Name: Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Lernen Sie die Messung von Phagozytose und oxidativem Burst bei Granulozyten und Monozyten im menschlichen Blut. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Analysen der angeborenen Immunfunktion.

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Die Autoren möchten sich Zack Shue, Casey John und Lynn Cialdella-Kam für ihre Unterstützung bei der Optimierung dieses Verfahrens zu bestätigen.

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Handschrift stellt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung von zwei Indikatoren von Granulocyten und Monocyten-Funktion. Wir haben einige Schritte identifiziert, die für den Erfolg dieses Tests sind entscheidend. Ein solcher Schritt ist das Eisbad Inkubation, die Zugabe von Bakterien unmittelbar vor auftritt. Gründliches Kühlen aller Proben wird die Wirkung der Temperatur auf die Phagozytose und OB-Aktivität minimieren. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Zugabe von Bakterien zu jeder Probe. A 8: ...

Die Granulozyten und Monozyten Phagozytose / oxidativen Burst (OB) Aktivitätstest ist eine einfache, geradlinige Technik , die häufig verwendet wird , um Informationen über angeborene Immunfunktion nach längerer und intensiver Bewegung zu sammeln. 1-4 Wenn die Antwort des Immunsystems studieren ein Stimulus sind Granulozyten und Monozyten von besonderem Interesse , weil sie eine zentrale Rolle in der Wirtsabwehr und sind die ersten Immunzellen an den Ort der Infektion zu akkumulieren spielen. 5 Neutrophile, eine Art von Granulozyten, sind die ersten Zellen in beschädigten Muskel zu translozieren Gewebe nach intensiver Übung. 6 Phagozytose und OB - Aktivität sind die häufigsten Maßnahmen von Granulozyten und Monozyten - Funktion, 7 und werden als Indikatoren der angeborenen Immunzellfunktion aufgrund ihrer zentralen Rolle in sowohl der Infektion und dem Reparaturprozess bevorzugt. Der Test in diesem Manuskript utili beschriebenzes eine Grund Durchflusszytometer eine quantitative Bestimmung von Granulozyten und Monozyten Phagozytose und OB-Aktivität in Vollblut zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung von Vollblut in dieser Technik ist vorteilhaft, da es die Assay erlaubt ohne zeitraubende Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Dieser Test kann leicht eine Vielzahl von Forschungsdesigns und Labor-Fähigkeiten zur Aufnahme geändert werden. B. Liao et al. Verwendeten eine ähnliche Technik , die Neutrophilen - OB - Aktivität zu zeigen , erhöht wird und neutrophile Phagozytose wird nach einer traumatischen Hirnverletzung verringert. 8 In einem anderen Beispiel, McFarlin et al. Beschrieben eine elegante Abwandlung dieser Technik , die Allophycocyanin verwendet (APC ) -konjugierte CD66b und High-Performance - Tandem - APC-konjugierten CD45 - Markierung mit bildbasierten Durchflusszytometrie Granulozyten hinsichtlich ihrer Phagozytose und OB - Aktivitäten zu klassifizieren. 7,9 Unsere Forschungsgruppe hat verschiedene Anpassungen dieser te verwendetchnique als Indikator für die angeborene Immunfunktion bei Übergewicht, fettleibig, und athletische Bevölkerung seit fast 20 Jahren. 10,11 Der Text wird den Leser bieten mit Schritt- für -Schritt - Anleitungen zur Durchführung dieses Tests und Bereiche hervorheben , dass der Leser anpassen kann die Bedürfnisse ihrer Forschung gerecht zu werden.

<table><tbody><tr><td>12 x 75 mm Röhrchen, mit Kappe</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>Sie benötigen 2 Röhrchen pro Probe ("H" und "F") plus 3 Röhrchen pro Charge (für Assay-Kontrollen; "F", "H" und "Nur Blut").</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Flaschenverschluss 0,2 & Mikro; m Celluloseacetat-Filter (500 ml Fassungsvermögen)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-741-07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glukose, Pulver</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure (wasserfrei, Zellkultur getestet, Pflanzenzellkultur getestet)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat dreibasisches Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium (Hydroethidin) (HE)</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxid (DMSO) wasserfrei</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Holzstamm ohne Protein A) BioPartikel, Fluorescein-Konjugat (FITC)</td><td>Life Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Holzstamm ohne Protein A) BioParticles, unmarkiert</td><td>Life Technologies</td><td>S-2859</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>4,0 ml Vacutainer mit 7,2 mg K2EDTA, sprühgetrocknet</td><td>VWR</td><td>BD367861</td><td>Sie benötigen 1 K2EDTA Blutentnahmeröhrchen pro Probe.</td></tr><tr><td>4,0 ml Vacutainer mit 68 USP-Einheiten Lithium-Heparin, sprühbeschichtet</td><td>VWR</td><td>BD367884</td><td>Pro Probe benötigen Sie 1 Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen.</td></tr><tr><td>SCHAR AC&middot; T 5diff CP</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605705</td><td>i.d., Hämatologie-Analysator</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Spülung</td><td>Beckman Schar</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>Schar Ac&middot; T 5diff Fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Cal Calibrator</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Control Plus</td><td>Beckman Schar</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff Verdünnungsmittel</td><td>Beckman Schar</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l verlängerte Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>Isolierte Eiswanne</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>Für Eiswasserbad.</td></tr><tr><td>Offenes Röhrchengestell aus Metall</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>TQ-Prep Workstation</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605429</td><td>i.e., automatisierte Workstation zur Vorbereitung der Zelllyse</td></tr><tr><td>ImmunoPrep Reagenziensystem</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>i.d., RBC-Lyse/WBC-Fixreagenzsystem</td></tr><tr><td>Cytomics FC500 MCL Durchflusszytometrie-System mit CXP-Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlow Swrap Fluid</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>COULTER CLENZ</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check Fluorosphären&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td>i.e., Ausrichtung und Fluidik Verifikation von Fluorosphären</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo FlowJo</td><td></td><td>i.e., Software für die Durchflusszytometrie-Analyse</td></tr><tr><td>Excel Software</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel</td><td>i.e., elektronisches Tabellenkalkulationsprogramm</td></tr></tbody></table>

mess granulozyten und monozyten phagozytose und oxidativer burst-aktivität im menschlichen blut

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Der Granulozyten- und Monozyten-Phagozytose- und Oxidative Burst (OB)-Aktivitätsassay kann verwendet werden, um das angeborene Immunsystem zu untersuchen. Dieses Manuskript bietet die notwendige Methodik, um diesen Assay in ein Arsenal der Bewegungsimmunologie aufzunehmen. Der erste Schritt in diesem Assay besteht darin, zwei Aliquots ("H" und "F") von Vollblut (Heparin) herzustellen. Dann wird Dihydroethidium zum H-Aliquot hinzugefügt, und beide Aliquote werden in einem warmen Wasserbad inkubiert, gefolgt von einem kalten Wasserbad. Als nächstes wird Staphylococcus aureus (S. aureus) zum H-Aliquot und Fluorescein-Isothiocyanat-markierter S. aureus zum F-Aliquot (Bakterien:Phagozyten = 8:1) hinzugefügt, und beide Aliquots werden in einem warmen Wasserbad inkubiert, gefolgt von einem kalten Wasserbad. Dann wird jedem Aliquot Trypanblau zugesetzt, um die extrazelluläre Fluoreszenz zu löschen, und die Zellen werden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Als nächstes werden die roten Blutkörperchen lysiert und die weißen Blutkörperchen fixiert. Schließlich werden ein Durchflusszytometer und eine entsprechende Analysesoftware verwendet, um die Phagozytose von Granulozyten und Monozyten sowie die OB-Aktivität zu messen. Dieser Assay wird seit über 20 Jahren verwendet. Nach starker und längerer Anstrengung kommt es bei Sportlern zu einem signifikanten, aber vorübergehenden Anstieg der Phagozytose und einer längeren Abnahme der OB-Aktivität. Die Zunahme der Phagozytose nach dem Training korreliert mit einer Entzündung. Im Gegensatz zu normalgewichtigen Personen ist die Granulozyten- und Monozyten-Phagozytose bei übergewichtigen und adipösen Teilnehmern chronisch erhöht und korreliert moderat mit dem C-reaktiven Protein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser auf Durchflusszytometrie basierende Assay die Phagozytose und OB-Aktivität von Phagozyten misst und als zusätzliches Maß für bewegungs- und adipositasinduzierte Entzündungen verwendet werden kann.

Längerer und intensive Übung hat profunde Auswirkungen auf die angeborene Immunfunktion, einschließlich der natürlichen Killerzellen-Funktion, Makrophagen-Zytokin-vermittelten Immunantwort auf virale Infektionen und Granulozyten und Monozyten Phagozytose und OB-Aktivität. Mehrere Studien zeigen, dass Granulozyten und Monozyten Phagozytose steigt deutlich nach dem Training, um die Entzündung durch Muskelschäden und metabolischen Anforderungen induziert widerspiegelt. Im Gegensatz dazu Gra...

Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Messung der Phagozytose von Monozyten und Granulozyten und der oxidativen Burst-Aktivität in menschlichen Blutproben vorzustellen.

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, die Phagozytose und die oxidative Burst-Aktivität von Granulozyten und Monozyten in Vollblut zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, beispielsweise wie eine bestimmte Ernährungsintervention die Immunantwort auf körperliche Belastung beeinflusst. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass es sich um einen einfachen und unkomplizierten Test handelt, der leicht an die verfügbaren Laborressourcen und Forschungsinteressen angepasst werden kann.Wir verwenden diese Messgröße der angeborenen Immunfunktion seit zwei Jahrzehnten in vielen unserer Trainingsstudien, und wir werden einige dieser Daten später im Video präsentieren. Vor Beginn des Verfahrens führen Sie mithilfe eines Hämatologie-Analysators gemäß den Herstelleranweisungen eine vollständige Blutbildanalyse mit Differenzialblutbild der weißen Blutkörperchen an den Blutproben durch. Notieren Sie die Anzahl der weißen Blutkörperchen in Zellen pro Milliliter sowie die prozentualen Werte für Neutrophile und Monozyten der Proben.Verwenden Sie anschließend für jedes experimentelle und Kontrollröhrchen eine Pipettenspitze mit verlängerter Länge, um 100 µL jeder Vollblutprobe aus dem Lithiumheparin-Blutentnahmeröhrchen auf den Boden eines entsprechend beschrifteten 12 × 75 mm-Röhrchens zu übertragen. Sobald das gesamte Blut überführt wurde, geben Sie 10 µL der HE-Arbeitslösung in die Röhrchen, die mit roter Tinte und einem H gekennzeichnet sind, einschließlich des HE-Kontrollröhrchens. Entfernen Sie die Verschlüsse der Röhrchen.Vortexen Sie die Proben kurz und überführen Sie die Röhrchen in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius in einem offenen Metallgestell, wobei alle fünf Minuten vorsichtig geschüttelt wird. Nach 15 Minuten überführen Sie das Gestell mit den Röhrchen rasch in ein Eiswasserbad für 12 Minuten, wobei alle fünf Minuten erneut vorsichtig geschüttelt wird. Am Ende der Inkubation geben Sie das entsprechende Volumen der unmarkierten S.aureus-Arbeitslösung zu den Röhrchen, die mit roter Tinte und einem H gekennzeichnet sind, einschließlich des HE-Kontrollröhrchens.Vortexen Sie die Röhrchen kurz mit geschlossenen Deckeln. Geben Sie dann das entsprechende Volumen der FITC-markierten S.aureus-Arbeitslösung in die mit schwarzer Tinte und einem F gekennzeichneten Röhrchen, einschließlich des FITC-Kontrollröhrchens, und vortexen Sie die Proben kurz. Anschließend inkubieren Sie alle Röhrchen 20 Minuten lang im 37-Grad-Celsius-Wasserbad unter Schütteln alle fünf Minuten, gefolgt von einer einminütigen Abkühlphase im Eiswasser.Nachdem die Proben bei Raumtemperatur platziert wurden, fügen Sie mit einer Mehrfachpipette 100 Mikroliter eiskalte Pufferlösung zur Probe hinzu und wirbeln Sie die Proben kurz durch. Stellen Sie die Proben zurück in das Eisbad. Nach einer Minute geben Sie mit der Mehrfachpipette je einen Milliliter eiskalte PBS zu jeder Probe hinzu.Anschließend die Röhrchen vortexen und den Proben zusätzlich zwei Milliliter PBS hinzufügen. Nun die Zellen zentrifugieren und den Überstand absaugen. Mit der Repeat-Pipette 50 Mikroliter eiskalte FBS zu den Röhrchen geben.Nach dem Wirbeln alle Röhrchen in ein Probengestell überführen. Mit einer automatisierten Arbeitsstation zur Zelllyse gemäß den Herstelleranweisungen die roten Blutkörperchen lysieren und die weißen Blutkörperchen fixieren. Um die Assayergebnisse per Durchflusszytometrie zu analysieren, die Erfassungssoftware des Durchflusszytometers öffnen und ein neues Protokoll erstellen.Wählen Sie FITC als FL1-Parameter für den Phagozytose-Assay und HE als FL2-Parameter für den Oxidativen-Burst-Aktivitäts-Assay. Erstellen Sie ein Streudiagramm der Vorwärtsstreuung gegen die Seitwärtsstreuung sowie ein FL1-Histogramm und ein FL2-Histogramm. Erstellen Sie anschließend polygonale Bereiche für die Populationen der weißen Blutkörperchen, Granulozyten und Monozyten im Streudiagramm der Vorwärts- gegen die Seitwärtsstreuung und lineare Bereiche in den Histogrammen.Führen Sie nun die negative Kontrollprobe mit nur Blut durch, gefolgt von den HE- und FITC-positiven Kontrollproben, überprüfen Sie die Histogramme und passen Sie die Photomultiplier-Röhrenspannungen der FITC- und PE-Kanäle bei Bedarf an. Starten Sie anschließend die Datenaufnahme für die Kontrollproben. Nach einer 15-minütigen Equilibrierungsphase laden Sie die experimentellen Proben gemäß der Reihenfolge auf der Arbeitsliste in das Probentablett und beginnen die Analyse der Studienproben.Um die phagozytische Aktivität der Proben zu beurteilen, sammeln Sie zunächst alle F-markierten Proben und die Kontroll-List-Mode-Datendateien in einem einzigen Ordner und ziehen Sie die Dateien in den Probenspeicher der Durchflusszytometrie-Analyse-Software. Doppelklicken Sie auf eine Kontrollprobe und verwenden Sie den Polygon-Tor-Selektor, um ein Tor für die Gesamtpopulation der weißen Blutkörperchen festzulegen, wobei darauf zu achten ist, alle Zellen an den Rändern des Diagramms einzubeziehen. Bezeichnen Sie dieses Tor als WBC.Doppelklicken Sie auf das WBC-Tor und verwenden Sie den elliptischen Tor-Selektor, um das Lymphozyten-Tor festzulegen. Beschriften Sie das Tor entsprechend und ziehen Sie die prozentuale Tor-Datenangabe zur Seite, damit die Zellen leicht zu sehen sind. Verwenden Sie anschließend den Polygon-Tor-Selektor, um das Granulozyten-Tor und das Monozyten-Tor festzulegen.Beschriften Sie jedes Tor entsprechend und ziehen Sie den Prozentsatz der Gating-Daten zur Seite. Doppelklicken Sie auf die FITC-Kontrollprobe und anschließend auf das Granulozyten-Tor und verwenden Sie die Dropdown-Menüs, um die X-Achse auf FL1 und die Y-Achse auf Seitenstreuung (SS) einzustellen. Verwenden Sie den rechteckigen Gating-Selektor, um ein phagozytose-negatives Tor und ein phagozytose-positives Tor zu definieren. Markieren Sie das phagozytose-positive Tor der Granulozytenpopulation.Klicken Sie dann auf Arbeitsbereich und Statistik hinzufügen. Wählen Sie Geometrisches Mittel und FL1 aus, um die Fluoreszenzintensität der phagozytosepositiven Granulozyten zu erzeugen, und klicken Sie auf Hinzufügen. Wählen Sie anschließend die Häufigkeit der übergeordneten Statistik aus und klicken Sie auf Hinzufügen, um den Prozentsatz der phagozytosepositiven Granulozyten zu ermitteln.Um diese Einstellungen auf alle Studienproben anzuwenden, markieren Sie alle in der FITC-Kontrollprobe erstellten Tore und Statistiken und ziehen Sie sie in den Bereich „Alle Proben“ im Gruppenpanel. Speichern Sie die Arbeit als WSP-Datei in demselben Ordner, der den Ordner mit den Daten im Listmodus enthält. Klicken Sie nun auf die erste experimentelle Probe im Datensatz und überprüfen Sie, ob das Leukozyten-Tor jeweils passend zur Zellverteilung auf jeder Probe liegt; passen Sie gegebenenfalls die Ränder des Tores an.Klicken Sie nun auf das Gate für weiße Blutkörperchen in der ersten experimentellen Probe und überprüfen Sie, ob die Gates für Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten der Zellverteilung in jeder der Proben entsprechen; passen Sie die Gates bei Bedarf an. Nachdem Sie die Datei gespeichert haben, klicken Sie auf das Symbol des Tabelleneditors und ziehen Sie jede gewünschte Statistik in die Tabelle. Klicken Sie auf „Tabelle erstellen“, um die Daten im Tabellenformat anzuzeigen, und speichern Sie die Arbeit als XLSX-Datei.Wiederholen Sie anschließend die Analyse für die mit H markierten Proben der oxidativen Burst-Aktivität und die Kontroll-List-Mode-Datendateien, wie gerade gezeigt. Wie in diesem repräsentativen Experiment dargestellt, ist die granulozytenvermittelte Phagozytose von S. aureus unmittelbar und 1,5 Stunden nach einer 75 Kilometer umfassenden Radfahreinheit erhöht und kehrt bis zum nächsten Morgen wieder auf Normalniveau zurück. Die oxidative Burst-Aktivität der Granulozyten ist nach dieser Belastungsintensität mindestens 21 Stunden lang vermindert.Außerdem besteht eine moderate Korrelation zwischen der Phagozytose von Granulozyten und den Serumspiegeln von C-reaktivem Protein, wie in dieser Analyse von 106 übergewichtigen oder adipösen Frauen beobachtet wurde. Dies deutet darauf hin, dass eine hohe Phagozytoseaktivität von Granulozyten und Monozyten bei ruhenden Probanden auf eine systemische Entzündung hinweisen kann. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung für etwa 30 Proben innerhalb von sieben Stunden abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Proben vollständig abzukühlen, bevor die Bakterien hinzugefügt werden, um unerklärliche Variabilität zwischen den Proben möglichst gering zu halten.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Quantifizierung von Zytokinen angewendet werden, um die Wirkung Ihrer Intervention auf die entzündliche Reaktion zu bestimmen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich der Immunologie die Auswirkungen verschiedener lebensstilbedingter Veränderungen sowie der angeborenen Immunfunktion beim Menschen untersuchen konnten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Phagozytoseaktivität sowie die oxidative Burst-Aktivität von Granulozyten und Monozyten mittels Durchflusszytometrie messen kann.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen der geeigneten PSA, getroffen werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt eine Methode zur Quantifizierung der Phagozytose von FITC-markierten pathogenen Pilzsporen durch menschliche Leukozyten. Phagozytierte Sporen werden durch Gegenfärbung von zelladhärenten Sporen unterschieden, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Analyse.

Quantitative durchflusszytometrische Messung der Pilzsporen-Phagozytose durch humane Phagozyten

Dieses Video zeigt den Assay zur Bestätigung der phagozytischen Aktivität von Zellen im menschlichen Blut mittels Durchflusszytometrie. Die Granulozyten und Monozyten bestätigen ihre phagozytäre Aktivität, indem sie eine grüne und rote Fluoreszenz zeigen, die das Vorhandensein von verschlungenen Bakterien bzw. oxidative Burst-Aktivität bestätigt.

Ein Assay zur Beurteilung der Phagozytose und der oxidativen Burst-Aktivität in Granulozyten und Monozyten

Dieses Video zeigt einen Monozyten-Monolayer-Assay, der primäre Monozyten aus peripherem Blut verwendet, um die Fcγ-Rezeptor-vermittelte Phagozytose mit Poly-D-Antikörper-opsonisierten R2R2 roten Blutkörperchen zu bewerten.

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Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten In-vitro-

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Haemophilus influenzae induziert Entzündungen in den Atemwegen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung von Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie, um Immunantworten von Phagozyten und Lymphozyten als Reaktion auf dieses Bakterium zu definieren.

Beurteilung der respiratorischen Immunantwort auf Haemophilus influenzae

Wir haben Verbesserungen und aktualisierte Methoden für den bestehenden Monozyten-Monolayer-Assay (MMA) entwickelt, bei dem Makrophagen verwendet werden, um die klinische Relevanz von Erythrozyten-Alloantikörpern in der Transfusionsmedizin und Immunologie besser vorhersagen zu können. Dieser Assay wird als Monozyten-Makrophagen-Assay (M-MA) bezeichnet.

Vorhersage der Bedeutung von Antikörpern roter Blutkörperchen mit dem Monozyten-Makrophagen-Assay

Diese Arbeit beschreibt ein standardisiertes in vitro Protokoll zur Quantifizierung und zum Vergleich der Phagozytoseraten von xenogenen (humanen) und allogenen (Ratte) roten Blutkörperchen durch isolierte Rattenmakrophagen.

Eine quantitative Bewertung der Phagozytose allogener und xenogener Erythrozyten durch Rattenmakrophagen in vitro

Lernen Sie die Messung von Phagozytose und oxidativem Burst bei Granulozyten und Monozyten im menschlichen Blut. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Analysen der angeborenen Immunfunktion.

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

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