Name: Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Mikrotubuli-Dynamik und Zellmigration in lebenden HUVECs mittels Zeitraffer-Imaging analysieren. Diese Methode liefert Einblicke in Zytoskelett-Verhalten und Angiogenese.

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Besonderer Dank geht an Dr. Clare M. Waterman für Mentorship und Diskussionen, Michelle Baird und Mike Davidson für die in diesen Studien verwendet, um viele der fluoreszierenden cDNA-Konstrukte bieten, und Kathryn Applegate und Gaudenz Danuser für plusTipTracker MT-Analyse-Software zu entwickeln. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss zu KAM von der National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) und die National Institutes of Health (NIH). (Zuschuss: 4K22HL113069).

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Mit HUVECs in Morphologie und Migration Experimente. Abbildung lebender Zellen von EB3-markierte MT Wachstumsdynamik innerhalb HUVECs erfordert angemessene und reproduzierbare Zellkulturbedingungen, um zu messen und zu bewerten Veränderungen in MT Wachstum und HUVEC Morphologie, so dass sie dann zu einem ECM-Signalisierungs Cue zugeordnet werden. HUVECs stellen ein hervorragendes Modell der Zellform und Beweglichkeit für das Studium. Sie sind sehr zugänglich für die Transfektion mit fluoreszenzmarkierten cDNAs sie dramatische Morphologien als Reaktion auf sowohl lösliche als auch physikalische Signal Cues aufweisen, und sie behalten die Fähigkeit , sich in vaskuläre Röhren zu organisieren , wenn 65-70 geeignete Zellkulturbedingungen zur Verfügung gestellt. Primäre Zellkulturen, wie HUVECs, erfordern eine sorgfältige Handhabung und Überwachung von Zellpassage Nummer, um die Zellen gesund sind, um sicherzustellen, und dass sie sich verhalten normalerweise während der Experimente. Wenn beispielsweise die Durchführung von Experimenten untersucht cytoskeleton und / oder die Zellmorphologie, HUVECs sollte nicht für Experimente über den zehnten Zellkulturdurchgang verwendet werden, wie HUVECs typischerweise beginnen ungleichmäßigen Morphologien herum Passage zwölf bis fünfzehn anzuzeigen. Zelldichte ist auch ein kritischer Regulator der HUVEC Gesundheit und Proliferation. HUVEC Verzweigung Untersuchungen (siehe Protokoll 10,1-10,4 oben) verwenden relativ niedrige Zelldichte Kulturen, um die Zellen physischen Raum zu schaffen, mit ihren ECM zu interagieren und verzweigte Vorsprünge zu verlängern. Im Gegensatz dazu ist der Migrationsforschung in der Wundrand (siehe Protokoll 10,5-10,8), HUVECs sind Kultur in einer Monoschicht vor der Verletzung. Als solche Wundrand HUVECs eine relativ unverzweigten Morphologie zeigen, erstrecken sich Kantenvorsprüngen führt, und zeigen Zell-Zell-Interaktionen mit ihren unmittelbaren Nachbarn, wie sie in die Wunde wandern. Caveats und Vorteile von Tracking-MT Dynamics in Wohn HUVECs. Spinning Disk-Mikroskopie ist ein ausgezeichneter Ansatztesten experimentelle Hypothesen, die konfokale Bildklarheit mit hoher Zeitauflösung erfordern. Mit der entsprechenden Kamera und Lasermodul dieser Mikroskopie Ansatz ist empfindlich gegenüber niedriger Emission Fluoreszenz und kann in reduzierten Photobleaching im Vergleich zu anderen Arten von Fluoreszenzmikroskopie unterstützen. Wichtig ist, dass dieser Ansatz auch gut für mittlere bis hohe Zeitauflösung Bildgebung geeignet, da zur Erzeugung umfassende Messungen von MT Wachstumsdynamik mit dem EB3 Label-Ansatz, in einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen erforderlich ist. Während die EB3 Methodik zur Etikettierung wachsenden MT Plus-Enden deutliche Vorteile gegenüber anderen Methoden der Fluoreszenzmarkierung MTs aufweist, hat es auch eindeutige Nachteile auf. Zum Beispiel gibt es einen Anteil des MT - Array , das zu einem gegebenen Zeitpunkt nicht aktiv wachsenden wird einschließlich sowohl der Population von Auseinanderbauen MTs und der Population von stabilen, nicht-dynamischen MTs 71-74. EB3 würde diese zwei Populationen von MTs nicht beschriften undDaher ist der Beitrag dieser beiden Populationen nicht in experimentellen Datenanalyse einbezogen werden. Alternative Methoden für die gesamte MT Array Auswertung wurden auf die Expression von fluoreszenzmarkierten Tubulin fokussiert, die in allen Populationen von MTs enthält und ermöglicht Identifizierung wachsen, schrumpfen, und stabile MTs. Jedoch wegen der relativ hohen Dichte des MT-Array in der Nähe der Mitte der Zelle und neben dem Mtoc (MTOC), das gesamte MT-Array Markierung erzeugt ein Nachteil bei der Durchführung der Bildanalyse von MT Enden, die nicht in der Nähe der Zelle Peripherie 75-77. Experimente unter Verwendung von Zweifarben - co-Markierung von MTs mit fluoreszierenden Tubulin und fluoreszierende EB3 in lebenden Zellen haben gezeigt, qualitativ, dass die überwiegende Mehrheit der Tubulin-markiertem MTs auch EB3-markiertes 78. Darüber hinaus hat es kein effizientes Verfahren zur automatischen Verfolgung von MTs mit fluoreszierenden Tubulin markiert worden. Dies bedeutet, dass die Daten KollHand Verfolgung einzelner MTs tion und Messungen der MT Dynamik in Zellen benötigen fluoreszierendes Tubulin exprimieren, ein Prozess, fehleranfällig und mühsam ist. Als Ergebnis hat die automatisierte Computeranalyse von EB3 markiertem MTs die bevorzugte Methode werden zur Messung MT Dynamik wie es Dynamik MT Experimente angewendet werden kann auf zahlreiche Zelltypen und in einer Vielzahl von experimentellen Regimen 35,79. Die Verknüpfung MT Wachstumsdynamik zu HUVEC Morphologie und Migration. Aus der Sicht eines Zytoskelett Ermittler, eine äußerst nützliche Anpassung der plusTipTracker automatisierten Tracking-Analyse ist die Fähigkeit, sowohl ganze Zelle und regionale Veränderungen in MT Wachstumsdynamik zu messen und zu bewerten. Die Anforderung für eine Zelle polarisiert zu werden, ist eine wesentliche Voraussetzung für die Richtungszellmigration. Als solche haben polarisierte Signal Cues lange Schlüsselfaktoren für die gerichtete Zellmigration bekannt 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. Beispielsweise lösliche Signalmoleküle wie VEGF Aktin - Polymerisation und MT Wachstum in Richtung der VEGF cue in endothelialen Zelltypen 2,82-87 induzieren. Zusätzlich kann in Reaktion auf physikalische Wechselwirkungen mit dem ECM (beispielsweise Compliance und Dimensionalität mechanosensing) modulieren HUVECs ihre MT Dynamik durch örtliches Regulieren MAPs MT Wachstum zu fördern verzweigten Vorsprünge innerhalb verlängernden, und dies dient HUVEC Migration in Richtung der Führung Stichwort 5,31,88. Somit Polarisation in Reaktion auf extrazelluläre Signalisierungs cues unterstreicht die Notwendigkeit für experimentelle Bewertung von lokalisierten Veränderungen in Zytoskelett-Dynamik. Gleichzeitige Live-Cell-Imaging von MT Wachstumsdynamik (mit dem EB3-Ansatz) und HUVEC Zellmigration ist extrem schwierig durchzuführen, weil MTs auf einer Zeitskala von Sekunden wachsen, während Veränderungen der Zellmorphologie und gerichtete Migration auf einer Zeitskala von Stunden auftreten. Doch beide Prozesse sind eng LINKEd. Außerdem führt kontinuierliche, schnelle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten EB3 auf der zweiten Zeitskala des EB3 Signal Photobleaching. Versuche, dieses Problem zu überwinden, indem kurze Abbildungsreihe EB3 (1-2 min Akquisitions Serie) alle 30 Minuten waren erfolgreich leitend, jedoch nur in einer kleinen Anzahl von ECs erreicht werden könnte, der eine optimale Expression EB3 hatte und daß keine nachteiligen haben anzuzeigen Auswirkungen auf wiederholte Laserbeleuchtung 5. Ein alternativer Ansatz, der für Interpretationen , wie MT Wachstumsdynamik beitragen zu Veränderungen der Zellmorphologie und Migration ermöglicht die plusTipTracker Region of Interest (ROI) Werkzeug 35 (siehe Protokoll 6.6). Diese Methode ermöglicht eine ganze Zelle MT Wachstum Spuren unterteilt in benutzerdefinierten Regionen zu sein, von dem Spuren MT Wachstum können dann extrahiert und analysiert werden. Beispielsweise Vergleiche von &quot;verzweigten&quot; versus &quot;nicht verzweigte&quot; Regionen der Zelle haben gezeigt, dass mehr MTs s wachsenNiedrigen und persistent innerhalb verzweigten Regionen im Vergleich zu dem nicht verzweigten Zellperipherie 5. In polarisiert Wundrand HUVECs, Vergleiche der Vorderkante und Hinterkante Wachstumsdynamik MT zeigte, dass MCAK-induzierte MT Demontage innerhalb der Vorderkante spezifisch gehemmt wird, aber nicht die Hinterkante. Regional Bewertung der Vorder- und Hinterkante MT Wachstumsdynamik in HUVECs exprimierenden Rac1 und / oder Phosphorylierung Mutanten von MCAK ergab ferner, dass Rac1-induzierte Aktivierung von Aurora-A-Kinase gezielt und lokal MCAK Aktivität innerhalb der Vorderkante verhindert HUVEC Polarisation und gerichtete Migration zu fahren 31. So hat die Kombination von automatisierten Verfolgung von MT Wachstumsdynamik und regionale Bewertung der MT Wachstumsdynamik innerhalb der verzweigten Vorsprünge und / oder der Vorderkante der Wundrand HUVECs erlaubt uns MT Wachstumsdynamik zu HUVEC Morphologie und Migration zu verknüpfen. Die Protokolle beschrieben sind designed, um eine im Allgemeinen einfach und hoch reproduzierbare Methodik für HUVEC Kultur und experimentelle Untersuchung. Dennoch sind viele der Protokolldetails komplex und zeitaufwendig, was sich wiederum Gelegenheit für Fehler oder Schwierigkeiten stellt die experimentelle Methodik in der Durchführung. Während es wurde versucht, mögliche Probleme während des gesamten Protokolls, hier ist eine zusätzliche, detaillierte Fehlersuche von möglichen Problemen zur Verfügung gestellt, die weniger verbreitet sind oder in anderer Weise als Noten innerhalb der Methodik Protokolle abgekürzt. Bezogen auf Beschichtung Deck mit Polyacrylamid-Substrate (Protokoll 2.2), ein häufiges Problem, das Glasplättchen der Aktivierung ist die komplexe Natur entsteht, Kupplung Polyacrylamid auf das Glas, Aktivierung Polyacrylamid und dann ECM Kopplung mit dem Polyacrylamid. Ein besonders schwierig und möglicherweise problematischen Schritt wird die Kultivierung HUVECs auf die Fibronektin / Polyacrylamid-Gel nach der Exposition des polyacrylamide-beschichtete Deckgläser bis 2 mM Sulfo-SANPAH (Schritt 2.2.2.6, oben). Es ist entscheidend für den Erfolg von HUVECs auf diesen Substraten die Kultivierung, die Sulfo-SANPAH vollständig aus dem experimentellen System folgende ECM Konjugation entfernt werden. Dies kann am besten dadurch erreicht , mit ddH 2 O Waschen und Inkubation der Deckgläser in ddH 2 O auf einem über Nacht Schüttler. Wenn Zellen, die auf den Polyacrylamid ECMs nicht überleben, oder wenn die Lebensfähigkeit geringer ist als erwartet, erhöht, und wiederholtes Waschen von Sulfo-SANPAH nach Konjugation an Fibronektin (Schritt 2.2.2.9) empfohlen wird, um potenziell dieses Problem lindern. Verwandt Protocol 3 (cDNA-Transfektion und HUVEC Kultur auf einem Deckglas), ist ein großer Einfluss auf den Erfolg der Elektroporation Verfahrens die Handhabung der HUVECs sowohl während Trypsinisierung der Zellen sie aus dem Kunststoffkolben zu entfernen, und nach Abschluss die Elektroporation (Schritte 3,3-3,4, oben). Es ist wichtig, zu kümmernvollständig die HUVECs überwachen, während in Trypsin und nicht die Zeit für die Zellen &quot;round-up&quot; auf der Oberfläche des Kolbens (typischerweise 1-2 min) erforderlich, um nicht überschreiten. Zu viel Zeit in Trypsin ist eine Hauptursache für Tod HUVEC, die typischerweise nicht realisiert ist, bis die Zellen an Fibronektin-beschichtete Deckgläser plattiert sind (Schritt 3.4) und sie dann nicht an dem Substrat zu befestigen. Von ähnlicher Bedeutung, HUVECs (und die meisten primären Zelltypen) nicht gut gehen, wenn für lange Zeit in der Elektroporation Puffer suspendiert. Bei größeren Maßstab Experimenten beispielsweise, wo der Benutzer über fünf oder mehr Bedingungen, die Elektroporation erfordern, ist es besser, um die Zellen in einzelnen Rohren (1 Röhrchen pro Transfektion) pelletiert halten und sie zu mischen, one-at-a-time , in der Elektroporations-Puffer unmittelbar vor der Elektroporation. Dieser Ansatz minimiert Inkubationszeit in Elektroporationspuffers und maximierte HUVEC Überleben. Zusätzlich sofortige Rettung in kompletten Kulturmedien ist auch crtische nach der Elektroporation. Rettungs Verzögerungen von einer Minute oder mehr nach der Elektroporation kann in nahezu vollständigen HUVEC zum Tod führen und sollte daher vermieden werden. Verwandte Zellmigrationsassay (Protocol 9), die Technik der HUVECs mit extrem hoher Dichte Züchten hängt von einer kritischen Änderung (in Schritt beschrieben 9.2) der traditionellen HUVEC-Zellkulturmethode (beschrieben in Protocol 3), das Trocknen des mit Fibronectin beschichteten Deckglas erfordert um HUVEC Kultur in einen sehr kleinen Bereich des Deckglases zu ermöglichen. Oft, wenn das Deckglas nicht vollständig getrocknet wird, oder wenn die vorherige Beschichtung des Deckglases mit Fibronectin (Schritte 2.1 oder 2.2) nicht effizient, die Medien-enthaltenden Zellen, die auf dem Deckglas platziert wird ihre Oberflächenspannung zu verlieren und um die erweitern Kanten des Deckglases, die Dichte der Zellen auf dem Deckglas, dadurch verringert wird. Eine Methode, dieses potentielle Problem zu beheben, ist das Medium aus dem Deck abzusaugen und dannStellen Sie das Deckglas (noch in den 35-mm-Schale) in die Rückseite des Biosicherheitsschrank für 5-10 min. Diese Anpassung kann dazu beitragen, den Luftstrom innerhalb des Gehäuses zu ermöglichen, in das Trocknen der Schüssel zu unterstützen. Wenn sichtbare Flüssigkeit auf dem Deckglas nach dem Lufttrocknen bleibt, aspirieren die Flüssigkeit Flecken und wieder an der Luft trocknen für 5-10 zusätzliche min im Biosicherheitsschrank ermöglichen. Es ist wichtig zu beachten, dass es keine Möglichkeit gibt, vollständig dieses potentielle Problem zu vermeiden, aber es ist weniger geworden ein Problem mit wiederholten Praxis des Protokolls. Es ist auch eine Fehlerbehebung Empfehlung, dass, wenn Deck für die Zellmigration Assay (oder einem Test im Allgemeinen) die Vorbereitung, extra Deck vorzubereiten und haben extra HUVECs ready-to-go im Falle von Problemen auf dem Weg. Mit diesen Problem Überlegungen im Auge, ist es auch wichtig, den Nutzen der Protokolle zu markieren diskutiert und deren Auswirkungen in Zukunft Zellbiologie Forschung. Die Anwendbarkeit auf die polyacrylamid Ansatz ist breit gefächert und umfasst nicht nur zweidimensionale Studien der zell ECM Eingriff (oben beschrieben), sondern auch dreidimensionale Untersuchungen 5. Diese Anwendung ist entscheidend für die Erhöhung unser Verständnis, wie HUVECs Zellform und Migration in physiologischen Umgebungen zu regulieren und sollten Ermittler ein grundlegendes Verständnis dafür, wie morphologische Veränderungen koordiniert mit Zytoskelett-Veränderungen. Während die hier beschriebenen Protokolle auf Messungen der MT Wachstumsdynamik fokussiert sind, kann die Mehrzahl der Protokolle und sollte eine beliebige Anzahl von anderen mikroskopisch meßbaren Aspekte der zell ECM-Wechselwirkungen zu messen angepasst werden. Bezüglich MT Dynamik gibt es zahlreiche MAPs, einschließlich mindestens 14 Familien von kinesins 89, die jeweils mit einem potentiellen Beitrag zu einer HUVEC Polarität und gerichtete Wanderung und alle , die unter Verwendung der vorgestellten Protokolle untersucht werden können. Zukünftige Untersuchungen sollten einelso an Engagement zell ECM im Vergleich zu Krankheitszuständen in normalen ausgerichtet sein. HUVEC Protokolle hier vorgestellten sind anwendbar auf Untersuchungen der normalen vaskulären Homöostase Prozesse sowie Krankheitszuständen, einschließlich Herzerkrankungen, Retinopathie, Tumorwachstum und Metastasierung, um nur einige zu nennen. Konjugieren sichtlich transparent ECMs und Polyacrylamid Substrate zugänglich Einhaltung Mikroskopische Untersuchungen zum Eingriff Studien zell ECM solchen Gefäßangiogenese überwacht dass endothelial Zelle mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung werden können. Diese Arten von experimentellen Ansätzen bereits offenbaren wichtige Unterschiede in endothelialen Zellform, Polarität, die Migration und die Wirkungen von Proteinen begonnen, die diese Prozesse 5,31,90 regulieren. Künftige Anstrengungen sollten zu identifizieren wollen, wie die Kombination von ECM-Compliance und Dimensionalität mechanosensing lokal Kontrollproteine ​​dienen können, die gezielt und Zytoskeletts regulieren.

Die Angiogenese wird durch extrazelluläre Signal Cues ausgelöst, die Endothelzellen (ECs) fördern zu polarisieren, wandern mit Richtungs Spezifität und neue Gefäße in Gewebe bilden, die Blutversorgung. Dazu tragen gedacht, um die Angiogenese fahren sind Signale von der extrazellulären Matrix (ECM). Als Reaktion auf körperliche Signale erstrecken ECs neue Zweige mit Richtungsspezifität Richtungsbewegung in die Bildung des vaskulären Netzwerks 1,2 zu führen. Die Architektur der EG - Morphologie und Verzweigung wird durch lokale Regelung der Mikrotubuli (MT) Zytoskelett in einer Weise definiert , die mit der Regulierung von ACTO-Myosin Kontraktilität 3 koordiniert wird. Damit Zweige EG, Myosin-II lokal herunter reguliert werden müssen , zu bilden, was zu einer lokalisierten Membranausstülpungen 4. Zur gleichen Zeit und am gleichen Ort innerhalb der Zelle geworden MT Wachstumsdynamik verändert in langsame und anhaltende MT Wachstum resultierende Zweig elon zu fördernsuchung und Stabilität 5. Diese koordinierte Zytoskelett-Regelung erlaubt ECs ihre Morphologie zu polarisieren gerichtete Migration zu erleichtern. Die Entwicklung eines polarisierten Zellmorphologie erfordert polarisiertem MT Anordnung 6. In der Migration Epithelzellen wachsen MTs langsam und beharrlich speziell an der Vorderkante der Zelle 7-9; während in Neuronen erfordert die Initiierung und Dehnung von Axonen und Dendriten , dass MTs nicht nur vorhanden sind, sondern dass sie durchlaufen dynamisch die Prozesse der Montage und Demontage 10-15. Auf diese Weise lokalisierte Steuerung der Wachstumsdynamik MT bestimmt die Architektur der Zelle und ermöglicht eine schnelle Remodellierung der Zellmorphologie als ECs durch ihre ECM navigieren. MT Wachstumsdynamik von Familien von molekularen Motorproteinen und nicht-Motorproteine ​​reguliert werden, sogenannte Mikrotubuli assoziierte Proteine ​​oder Mikrotubuli interagierender Proteine ​​(von nun an RefeRred als MAPs). MAPs kann vor Ort aktiviert oder inaktiviert werden, in der Regel durch Signalkaskaden an der Zell-ECM - Schnittstelle 16,17 initiiert. Sobald er aktiv ist, MAPs Funktion zum MT durch die Bindung und die Kinetik der MT Montage und Demontage zu verändern; dadurch funktioniert lokal MT Dynamik regeln , um 18 bis 20 Zellform und Polarität zu fördern. Mitotischen Zentromer Assoziierte Kinesin (MCAK) ist ein Kinesin-13 Familie MAP , die 21-23 MT Demontage MT Enden und Paare ATP - Hydrolyse bindet. Diese funktionelle Rolle von MCAK ist bekannt in der mitotischen Spindel 24-28 kritisch zu sein, wie auch während der Inter 29,30. Innerhalb der Interphase ECs wird MCAK-vermittelte MT Demontage durch lokalisierte Aurora-A induzierte Phosphorylierung von MCAK als Reaktion auf Wundrand induzierte Aktivierung des Rac1 kleine GTPase geregelt. Das Ergebnis dieser Signalkaskade ist die Hemmung der MCAK an der Vorderkante von ECs, was zu polarisiertem MT Wachstum in Richtung leading Rand und MCAK-induzierte MT Demontage an der Hinterkante von 31 ECs migrieren. Traditionelle Methoden zur MT Wachstumsdynamik Messung haben typischerweise Handverfolgung entweder fluoreszierend markierten Tubulin oder, in jüngerer Zeit, fluoreszenzmarkierte MT End binding protein 1 oder 3 (EB1 oder EB3, respectively) verwendet. Der fluoreszierende Tubulin Ansatz hat den Vorteil, dass der gesamte MT Array Beschriftung. Da jedoch die meisten mitotischen Zelltypen eine radiale Anordnung von MTs während der Inter 8,32,33, MTs in der Nähe der Zentrosomen halten sind sehr dicht, und als Ergebnis, MT Wachstum und Abbau mit fluoreszierenden Tubulin Tracking ist in der Regel auf die Umfangs begrenzt Regionen der Zelle. Aufgrund dieser Einschränkungen, die Verwendung von fluoreszenzmarkierten EB-Proteine ​​(EB1 oder EB3) die häufigere Ansatz MT Dynamik zu messen war. Denn nur EBs die wachsenden Plus-Enden von MTs beschriften, erscheinen sie als kleine (1-3 &amp; mgr; m), hell fluoreszierende komments, also mit sehr begrenzten Hintergrundfluoreszenz 34-37 eine leicht unterscheidbare Marker der MT Polymerisation bereitstellt. Während die Tatsache, dass nur EBs Etikett eine Teilmenge des MT-Array eine große Stärke des Ansatzes EB darstellt, auch sie eine wichtige Einschränkung betont werden, dass nicht wachsenden MTs nicht vom EB3 Ansatz gekennzeichnet. Dennoch ist die Fähigkeit zu messen und EB3 Kometen im Laufe der Zeit zu verfolgen und MT Wachstum innerhalb subzellulärer Regionen zu visualisieren machen diesen Ansatz ideal für Anwendungen, die regionale Auswertung der MT Organisation erfordern. Eine andere kritische Einschränkung der herkömmlichen Methoden zur Messung MT Wachstumsdynamik hat sehr große Datenmengen, und die Zeit für die Datenanalyse erforderlich. Diese Einschränkung ergibt sich aus der Notwendigkeit, das Handtracking von Hunderten von EB Kometen mit hoher Zeitauflösung. Darüber hinaus müssen diese Messungen in einer statistisch signifikanten Anzahl von Zellen und auch unter einer Vielzahl von Steuer- und Experime durchgeführt durchgeführt werdenntal Bedingungen. Vor kurzem haben diese Einschränkungen durch rechnerische Analysetechniken überwinden speziell bei Tracking EB3 Kometen mit Zeitraffer-Mikroskopie in lebenden Zellen 35 gerichtet. Bei richtiger Anwendung dient diese Rechenansatz sowohl das Potential für menschliche Fehler, die mit der Hand-tracking zusätzlich zur Bereitstellung eines Hochdurchsatzverfahren zur Messung der MT Polymerisation beschränken. Rechnerische Analyse von MT Dynamik der MATLAB-basierten Software - Paket, plusTipTracker, ermöglicht Messungen von MT Wachstum von fluoreszenzmarkierten EB3 Kometen 5,31,35,38 Tracking. Zusätzlich ermöglicht plusTipTracker Software zur Berechnung von Katastrophenereignisse MT (aka Demontage) , basierend auf dem Verschwinden des EB3 Kometen in einem wachsenden MT Spur und ermöglicht subzellulären (aka regional) Analyse der MT Wachstumsdynamik innerhalb benutzerdefinierten interessierenden Bereiche . Für unsere Studien wurden MT Wachstumsdynamik im Vergleich innerhalbverzweigte Regionen im Vergleich zu nicht-verzweigte Regionen oder im Vergleich zu Hinterzellkanten innerhalb führt. Datenausgabe von plusTipTracker Software kann auch farbcodierte Spur Overlays für einzelne Zellen verwendet werden und subzellulären Regionen zu generieren. Hier beschreiben wir die Methode, nach der die Rolle der MCAK untersuchen bei der Modulation der Dynamik MT Wachstum und den Beitrag dieses MT Depolymeraseaktivität zur Regulierung der EG-Morphologie und gerichtete Migration Verzweigung. Unser Ansatz verwendet, um einen primären humanen Zelllinie, menschliche Endothelzellen aus der Nabelvene (HUVECs), die leicht kultiviert werden und sehr zugänglich für die Elektroporation-induzierte, transiente Transfektion von Plasmid-cDNA. Wir haben dann verwendet hochauflösende, Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von HUVECs mit MT End transfizierten Protein Binding 3 (EB3) und mitotischen Zentromer Assoziierte Kinesin (MCAK) -spezifischen cDNA-Konstrukte Auswirkungen auf MT Dynamik zu bewerten HUVECs transfiziert. PlusTipTracker-basierte Rechenbildanalyse von EB3-markierten MT Plusenden war MT Wachstumsgeschwindigkeiten und MT Wachstum Lebensdauer im Zeitraffer Bilder, zu messen und zu vergleichen Effekte der experimentellen Manipulationen auf MT Wachstumsdynamik zu messen. Diese Methodik ermöglicht die Untersuchung der Dynamik MT und der Identifizierung, wie lokalisierte Regulierung der MT Dynamik innerhalb subzellulären Regionen trägt zu den angiogenen Prozessen der EC Verzweigung und Migration. Diese Techniken sind für Untersuchungen von jeder Karte, die fluoreszenzmarkierten und ausgedrückt in lebenden Zellen werden kann.

<table><tbody><tr><td>Aurora A Inhibitor I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>2%ige Bis-Lösung</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyltrimethyloxysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm Hochleistungs-MLC400-Laserkombiniermodul</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; Maus-IgG-Immunpräzipitationskügelchen,</td><td>TrueBlot-Reagenzien; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&ndash; Kaninchen-IgG-Immunpräzipitationskügelchen,</td><td>TrueBlot-Reagenzien; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50M, DAPI-ET Emissionsfilter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Emissionsfilter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Emissionsfilter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Emissionsfilter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbuminfraktion V</td><td>RPI Products</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Clara gekühlte Kamera für ladungsgekoppelte Geräte</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Esel Anti-Kaninchen</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 Anti-Ratte</td> <td>für ZiegenJackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Versorgung & Wachstumsfaktoren (Inhalt unten gezeigt)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderhirnextrakt 2,0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycinsulfat 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10.000 IE Pen/ml, 10.000 &#181; g Streptokokken/ml)&nbsp; 10,0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Elektronischer Verschluss</td><td>Sutter Instrument</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Proteasehemmer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP Anti-Maus für Ziegen</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP für Ziegen gegen Kaninchen</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot PVDF Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Tisch</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Maus anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Maus anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Tubulin (DM1A)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Enthält den Elektroporationspuffer</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 I.E. Pen/ml, 10.000 &#181; g Strepto/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Rohre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti&ndash; pT288&ndash; Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti&ndash; &alpha;-Tubulin</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumborhydrid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Spinnscheibe&nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemilumineszenz-Substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

hochauflösende zeitraffer-imaging und automatische analyse von dynamik der mikrotubuli in lebenden menschlichen endothelzellen aus der nabelvene

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Der physiologische Prozess, durch den sich aus bestehenden Gefäßen neue Gefäße bilden, erfordert spezifische Signalereignisse, die morphologische Veränderungen innerhalb einzelner Endothelzellen (ECs) auslösen. Diese Prozesse sind entscheidend für die homöostatische Erhaltung, wie z. B. die Wundheilung, und sind auch entscheidend für die Förderung des Tumorwachstums und der Metastasierung. Die EC-Morphologie wird durch die Organisation des Zytoskeletts definiert, ein streng reguliertes System der Aktin- und Mikrotubuli (MT)-Dynamik, von dem bekannt ist, dass es die EC-Verzweigung, Polarität und Richtungsmigration, wesentliche Bestandteile der Angiogenese, steuert. Um die Dynamik der MT zu untersuchen, verwendeten wir hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie in Verbindung mit einer computergestützten Bildanalyse von fluoreszenzmarkierten MT-Plus-Enden, um die Dynamik des MT-Wachstums und die Regulation der EC-Verzweigungsmorphologie und der Richtungsmigration zu untersuchen. Eine Zeitraffer-Bildgebung von lebenden humanen Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurde nach der Transfektion mit fluoreszenzmarkierten MT End Binding Protein 3 (EB3) und Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-spezifischen cDNA-Konstrukten durchgeführt, um die Auswirkungen auf die MT-Dynamik zu bewerten. Die PlusTipTracker-Software wurde verwendet, um EB3-markierte MT plus-Enden zu verfolgen, um die MÜ-Wachstumsgeschwindigkeiten und die Lebensdauer des MT-Wachstums in Zeitrafferbildern zu messen. Diese Methodik ermöglicht die Untersuchung der MT-Dynamik und die Identifizierung, wie eine lokalisierte Regulation der MT-Dynamik in subzellulären Regionen zu den angiogenen Prozessen der EC-Verzweigung und -Migration beiträgt.

HUVEC Kultur für Lebendzell-Mikroskopie Abbildung lebender Zellen von HUVECs fluoreszierende Proteine ​​exprimieren erfordert , dass HUVECs werden in einer Umgebung gehalten , die geeignet ist für normales Zellwachstum und Wartung, sowie normale Protein - Expression und Funktion. 1 zeigt eine schematische Darstellung des Protokoll eine gepufferte vorzubereiten verwendet und geschlossenes System, das für das Sammeln von optischen Eigenschaften optimiert Zeitrafferbilder von lebenden Zellen aufrecht erhält. Dünne Streifen von doppelseitigem Klebeband werden auf einen Glasobjektträger (1A) angeordnet und dann das Deckglas des kultivierten HUVECs enthält , wird auf der Oberseite des Bandes wie beispiels invertiert , dass die Zellen gegenüber dem Schieber (1B). Auf diese Weise stellt das Band eine kleine Lücke zwischen den beiden Glasoberflächen und schafft einen Raum , in dem die Zellen in geeigneten Zellkulturmedium gebadet werden (1C, siehe Protokoll 4, oben). ichna letzten Schritt wird das Deckglas auf dem Glasobjektträger eine abgedichtete Vaseline unter Verwendung: Lanolin: Paraffinwachs (1: 1: 1 - Mischung, VALAP; 1D) ein geschlossenes System zu schaffen. Dieser Zellkulturansatz wurde sowohl für die kürzere Zeitsequenz Abbilden EB3 Kometen und für die längere Zeitsequenz Verzweigungs und Migrationsexperimente verwendet. Zusätzlich kann das wachsartige Konsistenz VALAP zum einfachen Entfernen aus dem Glasobjektträger und Deckglas am Ende eines Abbildungs ​​experimentieren, so daß ergänzende Ansätze einschließlich Fixierung und Immunmarkierung (siehe Protokoll 8) erlaubt, können auf dem gleichen Deckglas und Zellprobe durchgeführt werden, dass wurde mit der Live-Cell-Imaging-Ansatz visualisiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> Abb . 1: Methodology of HUVEC Kultur lebender Zellen mikroskopischen Abbildung (A) Schneiden 2 Stück doppelseitigen Klebebands in 0,65 cm x 2.50 cm rechteckigen Streifen und befestigen ein Stück doppelseitigen Klebebands horizontal entlang der oberen Kante der Folie, und das andere Stück, entlang der Unterkante des Schiebers. Es ist wichtig , eine kleine Menge an Raum zwischen dem Band und dem Schlitten Kante zum Abdichten der Kammer zu ermöglichen , wie in (D) beschrieben. (B) einer Pinzette entfernen Sie die Deck Verwendung enthält HUVECs und invertieren die Deck (Zellenseite nach unten) auf der Oberseite der Bandstücke. (C) mit einer Mikropipette, dann werden 40 &amp; mgr; l von Bildmedien (vollständige endothelialen basalen Medium , das mit 25 &amp; mgr; M HEPES) zwischen dem Deckglas und dem Glasträger. Stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen dem Deckglas und Objektträger vollständig mit Bildmedien und vermeiden Sie Blasen gefüllt ist. Verwenden, um eine Wasserstrahlpumpe entlang der Kante des Deckglases überschüssige Medien zu entfernen, falls erforderlich. (D) Verwenden Sie warmes VALAP (1: 1: 1 Vaseline: Lanolin: Paraffin) um die Ränder des Deckglases zu versiegeln. Überprüfen Sie für Bildmedien Leckages durch leichtes Drücken auf dem Deckglas um. Verwenden Sie zusätzliche VALAP zu beheben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Automatische Verfolgung von EB3 fluoreszenzmarkierten ermöglicht eine umfassende Analyse der gesamten Zelle und regionalen MT Wachstumsdynamik. Die Sammlung von klar, deutlich und sehr Zeit- und ortsaufgelösten mikroskopischen Bildern des EB3 Protein ist auf die Analyse von EB3 Bewegungen innerhalb der Zelle essentiell. HUVEC Expression EB3 fluoreszenzmarkierten variiert von Zelle zu Zelle verbreitet und die Fluoreszenzintensität erhöht typischerweise innerhalb der gleichen Zelle über einen Zeitraum von Stunden. Daher ist es wichtig, diese Veränderungen in der Expression Profil zu identifizieren, um mögliche Auswirkungen der erhöhten EB-Expression auf MT Wachstumsdynamik zu prüfen und zu überwachen. Dies geschieht am besten durch die Auswertung Grau Fluoreszenz intensity Profile für jeden abgebildeten Zelle, und dann die Datenanalyse auf jene Zellen zu beschränken, die einen definierten Bereich von Graustufen-Expressionsprofile anzuzeigen. Erste Bewertung der Expression Profildatensätze ist kritisch und sollte mit MT Wachstumsdynamik Daten verglichen werden, die durch plusTipTracker Software für jede Zelle erhalten wird. Expressionsprofile können gegen MT Wachstumsgeschwindigkeit und MT Wachstum Lebensdauer innerhalb einer experimentellen Gruppe für jede Zelle aufgetragen werden, um den gewünschten Bereich der Graustufendarstellung zu bestimmen und potenzielle Ausreißer zu identifizieren. Abbildung 2 Highlights ein HUVEC auf einem Fibronektin - Substrat kultiviert (siehe Protokoll 2.1, oben) und mit dem Ausdruck in der Nähe von den optimalen Mengen an Mapple-markierten EB3. Fluoreszierende EB3 Kometen sind in einem Zeitraffer-Serie von Bildern über einen Zeitraum von 12 sec (2A) gezeigt. Analyse von EB3 Kometen plusTipTracker Software beinhaltet einen automatisierten, Frame-by-Frame EB3 Komet Dete mitction (grüne und gelbe Punkte, 2B). Kometen innerhalb jedes Rahmens erfasst werden dann verknüpft, abhängig von ihrer Änderung in der Position von Rahmen zu Rahmen, EB3 Spuren und eine visuelle EB3 Spur overlay (2C-F) zu erzeugen. Track-Overlays sind farbcodiert und Farbunterschiede können durch die Parameter vom Benutzer eingegebenen bestimmt werden. Üblicherweise verwenden diese Unterschiede den globalen Mittelwert von MT Wachstumsgeschwindigkeit und das Wachstum MT Lebensdauer 5,31 und teilen damit die Daten in vier Gruppen: langsam und kurzlebig (rot), langsam und langlebig (gelb), schnell und kurz lebte (grün) und eine schnelle und langlebige MT Wachstum (blau; 2G). PlusTipTracker-vermittelte Verfolgung von EB3-markierte MT Wachstumsdynamik ermöglicht auch benutzerdefinierte Regions of Interest (ROIs). PlusTipTracker extrahiert die Spur MT Wachstumsdaten von innerhalb der benutzerdefinierten ROI (2A, B und F), wodurch für den Vergleich von MT Wachstums dynamics in verschiedenen Regionen der gleichen Zelle. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> Abbildung 2: EB3 Komet Erkennung, Verfolgung und plusTipTracker Datenausgang (A) Zeitraffer-Film eines HUVEC exprimieren Mapple EB3.. Linke Seite zeigt eine ganze Zelle Ansicht und ganze Zelle Maske (weiße Linie) Demarkieren die Zellgrenzen. Red Box stellt den gezoomten Bereich in den Zeitraffer-Bilder gezeigt (rechte Felder). Rechts Tafeln zeigen roh Grauzeitrafferbilder von EB3 Kometen in aufeinanderfolgenden Abbildungsrahmen (t = 0 sec - t = 12 sec). (B) Nachweis von plusTipTracker EB3 Kometen aus den Bildern in (A) gezeigt ist . Linke Seite zeigt eine ganze Zelle Ansicht der erkannten Kometen (gelbe Punkte). Red Box stellt den gezoomten Bereich in den Zeitraffer-Bilder gezeigt (rechte Felder). Rechts Platten markieren fünf erkannt EB3 Kometen (rote Pfeile) und Spuren diese fünf Kometen über die 12 Sekunden Abbildungsperiode. Grün<html> dots EB3 Kometen repräsentieren detektiert, der nicht vorhanden war (oder nicht festgestellt wurden) in der vorherigen Zeitintervall. (C) Maximum Intensity Projection von 61 Frames (2 min Film) der EB3 Kometen in (A) gezeigt. (D) plusTipTracker MT Track - Overlay aus den gleichen 61 Frames (2 min Film) in (C) gezeigt. (E) Zoom von Maximum Intensity Projection (roter Kasten in C). (F) Zoom von plusTipTracker MT Track - Overlay von Maximum Intensity Projection (roter Kasten in D). (G) farbkodierte Legende für Track - Overlays in (D) gezeigt , und (F). Bezeichnung als langsam, schnell, kurzlebige oder langlebig ist für alle Wachstumsspuren in einer Gruppe von zehn Mapple-EB3 exprimierenden HUVECs gemessen am Mittelwert berechnet. Zur leichteren Visualisierung Spur Overlays in (D) und (F) werden mit invertierten Pixelintensitäten der Zelle erzeugte Bild in (A) gezeigt ist. Maßstabsbalken = 20 um./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. HUVEC Verzweigung und Muster Migration sind empfindlich Signale aus dem ECM-physikalischen mechano. HUVECs werden auch auf verschiedene Typen von Signalisierungs cues reagieren bekannt und dabei, morphologische Veränderungen unterzogen werden, die eine geeignete zelluläre Antwort auf die bestimmte Signalisierungs cue diktieren (s) 36,40-42. HUVECs kultiviert auf Fibronektin beschichteten Glassubstraten (3A), oder auf steifen 2-dimensionalen Polyacrylamid ECMs (55 kPa) in der Regel eine runde oder längliche Morphologie mit wenigen deutlichen verzweigten Vorsprünge (3B) angezeigt werden soll . Wenn jedoch kultiviert auf sehr weichem 2-dimensionalen Polyacrylamid ECMs (0,7 kPa), HUVECs zeigen eine stark verzweigte Morphologie, die bekannt ist, zur Folge haben Compliance-induzierte nach untenRegulierung der Myosin-II Kontraktilität 4,5,31 (3C). Somit regulieren HUVECs ihre zellulären Morphologie durch ECM mechanosensing, und dies wird durch lokalisierte Modulation der MT Dynamik und acto-Myosin Kontraktilität erreicht. Da HUVECs eine Vielzahl von morphologischen Eigenschaften angezeigt werden, um HUVEC zu messen Verzweigung ist es wichtig, zunächst zu definieren, was eine verzweigte Vorsprung ist, und dann zu bestimmen, wie ein verzweigter Vorsprung objektiv gemessen werden. Eine Technik verwendet eine Vier-Schritt - Ansatz , mit dem ein Zellengrenze oder &quot;Maske&quot; von Hand erzeugt wird , um die Kanten der Zelle Verfolgungs ein Bild einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenzvolumenmarker exprimierenden die Zellränder (3D) zu definieren. Nach Maskenerzeugung, Zweig Ursprünge sind durch Ortung größten Krümmungswinkel zwischen dem verzweigten Vorsprung und dem Zellkörper definiert. Eine Linie wird gezogen DEMArk die &quot;Zweig Ursprung&quot; (lila gewinkelten Linien; Abbildung 3E). Filialnummer wird gemessen , indem einfach die Anzahl der Zweige mit einem definierten Zweig Ursprung zu zählen (Abbildung 3F). Verzweigungslänge wird als der Abstand von dem Verzweigungsursprung zum distalen Verzweigungsspitze (Abbildung 3G) gemessen. Zur Aufnahme von kleinen lamellipodialen Projektionen aus der Datenanalyse, zusätzliches Kriterium vermeiden verlangen , dass Äste müssen länger sein ( &quot;Zweiglänge&quot;) als breit (an der &quot;Zweig Herkunft&quot;), und dass Zweige müssen mindestens zehn Mikrometer lang sein 5 , 31. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . 3: Analyse von HUVEC Verzweigungs Morphologie (A - C) DIC Bild Beispiele von HUVECs kultiviert auf Fibronektin beschichteten Glas ECMs (A) steif (55 kPa) Polyacrylamid ECMs (B) und weiche (0,7kPa) Polyacrylamid ECMs (C). Verzweigung wird in HUVECs kultiviert auf 0,7 kPa Polyacrylamid ECMs (C) im Vergleich zu den steiferen ECMs (A, B) dramatisch zugenommen. (D). DIC mikroskopische Aufnahme (linkes Bild) eines transfizierten HUVEC exprimieren eine Mapple-C1-cDNA-Konstrukt (ein Zellvolumen Marker; rechtes Bild). Definieren (E) Herkunft der Zweig durch den größten Krümmungswinkel Ortung (dh der Position , wo die Membran die größte Krümmung zeigt, purpurfarbene Linien) auf beiden Seiten der Branche und schließen Sie dann die Winkel mit einer geraden Linie (blaue Linien) . (F) Identifizieren und verzweigte Vorsprünge auszuwählen , die erweitern&gt; 10 &amp; mgr; m von der &quot;Zweig Ursprung&quot; (definiert in E). Zählen Sie die Anzahl der verzweigten Vorsprünge, die zu erhalten &quot;Zweignummer.&quot; (G) Messen Sie den Abstand von der Mitte der &quot;Zweig Ursprung&quot; der most distale Spitze der Branche das Linienwerkzeug in der Anwendung Anmerkungen und Messungen mit Hilfe von NIS Elements Software, die zu erhalten &quot;Astlänge.&quot; Maßstabsbalken = 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Zusätzlich zur Erfassungs ECM Compliance HUVECs auch zur Beseitigung von benachbarten Zellkontakte als induziert durch scratch Verwundung erfassen und darauf zu reagieren. Im Migrationstest, in einer Monoschicht kultiviert HUVECs werden einer Kratzwunde ausgesetzt und Migrationseigenschaften gemessen werden (siehe Protokoll 9, oben). Nach der Induktion der Wunde durch die Monoschicht Verkratzen, polarisieren Wundrand HUVECs durch eine protrusive Vorderkante zu entwickeln , die in die Wunde (4A, t = 0 h) erstreckt. Über einen Zeitverlauf von 10-12 h, polarisiert Wundrand HUVECs wandern in den Wundbereich und füllen dieWunde, eine neue konfluenten einschichtigen Aufbau (4A, t = 11 h). Wie bei HUVEC Verzweigung schlägt aktuelle Hinweise darauf , dass Polarisierung und Migration auf die koordinierte Umorganisation des MT und Aktin - Zytoskelett kritisch abhängig ist 43-49. Dies wird dadurch erreicht, teilweise durch lokale Hemmung der an der Vorderkante MT Demontage MCAK induzierten, aber nicht an der Hinterkante des aufgewickelten Kante HUVECs 31. Die Empfindlichkeit der MT Dynamik wundinduzierten Polarisations durch die Rac1 GTPase initiiert wird, die zahlreiche nachgeschalteten Regulatorproteine ​​Ziele, einschließlich Aurora-A-Kinase, die phosphoryliert und hemmt MCAK an der Vorderkante und anderen Kinasen, die fähig sind, zu hemmen oder MAPs aktivierenden lokal MT Wachstum und Schrumpfung 18,31,36,48,50-53 modulieren. Umfangreiche experimentelle Beweise unterstützt die Vorstellung, dass die Koordinierung der Vorderkante Vorsprung und Hinterkante Kontraktion wird durch Zyklen von Rac1 Aktivierung geregeltMT Montage an der Vorderkante und RhoA Aktivierung acto-Myosin Kontraktilität an der Hinterkante, wodurch der Fahrt gerichtet Motilität 9,41,51,52,54-58 zu fördern. Bis heute gibt es keine etablierte Methode für die automatische Verfolgung von Zellmigration durchführen. Dies ist ein Ergebnis von Schwierigkeiten bei der rechenzell ECM Grenzen zu analysieren, die konsequent zu ändern sind als Wundrandzellen polarisieren und zu migrieren. Fluoreszierend markierten Zellen von Tracking - 59-64, die Bevölkerung von fluoreszenzmarkierten HUVECs in Wundrand Migrationsversuche beträgt ca. 30-40% der Gesamt HUVEC Bevölkerung und damit die Mehrheit der Wundrandzellen Während viele Software - Programme in der Lage sind ein Muss werden durch Phasenkontrast oder DIC-Bildgebung sichtbar gemacht. Zusätzlich ist es wichtig, wenn die Migration wundKante Messung fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Zellen innerhalb der gleichen Wunde auszuwerten, um spezifisch zu identifizieren,Auswirkungen der Expressionskonstrukte sowohl innerhalb des experimentellen Studiengruppen und zwischen den experimentellen Studiengruppen. Derzeit ist der beste Ansatz HUVEC Migration zu messen , um eine Hand - Tracking - Ansatz zu verwenden , bei dem ein Wundrand Zelle zunächst identifiziert und dann werden der Kern und Kernkörperchen identifiziert (Abbildung 4B). Der Nukleolus wird als die Position Determinante für die Zellverfolgung verwendet aufgrund seiner hohen Lichtstreuungs Dichte und relativ geringe Größe. Diese beiden Merkmale der Nukleolus machen es leichter zu identifizieren und Messfehler zu reduzieren, indem die Bereichsbegrenzungs in dem der Benutzer einzelne Spurpositionen platzieren. HUVEC Migration Spuren werden dann durch einen Klick auf den Kernkörperchen in aufeinanderfolgenden Zeitraffer-Bildrahmen erzeugt. Schließlich werden Wanderungsgeschwindigkeit und Migrationsdistanz zum Ursprung gemessen und für die Kontrolle und experimentelle Zellgruppen (4B) analysiert. <img alt="Abbildung 4"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot; /&gt; Abbildung 4: Analyse der Wundrand HUVECs und Migration Tracking (A) 20X Phasenkontrast - Bilder einer 11 h Zeitraffer-Imaging - Serie von Grund auf neu Wundrand HUVECs (auch bekannt als &quot;Migration Assay&quot;).. Die Wunde und die Richtung der Migration in das Panel t = 0 h angegeben. HUVECs werden gezeigt, um die Wundkante und vorab in die Wunde zu durchqueren, bis eine Monoschicht von Zellen gebildet wird (t = 3,5 h - t = 11 h). (B) Analyse der Migrationstest Zeitraffer - Bildgebung (wie in A gezeigt) erfordert zunächst die Identifizierung einer verfolgbaren HUVEC Wundrand basierend auf Zellenposition (dh Zellen physisch am Rand der Wunde) und Expressionsprofil (d .h. wählen Sie eine grüne Zelle Wundrand , wenn das Experiment Expression von GFP beinhaltet). Mit dem Phasenkontrastbild, identifizieren den Kern und die Kernkörperchen. Hand verfolgen die Kernkörperchen in aufeinanderfolgenden Zeitraffer-Bilder, die eine Verwendung vonAnwendung Notationen und Messungen in NIS Elements Software Wanderungsgeschwindigkeit und den Abstand zum Ursprung zu bestimmen. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m (A), 20 &amp; mgr; m (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Protokolle für die Kultur humaner Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), die transiente Transfektion von fluoreszenzmarkierten Markern des Mikrotubuli-Wachstums, die Bildgebung lebender Zellen und die automatisierte Analyse der Wachstumsdynamik von Mikrotubuli zwischen den Phasen werden detailliert beschrieben.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane Endothelzellen aus Nabelvenen zu kultivieren und die Dynamik des Cytoskeletts sowie die Zellmigration mittels Zeitrafferaufnahmen lebender Zellen zu analysieren. Die in diesem Video beschriebenen Methoden können helfen, zentrale Fragen auf den Gebieten der Zell-, Molekular- und Mechanobiologie zu beantworten. Beispielsweise kann dieses Protokoll verwendet werden, um zu untersuchen, wie die Zellform und Motilität durch die Bindung an verschiedene ECMs moduliert werden.Die visuelle Demonstration ist entscheidend, da die Probenvorbereitungsschritte schwierig durchzuführen sind. Sie erfordern eine präzise Handhabung der Zellen innerhalb eines engen Zeitrahmens während des gesamten Verfahrens. Obwohl diese Methode Einblicke in die Motilität endothelialer Zellen während der Angiogenese ermöglichen kann, ist sie ebenso auf mikroskopische Untersuchungen praktisch jedes adhärenten Zellmodellsystems anwendbar.Mit einer Pinzette eine Deckglas aus einem Aufbewahrungsgefäß mit 100 % Ethanol entnehmen und zur Sterilisation durch eine Bunsenbrenner-Flamme führen. Anschließend in eine 35-Millimeter-Petrischale legen. Für jede Probe ein Deckglas vorbereiten.In eine 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenprobe geben Sie 10 Mikroliter einer 1 Milligramm pro Milliliter Fibronectin-Grundlösung und 990 Mikroliter PBS. Pipettieren Sie anschließend 250 Mikroliter der Lösung auf jedes Deckglas. Verteilen Sie die Lösung gleichmäßig, um die Oberfläche vollständig zu bedecken.Die Deckgläser mindestens drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Vor der Verwendung jedes Deckglas dreimal mit je zwei Milliliter PBS spülen. Mithilfe eines Hämozytometers die Anzahl der kultivierten HUVECs bestimmen und ein Volumen, das 100.000 Zellen pro Deckglas für Nicht-Migrations-Experimente oder 500.000 Zellen pro Deckglas für Migrations-Experimente enthält, in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.400 × g für vier Minuten, um sie zu pelletieren. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie bis zu einer Million Zellen pro zu testendem Ansatz in 100 µL Elektroporationspuffer und mischen sie mit einem Mikrogramm cDNA. Überführen Sie die Zellen in eine Elektroporationsküvette.Transfizieren Sie die Zellen und die DNA-Mischung mithilfe des für die HUVEC-Elektroporation vorgesehenen Programms. Danach retten Sie die transfizierten Zellen, indem Sie 500 Mikroliter komplettes endotheliales Basalmedium hinzufügen. Anschließend geben Sie das geeignete Zellvolumen auf fibronectinbeschichtete Deckgläser. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für drei bis vier Stunden, um Zeit für die Expression der cDNA-Konstrukte zu schaffen. Bereiten Sie die Bildgebung vor, indem Sie zwei Streifen doppelseitiges Klebeband mit einer Größe von 2,5 Zentimetern mal 0,65 Zentimetern nehmen und diese horizontal entlang der oberen und unteren Kante eines sauberen Objektträgers befestigen. Beachten Sie, dass es wichtig ist, einen kleinen Zwischenraum zwischen dem Klebeband und der Kante des Objektträgers für die Abdichtung der Kammer freizulassen.Platzieren Sie die Deckglaszelle mit der Zellseite nach unten, sodass die beiden Kanten des Deckglases auf dem Klebeband aufliegen. Drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette, um das Deckglas zu befestigen. Geben Sie mithilfe einer Mikropipette 40 µL Imaging-Medium zwischen Deckglas und Objektträger.Stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen Deckglas und Objektträger vollständig mit dem Abbildungsmittel gefüllt ist. Tupfen Sie gegebenenfalls überschüssiges Medium mit einem Papiertuch ab. Versiegeln Sie alle Kanten des Objektträgers mit warmer VALAP.Überprüfen Sie auf Leckagen, indem Sie vorsichtig auf die Glasdecke drücken. Platzieren Sie die montierte und versiegelte Deckglaspräparation auf einer Mikroskopbühne, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt ist. Erfassen Sie mit einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop Zeitrafferaufnahmen, Bilder des blauen fluoreszierenden Proteins und DIC-Aufnahmen.Analysieren Sie die Mikrotubulusdynamik und die Ko-Lokalisation wie im beigefügten Dokument beschrieben. Um einen Zellwanderungs-Assay durchzuführen, nach dem Elektroporations-Schritt, heben Sie die transfizierten Zellen an, indem Sie 80 Mikroliter vollständiges endotheliales Basalmedium hinzufügen. Pipettieren Sie dann die gesamte 80-Mikroliter-Probe als einen einzigen Tropfen in die Mitte einer getrockneten, fibronectinbeschichteten Deckglasoberfläche.Den Tropfen nicht verteilen. Das Trocknen des Deckgläschens ist notwendig, um zu verhindern, dass der 80-Mikroliter-Tropfen beim Kontakt mit dem Deckgläschen auseinanderläuft. Diese Methode ermöglicht es, HUVECs in einem kleinen Bereich des Deckgläschens zu konzentrieren, und fördert dadurch die schnelle Bildung einer confluierenden Zellschicht.Die Deckglasplättchen bei 37 Grad Celsius drei bis vier Stunden lang inkubieren, um den Zellen Zeit zu geben, sich zu einer konfluenten Monoschicht anzulagern. Anschließend die Objektträger zwei Mal mit vollständigem endothelialem Basalmedium spülen, um nicht angeheftete Zellen zu entfernen. Um eine Wundkante in der HUVEC-Monoschicht zu erzeugen, das Deckglas mit einer Pinzette vorsichtig festhalten und eine Rasierklinge fest über die Mitte der Zellmonoschicht ziehen.Lassen Sie die Zellen drei Stunden lang in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator regenerieren. Danach montieren Sie die Deckgläser wie zuvor für die Bildaufnahme. Erstellen Sie Phasenkontrastbilder im Abstand von 10 Minuten über einen Zeitraum von 12 Stunden mit einem Phasenobjektiv mit 10-facher Vergr&ouml;&szlig;erung und einer numerischen Apertur von 0,45 sowie einem langarmligen Kondensor mit einer numerischen Apertur von 0,52.Verwenden Sie das ND-Erfassungs-Panel des Bildaufnahmesoftwareprogramms. Quantifizieren Sie schließlich die HUVEC-Verzweigung und -Migration, wie in dem begleitenden Dokument beschrieben. HUVECs wurden transfiziert, um EB3 mit mApple-Markierung zu exprimieren, ein Mikrotubuli-Endbindungsprotein, und Zeitrafferaufnahmen wurden aufgezeichnet.Rohbilder von EB3 sind links dargestellt. Blaue EB3-Kometen, die mit der PlusTipTracker-Software verfolgt wurden, sind rechts dargestellt. Kometen, die in jedem Einzelbild erfasst wurden, wurden basierend auf ihrer Positionsänderung von Bild zu Bild verknüpft, um EB3-Spuren und eine visuelle EB3-Spurüberlagerung zu generieren, wie hier gezeigt.Langsames, kurzlebiges Mikrotubuli-Wachstum ist rot dargestellt, langsames, langlebiges Mikrotubuli-Wachstum ist gr&uuml;n dargestellt, schnelles, kurzlebiges Mikrotubuli-Wachstum ist gelb dargestellt, und schnelles, langlebiges Mikrotubuli-Wachstum ist blau dargestellt. Zur Analyse der Verzweigung endothelialer Zellen wurden ein DIC- und ein fluoreszierendes Bild einer einzelnen HUVEC-Zelle mit 60-facher Vergr&ouml;&szlig;erung aufgenommen. Eine Grenzlinie wurde manuell um den Zellrand im fluoreszierenden Bild gezeichnet.Die Verzweigungsursprünge wurden anschließend definiert, indem eine gerade Linie durch die Verzweigung und durch den größten Krümmungswinkel auf jeder Seite der Verzweigung gezogen wurde. Verzweigungen, deren Länge größer war als ihre Breite und die mindestens 10 Mikrometer lang waren, wurden gezählt, und die Länge wurde von der Verzweigungsursprung bis zur distalen Spitze der Verzweigung gemessen. Zur Beurteilung der Migration von Endothelzellen an der Wundkante wurden HUVECs in hoher Dichte kultiviert, und eine zeitraffende Live-Cell-Bildgebung wurde nach Verletzung wie in diesem Video beschrieben durchgeführt.Wie hier gezeigt, wanderten endotheliale Zellen am Wundrand gezielt in den Wundbereich hinein. Diese Bewegung wurde unter Verwendung des Nukleolus als Referenzmarke zur Bestimmung der Migrationsgeschwindigkeit, -persistenz und -distanz analysiert. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man HUVECs kultiviert, transfiziert und entweder für Bildgebungsstudien zur Zellform und Dynamik des Zytoskeletts oder für Untersuchungen zur Zellmigration am Wundrand vorbereitet.Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Polyacrylamid- oder Kollagenkonjugation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Zellinteraktion mit modifizierten ECMs zu beantworten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video-Protokoll zeigt die Isolierung und Kultivierung der menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) aus humanen Nabelschnur. Nach der Isolierung dieser Zellen in vitro Angiogenese-Assays, wie die optimierte Fibringel Bead Assay auch durch die Hughes-Labor nachgewiesen werden kann, verwendet werden.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Hier ein neuer Bereich von Interesse Analyseprotokoll auf Basis von Sortier Best-Fit-Ellipsen zu Regionen positives Signal innerhalb von zwei-dimensionalen Zeitbild Zeitraffer-Sequenzen zugeordnet wird demonstriert. Dieser Algorithmus kann Forschern ermöglichen, umfassend zu analysieren physiologischen Ca 2 +-Signale mit minimalen Benutzereingaben und Bias.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

Primäre humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurden innerhalb eines mikrofluidischen Netzwerkgeräts zur Konfluenz gezüchtet. Die Endothelzellübergänge und F-Aktin-Verteilungen wurden dargestellt und die Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der Stickoxidproduktion als Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) wurden in Echtzeit auf Einzelzellebene quantifiziert.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

Um den mikrovaskulären Fluss aus Hochgeschwindigkeits-Kapillarflussbildsequenzen zu quantifizieren, haben wir die Software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) entwickelt. Im gesamten Bildfeld und im Laufe der Zeit wertet STAFF Strömungsgeschwindigkeiten aus und generiert eine Sequenz farbcodierter Raumkarten für die Visualisierung und Tabellarische Ausgabe für quantitative Analysen.

Räumliche Temporale Analyse des feldweisen Flusses in der Mikrovaskulatur

Dieses Protokoll ist der Mikrotubuli-Plus-End-Visualisierung durch EB3-Proteintransfektion gewidmet, um ihre dynamischen Eigenschaften in der primären Zellkultur zu untersuchen. Das Protokoll wurde an menschlichen primären Hautfibroblasten implementiert, die von Huntington-Patienten gewonnen wurden.

Mikrotubuli Plus-End Dynamics Visualisierung im Huntington-Modell basierend auf humanen primären Hautfibroblasten

Die aktuelle Studie beschreibt ein Protokoll zur Überwachung der Veränderungen in humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) während einer Virusinfektion mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysesystems (RTCA).

Überwachung von Veränderungen in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen nach Virusinfektion mittels impedanzbasierter Echtzeit-Zellanalyse

Hier beschreiben wir eine grundlegende Protokoll, um Bild und Quantifizierung der mitotischen Zeitpunkt der Live-Säugetier-Zellkultur-Zellen nach siRNA-Transfektion.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Erfahren Sie, wie Sie Mikrotubuli-Dynamik und Zellmigration in lebenden HUVECs mittels Zeitraffer-Imaging analysieren. Diese Methode liefert Einblicke in Zytoskelett-Verhalten und Angiogenese.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene (Video) | JoVE Journal

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

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