Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Kultivierung humaner Endothelzellen der Nabelschnurvene und die Analyse der Zytoskelettdynamik und der Zellmigration mittels Zeitraffer-Bildgebung von lebenden Zellen. Die in diesem Video beschriebenen Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zell-, Molekular- und Mechanobiologie zu beantworten. Dieses Protokoll kann beispielsweise verwendet werden, um zu identifizieren, wie Zellform und -motilität durch den Einsatz verschiedener EZMs moduliert werden.

visuelle Demonstration ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Probenvorbereitung schwierig durchzuführen sind. Sie erfordern eine präzise und zeitnahe Handhabung der Zellen während des gesamten Prozesses. Obwohl diese Methode Einblicke in die Motilität von Endothelzellen während der Angiogenese geben kann, kann sie auch auf mikroskopische Untersuchungen praktisch jedes adhärenten Zellmodellsystems angewendet werden.

Nehmen Sie mit einer Pinzette ein Deckglas aus einem 100%igen Ethanol-Vorratsglas und führen Sie es durch eine Bunsenbrennerflamme, um es zu sterilisieren. Legen Sie es dann in eine 35 Millimeter große Petrischale. Bereiten Sie für jede Probe ein Deckglas vor.

Zu einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen werden 10 Mikroliter ein Milligramm pro Milliliter Fibronektin-Stammlösung und 990 Mikroliter PBS gegeben. Pipettieren Sie dann 250 Mikroliter der Lösung auf jedes Deckglas. Verteilen Sie die Lösung gleichmäßig, um die Oberfläche zu bedecken.

Inkubieren Sie die Deckgläser mindestens drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie jedes Deckglas vor dem Gebrauch dreimal mit zwei Millilitern PBS aus. Bestimmen Sie mit einem Hämozytometer die Anzahl der kultivierten HUVECs und übertragen Sie ein Volumen mit 100.000 Zellen pro Deckglas für Nicht-Migrationsexperimente oder 500.000 Zellen pro Deckglas für Migrationsexperimente in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Drehen Sie die Zellen vier Minuten lang mit dem 1.400-fachen G, um sie zu pelletieren. Nach dem Schleudern resuspendieren Sie für jede zu testende Bedingung bis zu einer Million Zellen in 100 Mikrolitern Elektroporationspuffer und kombinieren sie mit einem Mikrogramm cDNA. Übertragen Sie die Zellen in eine Elektroporationsküvette.

Transfizieren Sie die Zellen und das DNA-Gemisch mit dem für die HUVEC-Elektroporation vorgesehenen Programm. Als nächstes retten Sie die transfizierten Zellen, indem Sie 500 Mikroliter vollständiges endotheliales Basalmedium hinzufügen. Plattieren Sie dann das entsprechende Zellvolumen auf mit Fibronektin beschichtete Deckgläser.

Inkubieren Sie die Zellen drei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um Zeit für die Expression der cDNA-Konstrukte zu haben. Nehmen Sie zur Vorbereitung der Bildgebung zwei 2,5 Zentimeter x 0,65 Zentimeter große Streifen doppelseitiges Klebeband und befestigen Sie sie horizontal entlang der Ober- und Unterkante eines sauberen Objektträgers. Beachten Sie, dass es wichtig ist, zwischen dem Klebeband und der Gleitkante einen kleinen Abstand zu lassen, um die Kammer abzudichten.

Montieren Sie das Deckglas mit der Zellenseite nach unten, sodass die beiden Kanten des Deckglases auf dem Klebeband aufliegen. Drücken Sie das Deckglas mit einer Pinzette vorsichtig nach unten, um es zu sichern. Geben Sie mit einer Mikropipette 40 Mikroliter Bildgebungsmedium zwischen Deckglas und Objektträger.

Stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen Deckglas und Objektträger vollständig mit Bildmedium gefüllt ist. Tupfen Sie überschüssiges Medium bei Bedarf mit einem Papiertuch ab. Versiegeln Sie alle Gleitkanten mit warmem VALAP.

Prüfen Sie, ob es undicht ist, indem Sie vorsichtig auf das Glasdeckglas drücken. Legen Sie das montierte und versiegelte Deckglas auf einen auf 37 Grad Celsius vorgewärmten Mikroskoptisch. Mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop können Sie Zeitraffer-Bildsequenzen, blau fluoreszierende Proteinbilder und DIC-Bilder aufnehmen.

Analysieren Sie die Dynamik der Mikrotubuli und die Co-Lokalisierung, wie im Begleitdokument beschrieben. Um einen Zellmigrationsassay durchzuführen, retten Sie die transfizierten Zellen nach dem Elektroporationsschritt, indem Sie 80 Mikroliter vollständiges endotheliales Basalmedium hinzufügen. Pipettieren Sie dann die gesamte 80-Mikroliter-Probe als einzelnen Tropfen auf die Mitte eines getrockneten, mit Fibronektin beschichteten Deckglases.

Verteilen Sie den Tropfen nicht. Das Trocknen des Deckglases ist notwendig, um zu verhindern, dass sich der 80-Mikroliter-Tropfen bei Kontakt mit dem Deckglas ablöst. Dieser Ansatz ermöglicht es, HUVECs in einem kleinen Bereich des Deckglases zu konzentrieren und dadurch die schnelle Bildung einer konfluenten Monoschicht von Zellen zu fördern.

Inkubieren Sie das Deckglas drei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Zellen Zeit haben, sich in einer konfluenten Monoschicht zu verfestigen. Spülen Sie dann die Objektträger zweimal in vollständigem endothelialem Basalmedium, um alle Zellen zu entfernen, die sich nicht anheften. Um einen Wundrand auf der HUVEC-Monoschicht zu erzeugen, halten Sie das Deckglas mit einer Pinzette vorsichtig an Ort und Stelle und ziehen Sie eine Rasierklinge fest über die Mitte der Zellmonoschicht.

Lassen Sie die Zellen drei Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator sich erholen. Anschließend montieren und montieren Sie die Deckgläser für die Bildgebung wie bisher. Erfassen Sie Phasenkontrastbilder in 10-Minuten-Intervallen für 12 Stunden mit einem Phasenobjektiv mit 10x 0,45 numerischer Apertur und einem Kondensor mit großem Arbeitsabstand von 0,52 numerischer Apertur.

Verwenden Sie das Bedienfeld "ND-Aufnahme" des Bilderfassungssoftwareprogramms. Quantifizieren Sie schließlich die HUVEC-Verzweigung und -Migration, wie im Begleitdokument beschrieben. HUVECs wurden transfiziert, um mApple-markiertes EB3, ein Mikrotubuli-Endbindungsprotein, zu exprimieren, und es wurden Zeitrafferbilder aufgenommen.

Auf der linken Seite sind Rohbilder von EB3 zu sehen. Auf der rechten Seite sind blaue EB3-Kometen zu sehen, die von der plusTipTracker-Software verfolgt wurden. Kometen, die in jedem Frame detektiert wurden, wurden basierend auf ihrer Positionsänderung von Frame zu Frame verknüpft, um EB3-Spuren und ein visuelles EB3-Track-Overlay zu erzeugen, wie hier gezeigt.

Das langsame, kurzlebige Wachstum der Mikrotubuli ist in Rot dargestellt, das langsame, langlebige Wachstum der Mikrotubuli in Grün, das schnelle, kurzlebige Wachstum der Mikrotubuli in Gelb und das schnelle, langlebige Wachstum der Mikrotubuli in Blau. Um die Verzweigung von Endothelzellen zu analysieren, wurden ein DIC- und ein Fluoreszenzbild eines einzelnen HUVEC mit 60-facher Vergrößerung aufgenommen. Im Fluoreszenzbild wurde eine Grenze von Hand um den Zellrand gezogen.

Die Astursprünge wurden dann definiert, indem eine gerade Linie quer durch den Ast und durch den größten Krümmungswinkel auf beiden Seiten des Astes gezeichnet wurde. Äste, die länger als breit und mindestens 10 Mikrometer lang waren, wurden gezählt und die Länge vom Astursprung bis zur distalen Spitze des Astes gemessen. Um die Wundwanderung von Endothelzellen zu beurteilen, wurden HUVECs mit hoher Dichte kultiviert und nach der Verwundung eine Zeitrafferbildgebung von lebenden Zellen durchgeführt, wie in diesem Video beschrieben.

Wie hier gezeigt, wanderten Endothelzellen am Wundrand gerichtet in den Wundbereich. Diese Bewegung wurde unter Verwendung des Nukleolus als treuhänderischer Marker analysiert, um die Migrationsgeschwindigkeit, Persistenz und Entfernung zu verfolgen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie HUVECs für bildgebende Experimente zur Zellform und Zytoskelettdynamik oder für Studien zur Zellmigration am Wundrand kultiviert, transfiziert und vorbereitet werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Polyacrylamid- oder Kollagenkonjugation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit der Zellaktivierung modifizierter EZM zu beantworten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.