Scanning-Mikroskopen mit Ti:Saphir- und OPO-Lasern.

Umsetzung einer kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS)-System auf einem Ti: Saphir und OPO-Laser-basierte Standard-Laser-Scanning-Mikroskop (Video) | JoVE Journal

Umsetzung einer kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS)-System auf einem Ti: Saphir und OPO-Laser-basierte Standard-Laser-Scanning-Mikroskop

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