Ein detailliertes Protokoll der murinen C1498-Zelllinie und der damit verbundenen Leukämie Maus-Modell für Charakterisieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, murine C1498-Zellen und die akute Leukämie, die sie nach intravenöser Injektion bei Mäusen auslösen, zu charakterisieren. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass die murine myelomonozytäre Leukämie, die nach einer Injektion von C1498-Zellen induziert wird, viele Merkmale der menschlichen Krankheit aufweist. Dieses Tiermodell kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Hämatologie zu beantworten, z. B. welche Mechanismen zur Entwicklung von Leukämie und Immunschwäche führen.

Die Implikation dieses Tiermodells erstreckt sich auch auf die Behandlung von Leukämie, da es die Erprobung neuer Chemo- und Immuntherapeutika erleichtert. Beginnen Sie mit dem Transfer einer fünf bis sechs Wochen alten weiblichen kongenen C57 Black 6-Maus in eine sterile Laminar-Flow-Haube. Legen Sie das Tier dann in ein Fixiergerät.

Laden Sie als Nächstes eine Ein-Millileter-Spritze, die mit einer 29-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit 100 Mikrolitern Zellen. Fassen Sie den Schwanz des distalen Endes und desinfizieren Sie die Schwanzhaut mit einer mit 70 % Ethanol getränkten Gaze. Injizieren Sie langsam einmal 10 mal 10 zu den sechsten Zellen in eine seitliche Schwanzvene.

Wenn alle Zellen abgegeben wurden, entfernen Sie die Nadel und üben Sie beim Anblick der Injektion sanften Druck mit steriler Gaze aus. Setzen Sie das Tier dann unter sorgfältiger Überwachung für die nächsten Wochen in seinen Käfig zurück. 17 bis 19 Tage später wird ein Kapillarschlauch in den medialen Canthus des Auges des anästhesierten leukämischen Tieres eingeführt.

100 bis 200 Mikroliter Blut werden aus der Kieferhöhle in das Kapillarrohr gesaugt. Entfernen Sie den Schlauch und kontrollieren Sie die Blutung durch das sanfte Auftragen eines sterilen Mullschwamms auf das Auge. Übertragen Sie dann das Blut in ein EDTA-Röhrchen und lagern Sie das Röhrchen auf Eis, bis die mononukleäre Zellisolierung erreicht ist.

Um die mononukleären Zellen im Blut zu isolieren, fügen Sie zunächst PBS hinzu, das mit einem Millimolar EDTA bis zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern ergänzt wird. Übertragen Sie dann die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um vorsichtig 500 Mikroliter Trennlösung unter das Blut zu schichten, wobei Sie darauf achten, dass sich die Schichten nicht vermischen.

Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und übertragen Sie mit einer Pipette die undurchsichtige weiße mononukleäre Zellschicht in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie dann Immunzellen in einem Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie sie und suspendieren Sie das Pellet in 600 Mikrolitern FACS-Puffer zur Färbung und Analyse durch Durchflusszytometrie.

Um das Knochenmark zu isolieren, legen Sie die Maus auf den Rücken auf ein Plastikbrett und sichern Sie die Gliedmaßen des Tieres. Desinfizieren Sie das Tier mit 70% Ethanol. Schneiden Sie dann jedes Bein an der Oberseite des Oberschenkelknochens oberhalb des Gelenks ab und ziehen Sie vorsichtig an den Schienbeinen, um sie von den Oberschenkelknochen zu lösen.

Entferne mit Pinzette und Schere die Haut und Muskeln von den Knochen und übertrage die Knochen in eine Petrischale auf Eis. Verwenden Sie eine Schere, um die Extremitäten zu entfernen. Führen Sie dann eine 26-Gauge-Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze mit fünf Millilitern kaltem PBS befestigt ist, jeweils in das Ende eines Knochens ein und spülen Sie die Knochenmark in die Schale.

Führen Sie die Zellsuspension mehrmals durch die Nadelspitze, um die Knochenmarkzellen zu stören. Filtrieren Sie dann die Zellen durch einen neuen 70-Mikron-Filter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Zellen und suspendieren Sie das Pellet wieder in zwei Millilitern Lysepuffer

Füllen Sie das Röhrchen sofort mit bis zu 50 Millilitern kaltem PBS und zentrifugieren Sie die Zellen. Suspendieren Sie dann das Knochenmarkpellet einmal mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter in kaltem FACS-Puffer. Um die Knochenmarkzellen zunächst für die Färbung vorzubereiten, legen Sie Objektträger in Einwegkammern mit vorangebrachten Filterkarten und legen Sie die Kammern in eine Zytozentrifuge.

Geben Sie 100 Mikroliter FACS-Puffer in jede Filterkartenkammer und zentrifugieren Sie die Objektträger kurz. Am Ende der Drehung geben Sie 100 Mikroliter Zellen in jede Kammer und zentrifugieren Sie die Zellen. Nehmen Sie dann die Objektträger vorsichtig aus den Kammern, um sie an der Luft zu trocknen.

Um die Knochenmarkzellen zu färben, tauchen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in ein Coplin-Glas mit May-Grunwald-Lösung. Übertragen Sie anschließend die Objektträger eine Minute lang in ein Glas mit Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8. Übertragen Sie dann die Objektträger für 10 Minuten in die Giemsa R-Lösung.

Gefolgt von einer 10-sekündigen Wäsche mit pH-neutralem Wasser. Lassen Sie die Objektträger nach dem Waschen an der Luft trocknen und tragen Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf jede Probe auf. Setzen Sie dann eine Kante eines Deckglases auf den Objektträger und senken Sie das Deckglas vorsichtig auf die Zellen ab, um Luftblasen zu entfernen.

Im Vergleich zu Kontrolltieren zeigen die in C1498-Zellen injizierten Tiere eine massive Infiltration von C1498-Zellen in ihr Knochenmark, was sich durch das blastenartige Aussehen der Zellen zeigt. Die im Knochenmark infiltrierenden C1498-Zellen weisen monozytäre und granulozytäre Phänotypen auf, die auf monoblastische bzw. myeloblastische Zellen hinweisen und für akute myelomonozytäre Leukämie charakteristisch sind. Die durchflusszytometrische Analyse der mononukleären Zellfrequenzen in Blutproben von C1498-injizierten Mäusen zeigt, dass etwa ein Viertel der gesamten Population weißer Blutkörperchen aus leukämischen Zellen besteht.

Die Häufigkeit von T- und B-Lymphozyten ist bei Kontrolltieren und C1498-injizierten Tieren ähnlich. Monozytenfrequenzen werden jedoch bei Mäusen, die mit C1498 injiziert wurden, in höheren Konzentrationen beobachtet, ein Merkmal der akuten myelomonozytären Leukämie. Bei der Durchführung der Zytochemie und der May-Grunwald Giemsa-Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die entsprechenden pH-Werte, Temperaturen und Inkubationszeiten einzuhalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man akute myelomonozytäre Leukämie charakterisiert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Hämatologie, um die Natur der spontanen und induzierten akuten Leukämie in anderen Tiermodellen zu erforschen.