Name: Rückstands spezifische Einbau nichtkanonischer Aminosäuren in Modellproteine eine Verwendung Escherichia coli Zellfreie Transkription-Translation-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Lernen Sie die rückstandsspezifische Einbettung nichtkanonischer Aminosäuren in Modellproteine mittels zellfreiem Expressionssystem. Diese Methode ermöglicht die Analyse modifizierter Proteine für strukturbiologische und pharmazeutische Forschung.

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E.G. Worst und A. Ott bedanken sich für die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Sonderforschungsbereichs SFB 1027 sowie für die Universität des Saarlandes. E.G. Worst, A. Ott und V. Noireaux danken ferner für die finanzielle Unterstützung durch die Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). Die Autoren danken Tobias Baumann und Stefan Oehm (Institut für Chemie, Technische Universität Berlin) für die kritische Lektüre.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

An-einfach zu zellfreien Expressionssystem als eine tragfähige Strategie verwenden, um Rest-spezifisch NCAAs in Proteine ​​einzubauen, wird präsentiert. Zu diesem Zweck wird der Rohextrakt mit Vektor-DNA, die für das interessierende Protein ergänzt, den Energiepuffer und den entsprechenden Aminosäuren. Beachten Sie, dass Volumen des aliquoten Teils auf dem Rohextrakt Proteinkonzentration 34 Rohextrakt abhängt. Der zellfreie Expressionseffizienz in Abhängigkeit von der Konzentration-Vektor-DNA Konstruktion optimiert. Die Volumina der Energiepufferkomponenten variieren als Funktion der optimierten Mg- und K-Glutamat-Konzentrationen, um hohe Ausbeuten an zellfreien ausgedrückt Modellprotein zu ermöglichen. Eine vorläufige Auswertung des Einbaus Experiment kann durch Durchführen der SDS-PAGE des gereinigten zellfreien Reaktionsmedium erhalten werden. Für eine detailliertere Analyse, HPLC-ESI-Massenspektroskopie wird als ein Mittel vorgeschlagen, für eine vollständige, rückstandsspezifischen incor zu überprüfenFungs der NCAA. Als Vorbereitung für die letzteren sind spin column Systemen verwendet His-tag Reinigung und Pufferaustausch mit den kleinen Volumina, die in diesem Protokoll verwenden, zu ermöglichen. Einschließlich HPLC-ESI-Massenspektroskopie kann das gesamte Protokoll innerhalb von 2 Tagen durchgeführt werden. Es enthält keine besonders kritischen Schritte. Allerdings Konzentration Optimierungen von Mg- und K-Glutamat sowie von Vektor-DNA sind von entscheidender Bedeutung, um hohe Ausbeuten des Modellproteins zu exprimieren. Die Verwendung des hocheffizienten Expressionsvektor pBEST-OR2-Or1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 wird dringend empfohlen. Elution von His-markierten Proteinen ist in der Regel wegen der hohen Konzentration an Imidazol (&gt; 150 mM) und andere Salze wie NaH 2 PO 4 (&gt; 300 mm) oder NaCl (&gt; 50 mm) , die hohe Hintergrundrauschanalyse in massenspektroskopische erzeugen 49 . Austausch solcher Elutionspuffer mit einem geeigneten Protein-Speicherpuffer stabilisiert das Modell Protein und drastisch reduziert Hintergrundgeräusche während der massenspektroskopischen Analyse. Als Ergebnis kann Arg innerhalb des Modellproteins an allen sechs Positionen ersetzt. In dem Expressionssystem, können keine Arg Rückstände festgestellt werden. Dies vereinfacht die rückstandsspezifischen Einbau Arg - Analoga im Vergleich zu anderen Expressionssystemen , die weitere Abreicherung Strategien 29,30 erfordern. Die präsentierten zellfreien Ansatz umgeht die inhärenten Einschränkungen von in - vivo - Ansätze , die zu Can Toxizität zurückzuführen sind, oder die starke Abhängigkeit von mRNA - Sequenz in einzelne Proteinproduktionsstrategien 24,31. Im Gegensatz, in vivo Spaltung kann , um die in - vitro - System verwendet , um Homoserin und Hydroxyguanidin 31 auftritt. Jedoch behält das zellfreie System eine ausreichende Menge an Lys mit Analoga wie Hyl zu konkurrieren. Die HPLC-ESI-Massenspektroskopie-Analyse zeigt, dass das Modell Protein enthält sowohl die canonical sowie die nicht-kanonischen analog in unterschiedlichen Anteilen. Der Rückstand spezifischen Einbau von Lys ist möglich, in der Regel aber für eine vollständige Substitution, weitere Abreicherung Strategien oder speziell entwickelten aaRS und tRNA für die Anerkennung von NCAAs optimiert müssen entwickelt werden. Wir erzielten ausgezeichnete Ausbeuten von zellfreien ausgedrückt, modifizierte Modell Proteine, die durch die NCAA in der gleichen Konzentration wie die kanonische hinzufügen. Die Einbaueffizienz hängt von der Art des ncaa aufzunehmen. Noch höhere Ausbeuten durch die Optimierung der Konzentration des NCAA könnte noch realisierbar sein. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen die Anwendbarkeit des verwendeten Systems für die rückstandsspezifischen Einbau NCAAs solange sie durch die kanonische endogene Translationssystem akzeptiert werden. Für den Rest spezifischen Einbau von spezifischen NCAAs, einen weiteren Bedarf zu prüfen, ob die Rückstände des analogen CAA Stöb des Expressionssystems. Die zellfreien Transkriptions-Translationssysteme können aus verschiedenen Organismen gentechnisch verändert werden 54 unterschiedliche Anforderungen reagieren zu können . Die alle E. coli Transkriptions-Translations - Maschinerien der hier vorgestellten zellfreies System ermöglichen die Verwendung von Bakteriophagen und E. coli - Promotoren, und sie können 55 parallel oder nacheinander in Kaskaden handeln. Die allgemeine Anwendbarkeit und Benutzerfreundlichkeit machen das Verfahren ein wirksames Instrument für die weitere Forschung in der Aminosäure-Toxizität und therapeutische Anwendung.

Der genetische Code ist in die Biosphäre universal. Es kodiert für einen Satz von 20 kanonischen Aminosäuren, die manchmal durch selenocysteine ​​1 oder Pyrrolysin 2 verlängert wird. Es ist das Ribosom, das mit Hilfe von tRNAs in Ketten von Aminosäuren, die in Proteine ​​falten den genetischen Code übersetzt. Die funktionellen Gruppen der kanonischen Aminosäuren in Kombination mit posttranslationalen Modifikationen beitragen, zu einem außergewöhnlich breites Spektrum von Proteinfunktion 3,4. Grundsätzlich funktionellen Einschränkungen aufgrund der begrenzten Anzahl von kanonischen Aminosäuren können durch den Einbau von weiteren, nicht - kanonischen Aminosäuren (NCAAs) , die ermöglichen , neue chemische Zusammensetzungen und neue Funktionalitäten 3,4 überwunden werden. Es gibt zwei sich ergänzende Ansätze für die Einbeziehung von NCAAs: die orts- oder der Rest spezifischen Einbau. Die erste Methode ist mit erheblichen technischen Schwierigkeiten, da die kanonische Satz von Aminoacyl-tRNA-Synthesizeretases (aaRS) und tRNAs müssen durch eine orthogonale aaRS-tRNA-Paar erweitert werden, die nicht mit dem endogenen Translationsmaschinerie interagieren müssen. Basierend auf einer sorgfältigen Engineering, beinhaltet dieser Ansatz die NCAAs als einzelne Punktmutationen an den gewünschten Proteinstellen. Ortsspezifischen Einbau von NCAAs genetisch durch ein Codon codiert wird, die nicht auf eine kanonische Aminosäure (CAA) zugeordnet ist, in der Regel einem Stopcodon 5-9. Dieses Verfahren beinhaltet Änderungen in Funktion an einer bestimmten Stelle , anstatt über das gesamte Protein 10-13. Im Gegensatz dazu Rückstand spezifischen Einbau stützt sich auf eine fehlerhafte Erkennung der nicht-kanonische Aminosäure durch die kanonische Translationsmaschinerie. Die Einarbeitung erfolgt aufgrund des Fehlens der Substratspezifität der aaRS. Der Rückstand spezifischen Einbau von NCAAs, auf der Arbeit von Cohen gebaut und Mitarbeiter 14, hat zu wichtigen Anwendungen geführt 3,10, darunter bioorthogonalen Kennzeichnung 15-17 von Proteinenoder Strukturaufklärung von Proteinen in der Röntgenkristallographie 18. Als natürliche aaRS im Allgemeinen ihre verwandten Aminosäure über eine isostruktureller NCAA, effizient in vivo Rückstand spezifischen Einbau bevorzugen erfordert in der Regel einen auxotrophen Expressionswirt nicht in der Lage die kanonische Analogon der NCAA zu synthetisieren. Die Wirtszellen werden in Wachstumsmedium kultiviert, die nur eine geringe Konzentration des analogen CAA liefert. Seine Erschöpfung in Kombination mit der laufenden Ergänzung mit der NCAA zwingt den Expressionswirt der NCAA in das Modellprotein an mehreren, kanonisch vorgeschriebenen Websites zu integrieren. Im Gegensatz zu den standortspezifischen Ansatz, dies hat in der Regel einen großen Einfluss auf die gesamte Proteinstruktur, was zu einer physikalischen und chemischen Eigenschaften von Proteinen 19,20 erheblich modifiziert. Allerdings sind die meisten der NCAAs sind Wachstumsinhibitoren für den Expressionswirt 3, wie sie in vielen anderen prot eingebaut sindeins neben denen von Interesse während der rekombinanten Genexpression. Dies zeigt deutlich begrenzt die in - vivo - Ansatz. Die in - vivo - Einbau von Aminosäuren, die toxisch sind oder starken Einfluss auf die Proteinstruktur bleibt besonders anspruchsvoll . Allerdings sind diese Moleküle zu den vielversprechendsten Proteine ​​mit außergewöhnlichen Funktionen zu konstruieren. Ein Beispiel ist die toxische, nicht-kanonische, natürlich vorkommenden L-Canavanin (Can), einem Analogon von L-Arginin (Arg). Es wirkt sich und blockiert Arg assoziierte regulatorische und katalytische Reaktionswege, und seine Präsenz in der lebenden Zelle kann zum sofortigen Tod 3,21-23 führen. Sein Einbau in Proteine ​​an Arginin Positionen kann die Proteinstabilität 21-23 reduzieren. Aufgrund der resultierenden Toxizität Expression von Canavanin Proteine ​​in Escherichia coli (E. coli) und andere übliche Expressionswirte enthält bleibt eine Herausforderung. Aus diesen Gründen vollständig in vivo incorporation von Can an allen Arg Positionen hat in geeigneter Weise nur einmal 24, unter Verwendung eines erarbeiteten Einzelproteinproduktionssystem bestätigt. Jedoch wurde als Antikrebsmittel 25-27 und als Stimulator für Autoimmunerkrankungen bei Menschen 28 vorgeschlagen. Darüber hinaus ist es Gegenstand verschiedener Studien über seine anti-metabolischen, antibakterielle, antimykotische und antivirale Eigenschaften 25. Diese Eigenschaften erhöhen die Nachfrage nach effizienten und einfach zu führen Methoden zum Ausdruck bringen können Proteine ​​für pharmazeutische, medizinische und funktionelle Studien enthalten. Obwohl viele Probleme , die zellfreie Expression in vivo - Produktion verbunden sind , unter Verwendung von Systemen umgangen werden kann, wurden in vitro Rückstand spezifische Ansätze nur bisher schlecht erforscht. Der zellfreie rückstandsspezifischen Einbau eines L-Tryptophan Analog 29 und mehrere NCAAs 30 berichtet. Diese Verfahren basieren auf der hoch efficient T7 RNA-Polymerase. Die T7-RNA-Polymerase beinhaltet bakteriophagenspezifischer wie Transkription, wodurch genetische Funktionalität im Vergleich zu endogenen Transkription reduzieren. Der komplette Rest spezifischen Einbau in ein Modellprotein in allen Arg Positionen wurde vor kurzem 31 berichtet, 32 eine zellfreie Expressionssystem. Eine leichte Modifikation des gleichen Systems ortsspezifischen Einbau verschiedener Pyrrolysin Analoga in ein Modell Protein über Stop - Codon Unterdrückung 33 aktiviert. Die verwendete zellfreies System 31-33 basiert auf einer ganzen E. coli Transkriptions-Translations - System. Dennoch ermöglicht es die Proteinexpression so effizient wie in gegenwärtigen Systemen Bakteriophagen (0,5-1 mg / ml von rekombinantem Protein) 32, während ein Großteil der Original - Transkriptions-Translations - Modularität beibehalten wird . In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll zur Verfügung gestellt, wie die residue spezifischen Einbau von NCAAs realisiert werden, indem diese alle E. coli zellfreien System 32. Darüber hinaus weitere Schritte, um die exprimierten Proteine ​​für entsprechende Auswertung mittels HPLC-ESI-Massenspektroskopie vorgeschlagen vorzubereiten. Um die Eigenschaften dieser zellfreien System zu erweitern, geht diese Arbeit nicht nur beziehen sich auf die veröffentlichten Einbau von 31 , sondern auch neue Daten im Zusammenhang mit der nicht - kanonischen L-Lysinanalogon L-Hydroxy-Lysin. Das folgende Protokoll für die rückstandsspezifischen Einbau NCAAs ist eine Anpassung eines Protokolls kürzlich in JoVE 34 veröffentlicht. Letzteres Protokoll beschreibt, wie hocheffiziente zellfreien Expression mit Standard-Aminosäuren durchzuführen. Außerdem stellt es die Herstellung des rohen zellfreien Extrakt, die Aminosäurelösung, die Energie-Stammlösung und der Energiepuffer in diesem Ansatz verwendet. Das folgende Protokoll konzentriert sich auf die veränderten Schritte im Vergleich zum vorherigen protokoll, um den Rückstand spezifischen Einbau von NCAAs zu ermöglichen. Kalibrierte Pipetten, schwach bindende Pipettenspitzen und Mikrozentrifugenröhrchen werden zur Herstellung empfohlen. Im Folgenden IUPAC-Abkürzungen für die Aminosäuren verwendet.

<table><tbody><tr><td>Schutzbrillen</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z758841</td><td></td></tr><tr><td>Nitrilhandschuhe (Größe S)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z768960</td><td>Katalognummern andere Größen: Z768979 für M, Z768987 für L und Z768995 für XL</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1,5 ml (PCR clean)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Microbalance Discovery DV114CM</td><td>Ohaus, Greifensee, Schweiz</td><td>80104140</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospatel (L 6 5/8 Zoll, Edelstahl, Stabdurchmesser 0,09 Zoll)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z243213</td><td></td></tr><tr><td>L-Canavanine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C9758</td><td>Akute Toxizität: Tragen Sie einen Augenschutz, eine Staubmaske, Schutzhandschuhe</td></tr><tr><td>Hydroxylysin (racemisches Gemisch)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H0377</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Handschuhe (Größe S, wasserfest)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z183490</td><td>Katalognummern andere Größen: Z183512 für M, Z183520 für L und Z183539 für XL</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Deutschland</td><td>BR1401801</td><td>Für die hausgemachte Zubereitung von Aminosäure-Stammlösungen befolgen Sie dieses Protokoll35 und verwenden Sie das feste Aminosäure-Kit LAA21-1KT, L-Prolin (81709-25G), L-Cystein (30089-25G), L-Histidin (53319-25G) und L-Lysin (L5501-5G). (alle aus Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>23160</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (aus E. coli, Packungsgröße 100 mg)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>10109541001</td><td>Katalognummer für die Packungsgröße von 500 mg ist 10109550001</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>NAD (aus Hefe)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A9501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Folinsäure</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Mg-Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>K-Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td><td>Addgene, Cambridge, USA</td><td>Plasmid #40019</td><td></td></tr><tr><td>4-20% vorgefertigte Tris-Glycin-Gele (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 Schichten)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Deutschland</td><td>TG 81610</td><td></td></tr><tr><td>SDS Laufpuffer (10 x Konzentrat, 5.000 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Deutschland</td><td>TG 50001</td><td></td></tr><tr><td>SDS Ladepuffer (2 x Konzentrat, 50 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Deutschland</td><td>TG 05002</td><td></td></tr><tr><td>Ungefärbter Proteinmarker, breites Spektrum (2-212 kDa)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>P7702S</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1060091011</td><td>Giftig beim Einatmen, bei Berührung mit der Haut und bei Verschlucken: Schutzhandschuhe tragen und unter Abzug arbeiten</td></tr><tr><td>Essigsäure (99,8%)</td><td>VWR International, Darmstadt, Deutschland</td><td>20104.447</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Deutschland</td><td>902120</td><td></td></tr><tr><td>His-Spin Protein Miniprep Kit</td><td>Zymo Research Europe, Freiburg, Deutschland</td><td>P2002</td><td>Produkt wird auch vertrieben von Zymo Research Corporation, Irvine, USA&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin, 99%</td><td>VWR International, Darmstadt, Deutschland</td><td>24397.296DB</td><td></td></tr><tr><td>CentriPure Z25 Mini-Spin-Säulen</td><td>Genaxxon bioscience, Ulm, Deutschland</td><td>CP-0205-Z100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator 5301</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>5301 000.210</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td><td>113012032</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bead-Beating-Röhrchen (Mikrofläschchen aus Polypropylen)</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>522S</td><td></td></tr><tr><td>Perlen, 0,1&nbsp; mm Ø</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli Stamm</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Deutschland</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Küvetten, 1,5&nbsp; ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Bio-Spin-Chromatographie-Säulen</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Germany</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384-well optische Bodenplatten</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Dichtband</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>232701</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega, Madison, USA</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasische Lösung</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Monobasische Kaliumphosphatlösung</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysekassetten, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; L Zentrifugenflasche</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>A98813</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; L Erlenmeyerkolben</td><td>Kimble Chase, Vineland (NJ), USA</td><td>26500-4000</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26XP Zentrifuge</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>393127</td><td>Oder gleichwertige Zentrifuge, die 1-L-Flaschen zentrifugieren kann.</td></tr><tr><td>Forma 480 Orbitalschüttler</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>480</td><td>Oder gleichwertiger Schüttler zum Schütteln von Brustumfang 6 x 4 L .</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 Rotor</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>363688</td><td>Oder gleichwertiger 5.000 x g Rotor für die obige Zentrifuge, der 1 L Flaschen zentrifugieren kann.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R gekühlte Mikrozentrifuge</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>368831</td><td>Oder gleichwertige Zentrifuge, die 2 ml Reaktionsgefäße zentrifugieren kann.</td></tr><tr><td>Heizblock HLC HBT 130</td><td>Labexchange, Burladingen, Deutschland</td><td>24465</td><td>Oder gleichwertiger Heizblock, der in der Lage ist, Proben in Reaktionsgefäßen auf bis zu 100 °C zu erhitzen.</td></tr><tr><td>Eppendorf MiniSpin Zentrifuge</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>5452000018</td><td>Oder gleichwertige Zentrifuge, die 2 ml Reaktionsgefäße zentrifugieren kann.</td></tr><tr><td>IKA Vortex 3 (4 mm Orbitalschüttlerdurchmesser, 0 - 2.500 U/min)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z654760</td><td>Oder gleichwertiger Vortex.</td></tr><tr><td>Scotsman AF103 Eiszerkleinerungsmaschine</td><td>K&auml; lte-Berlin, Berlin, Deutschland</td><td>AF103</td><td>Oder gleichwertige Eisflockenmaschine.</td></tr><tr><td>MyTemp Mini-Digital-Inkubator</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z763314</td><td>Oder gleichwertiger Inkubator, der Proben bei 29 °C erhitzen kann.</td></tr><tr><td>EcoCell Elektrophoresezelle / -kammer</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Deutschland</td><td>AN12005</td><td>Oder gleichwertige Elektrophoresekammer, die in der Lage ist, eine vertikale Gelelektrophorese mit den oben genannten vorgefertigten Gelen oder anderen verwendeten Gelen durchzuführen.</td></tr><tr><td>Power-phor Netzteil für Elektrophoresezelle / -kammer</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Deutschland</td><td>AN12001</td><td>Oder gleichwertiges Netzteil, das in der Lage ist, die oben verwendete Elektrophoresezelle / -kammer mit Strom zu versorgen</td></tr><tr><td>VWR Signature Ergonomic High Performance Einkanal-Pipettierer mit variablem Volumen Starter Kit 1</td><td>VWR International, Darmstadt, Deutschland</td><td>613-5278</td><td>Oder gleichwertige Mikropipetten, die das Pipettieren ähnlicher Volumina mit der gleichen Präzision ermöglichen</td></tr><tr><td>VWR Signature Ergonomic Hochleistungs-Einkanalpipetten mit variablem Volumen Starter Kit 2</td><td>VWR International, Darmstadt, Deutschland</td><td>613-5279</td><td>Oder gleichwertige Mikropipetten, die das Pipettieren ähnlicher Volumina mit der gleichen Präzision ermöglichen</td></tr><tr><td>Pipetman-Spitzen Diamond D10ST (0,1 - 10 & Mikropipetten; l)</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171101</td><td>Oder gleichwertige Pipettenspitzen mit geringer Bindung, die das Pipettieren ähnlicher Volumina mit der gleichen Präzision ermöglichen</td></tr><tr><td>Pipetman-Spitzen Diamond D200ST (2 - 200 & micro; l)</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171301</td><td>Oder gleichwertige Pipettenspitzen mit geringer Bindung, die das Pipettieren ähnlicher Volumina mit der gleichen Präzision ermöglichen</td></tr><tr><td>Pipetman-Spitzen Diamond D1000ST (100 - 1.000&nbsp; &Mikro; l)</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171501</td><td>Oder gleichwertige Pipettenspitzen mit geringer Bindung, die das Pipettieren ähnlicher Volumina mit der gleichen Präzision ermöglichen</td></tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (steril)</td><td>VWR International, Darmstadt, Deutschland</td><td>50-0156</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (steril)</td><td>VWR International, Darmstadt, Deutschland</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Polypropylen-Röhrchen (runder Boden, Entlüftungsstopfen mit zwei Positionen, steril)</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland</td><td>187262</td><td></td></tr><tr><td>Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC-Säule (3 & Mikro; m Partikelgröße, L x ID 10 cm x 2,1 mm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>567227-U</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1260 HPLC-Maschine</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G1312B</td><td></td></tr><tr><td>6500 Serie Massengenaues Quadrupol Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G6530BA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>270717</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega Mikroplatten-Reader</td><td>BMG Labtech, Ortenberg, Deutschland</td><td>415-101</td><td>Oder gleichwertiger Mikroplatten-Reader, der die Fluoreszenz des exprimierten Modellproteins messen kann</td></tr><tr><td>Hanna Checker pH-Meter</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z351091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure-Eluenten-Additiv für LC-MS</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>56302</td><td></td></tr></tbody></table>

rückstands spezifische einbau nichtkanonischer aminosäuren in modellproteine ​​eine verwendung<em&gt; escherichia coli</em&gt; zellfreie transkription-translation-system

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Die kanonische Satz von Aminosäuren führt zu einer außergewöhnlich breites Spektrum von Protein-Funktionalität. Dennoch legt die Menge der Rückstände immer noch Beschränkungen auf mögliche Protein-Anwendungen. Der Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren können diesen Bereich vergrößern. Es gibt zwei sich ergänzende Ansätze für die Einbeziehung von nicht-kanonischen Aminosäuren. Für ortsspezifischen Einbau, zusätzlich zu den endogenen kanonische translationale Maschinen, eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase-tRNA-Paar muss zur Verfügung gestellt werden, die nicht mit den kanonischen in Wechselwirkung tritt. Folglich, die ein Codon nicht auf eine kanonische Aminosäure zugeordnet ist, in der Regel einem Stopcodon, ist ebenfalls erforderlich. Diese Erweiterung des genetischen Codes ermöglicht die Inkorporation eines nicht-kanonische Aminosäure an einer einzigen, gegebenen Stelle innerhalb des Proteins. Die hier vorgestellten Arbeit beschreibt Rückstand spezifischen Einbau, wo der genetische Code innerhalb des endogenen Translationssystem neu zugewiesen wird. Die Translationsmaschinerie einccepts die nicht - kanonische Aminosäure als Surrogat es kanonisch vorgeschriebenen Stellen zu übernehmen, dh alle Vorkommen einer kanonischen Aminosäure in dem Protein werden durch die nicht - kanonische ersetzt. Der Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren können die Proteinstruktur verändern, was zu erheblich veränderten physikalischen und chemischen Eigenschaften. Nichtkanonische Aminosäureanaloga wirken oft als Zellwachstumshemmer für Wirte Ausdruck , da sie endogene Proteine ​​zu modifizieren, in vivo Proteinproduktion zu begrenzen. In - vivo - Einbau von toxischen nichtkanonischer Aminosäuren in Proteine ​​besonders herausfordernd bleibt. Hier wird ein zellfreier Ansatz für einen vollständigen Ersatz von L-Arginin durch die nicht-kanonische Aminosäure L-Canavanin dargestellt. Es umgeht die inhärenten Schwierigkeiten der in - vivo - Expression. Darüber hinaus wird ein Protokoll Zielproteine ​​für die Massenspektralanalyse herzustellen ist im Preis enthalten. Es wird, dass L-Lysin dargestellt durch L-hydroxy-Lysin ersetzt sein können,wenn auch mit geringerer Effizienz. Im Prinzip kann jedes nicht - kanonische Aminosäure analog solange eingearbeitet werden , um die vorgestellte Methode unter Verwendung als das endogene in vitro - Translationssystem erkennt.

Dieses Protokoll führt durch die zellfreien Rückstand spezifischen Einbau von NCAAs in Modellproteine. Er schlägt vor, SDS-PAGE für eine vorläufige Bewertung des Einbaus Experiment und weitere Schritte, um die Modellproteine ​​für eine geeignete HPLC-ESI-Massenspektroskopie-Analyse vorzubereiten. Hier sind repräsentative Ergebnisse der zellfreien Rückstand spezifischen Einbau des Arg Analogon kann, sowie die Lys analoge L-Hydroxy-Lysin (Hyl) vorgestellt. Die verschiedenen Aminosäurelösungen, die Energiepuffer, der Vektor DNA kodierend für das Modellprotein und zellfreien Reaktionen werden wie oben beschrieben hergestellt. Der Referenzzellfreie Reaktion wird mit der Aminosäurelösung zur Verfügung gestellt, bestehend aus den 20 Caas. Für jedes Experiment wird eine negative Kontrolle zellfreie Reaktion mit der Aminosäurelösung zugeführt, die die kanonischen Analogon der ncaa in Frage fehlt. Für jede ca.oach, einer zellfreien Reaktions drückt das Modellprotein in Gegenwart der Aminosäure-Lösung, bei der CAA durch die nicht-kanonische analog substituiert ist. His-tag Reinigung, Pufferaustausch und HPLC-ESI massenspektrometrische Analyse werden entsprechend ausgeführt zu dem oben beschriebenen Protokoll. Das Modell - Protein ist das C-terminale deGFP 32 His-tagged, eine verkürzte Version von EGFP 53. Seine eine Buchstaben-Aminosäuresequenz kann in (Supplemental Material 2) gefunden werden. Dieses Modell Protein enthält 6 Arg und Lys 18 - Positionen, respectively. Der Expressionsvektor ist pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Im Falle der vollständigen Einbeziehung der NCAA, kann man davon ausgehen, dass die negative Kontrollreaktion drückt nicht deGFP, da einer der 20 CaaS fehlt. die native eine in der Refe: Im Gegensatz, in den beiden anderen Reaktionen nachweisbar sein deGFP müssenrenz zellfreie Reaktion und das modifizierte Protein in dem zellfreien Reaktion, die mit der NCAA vorgesehen ist. Figur 1A zeigt die vorläufige SDS-PAGE Auswertung des Can Inkorporation experiment. Die Referenzzellfreie Reaktion hat die höchste deGFP Expressionsniveau. In dem zellfreien Reaktion, die mit vorgesehen ist, wird deGFP bei etwas niedrigeren Konzentration ausgedrückt. Kein deGFP Expression kann in der negativen Kontrolle nachgewiesen werden. Dieses SDS-PAGE Ergebnis ist ein guter Indikator für eine erfolgreiche Integration von Can in das Zielprotein deGFP. Um die Hypothese aufgestellt , die völlige Eingliederung von Can in deGFP sowohl gereinigte Modellproteinen, visualisiert in 1B beweisen, werden durch HPLC-ESI - Massenspektroskopie analysiert. 1C zeigt die entfalteten Massenspektren der gereinigten deGFP Molekülen. Die entfalteten Masse von DEGF<html> P, die in der Referenzzelle freien Reaktions ausgedrückt ist 26,192.8 Da. Für deGFP ausgedrückt in der Dose enthalten, zellfreie Reaktion eine Masse von 26202,5 ​​Da erscheint. Die erwarteten Massen für den nativen deGFP6Arg und dem modifizierten deGFP6Can mit Arg vollständig von Can sind 26.193 Da und 26.204 Da bzw. ersetzt werden. Die Massendifferenz von 1,5 Da für deGFP6Can ist innerhalb der Fehler des Spektrums Entfaltungs. Somit ist die vollständige Einbeziehung von Can in deGFP bei allen 6 Arg Positionen bestätigt. Die beiden Spitzen der reduzierten Intensität entsprechen dem nativen deGFP6Arg und modifizierte deGFP6Can, die nicht ihre reifen Fluorophor erreichen. Der Fluorophor ist autokatalytisch durch Abspaltung eines H 2 O - Molekül erzeugt wird , gefolgt von einer Oxidation. Dies führt zu einer Masse von 20 Da erhöht, wenn dieser Prozess nicht abläuft. pg &quot;/&gt; Abbildung 1. SDS-PAGE Auswertung des Experiments Einarbeitung kann und HPLC-ESI - Massenspektroskopie der zellfreien exprimiert und gereinigt deGFP Molekülen. (A) Vorläufige Bewertung des Can SDS-PAGE Einverleibung Experiment verwendet wird . Von links nach rechts: Protein-Standard, Referenz zellfreie Reaktion, negative Kontrolle und zellfreie Reaktion Bereitstellung anstelle von Arg Can. (B) SDS-PAGE nach His-Tag Reinigung und Pufferaustausch der exprimierten deGFP Molekülen. Von links nach rechts: Protein-Standard, gereinigt deGFP aus der Referenzreaktion gereinigt deGFP aus der Dose enthält Reaktion. (C) Bestätigung der vollständigen Einbeziehung kann durch HPLC-ESI - Massenspektroskopie. Die erwarteten Massen des nativen deGFP und dem modifizierten deGFP mit Arg vollständig durch Can ersetzt sind 26.193 Da und 26.204 Da auf. Jedes Spektrum wird normiert auf die höchste Intensität (counts). Spitzenpositionen werden angezeigtin Da. Für die Visualisierung werden die Gel-Bahnen aus dem Gel Bilder extrahiert, miteinander verbunden sind, werden in Grauskala-Format umgewandelt wird Größe optimiert und Kontrast sowie Helligkeit verbessert werden. Original - Gel Fahrspuren in ergänzendes Material präsentiert 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2A zeigt die vorläufige SDS-PAGE Auswertung des Hyl Inkorporation experiment. In dem zellfreien Reaktion, die mit Hyl vorgesehen ist, wird deGFP ausgedrückt. Im Gegensatz zu dem ersten Experiment wurde eine schwache deGFP Band kann in der negativen Kontrollreaktion zu beobachten. Dies könnte zu Lys-Reste in den zellfreien Reaktionen beruhen. Dies ermöglicht einen leichten deGFP Expression in der negativen Kontrollreaktion, wo weder noch Lys Hyl zugegeben. Für H<html> PLC-ESI - Massenspektroskopie, die deGFP Moleküle der zellfreien Reaktion bereitgestellt mit Hyl werden gereinigt und der Puffer ausgetauscht wird (2B). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> Abbildung 2. SDS-PAGE Auswertung des Hyl Einverleibung Experiment (A) Von links nach rechts:. Negative Kontrolle zellfreie Reaktion, zellfreie Reaktion , die Hyl und Proteinstandard. (B) SDS-PAGE nach His-Tag Reinigung und Pufferaustausch der exprimierten deGFP Molekülen. Von links nach rechts: Gereinigte deGFP aus der Hyl enthaltenden Reaktions und Proteinstandard. Für die Visualisierung werden die Gel-Bahnen aus dem Gel Bilder extrahiert, miteinander verbunden sind, werden in Grauskala-Format umgewandelt wird Größe optimiert und Kontrast sowie Helligkeit verbessert werden. Original-Gel Fahrspuren in ergänzendes Material 3 dargestellt.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Figur 3 zeigt den entfalteten Massenspektrum von gereinigtem deGFP Molekülen. 3A die Hypothese bereits Lys - Reste in den zellfreien Reaktionen bestätigt. Die vorherrschende Spitze des Spektrums entspricht der nativen deGFP (erwartete Masse: 26.193 Da). deGFP Moleküle einer 20 Da höhere Masse, die nicht ihre Fluorophor entwickeln kann wieder erkannt werden. Die Lys - Reste werden bevorzugt auf die tRNA Lys geladen durch Lysyl-tRNA-Synthetase zu einem hohen Expressionsniveau der einheimischen deGFP18Lys führt. Die Massendifferenz zwischen Hyl und Lys 16 Da. Aufgrund des Vorhandenseins von Hyl, die an die Lys-Reste alle möglichen deGFP Spezies erzeugt werden, in Konkurrenz (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (3B). Zugegeben, überlappt die Spitze des deGFP1Hyl + 17Lys mit der Spitze des nativen deGFP, die nicht seine Fluorophore (3A) und die Masse von einigen Spitzen erzeugen unterscheidet sich mehr als 2 Da von der erwarteten Masse. Diese Massendifferenzen können aufgrund der geringen Mengen der deGFP Spezies zu hohen Lärm zurückzuführen. Jedoch wird Hyl allgemein durch das zellfreie System eingebaut. Weitere Verbesserungen haben getan werden Lys-Reste in den zellfreien Reaktionen abzuschaffen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> . Abbildung 3. HPLC-ESI - Massenspektroskopie der gereinigten deGFP Moleküle der zellfreien Reaktion , die Hyl (A) Die nativen deGFP18Lys wird überwiegend nachgewiesen (erwartete Massen: mit Fluorophor 26.193 Da, ohne reife Fluorophor 26.213 Da). (B)Vergrößerung offenbart die Existenz aller möglichen deGFP Arten (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). Ihre erwarteten Massen sind 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). Das Spektrum wird normiert auf die höchste Intensität (counts). Spitzenpositionen in Da angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> Ergänzendes Material 1. Berechnung Vorlage. In Abschnitt 2 wird die Vorbereitung des Master - Mix Energiepuffer wird mit Rohextrakt Aliquots von 30 &amp; mgr; l beispielhaft und optimale Mg- und K-Glutamat - Konzentrationen von jeweils 3 mm und 30 mm. Dieses Beispiel führt zu einem Master-Mix Volumen, das 3 Energiepuffer Aliquots ergibt. in section 3 wird die Herstellung der zellfreien Reaktion beispielhaft auf einen optimalen Vektor - DNA - Konzentration von 10 nM in der zellfreien Reaktion eine 90 nM DNA - Stammlösung führt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> Für eine geeignete Rückverfolgbarkeit, die Verwendung der Berechnungsvorlage wird durch Einsetzen dieser typischen Werte veranschaulicht, die von dem obigen Beispiel abweichen: Rohextrakt Volumen: 28 &amp; mgr; l, optimal Mg-glutamat: 2 mM, optimaler K-Glutamat: 40 mm, Anzahl der gewünschten Puffer Aliquots: 100, optimale Vektor-Konzentration in zellfreien Reaktion: 8 nM, DNA-Vektor-Stammlösung: 150 nM. Zunächst 28 &amp; mgr; l als Rohextrakt Volumen in den orangefarbenen Bereich des ersten Abschnitts Vorlage eingeben. Geben Sie dann in die zweite Schablonenabschnitt 2 mM eined 40 mM als optimal Mg- und K-Glutamat-Konzentrationen in den orangefarbenen Feldern. Unter Berücksichtigung der optimalen Mg- und K-Konzentrationen, die Zusammensetzung einer 15 ul Energiepuffer, sowie eine entsprechende, vergrößert 16 &amp; mgr; l-Aliquot wird berechnet. Unten geben Sie entsprechend 100 als gewünschte Anzahl von Energiepuffer Aliquots (16 ul). Die Vorlage passt die Volumina der verschiedenen Pufferkomponenten für die 1.700 &amp; mgr; l Master-Mix, wie folgt: 204 ul 100 mM Mg-glutamat-Stammlösung, 136 ul 3 M K-Glutamat-Stammlösung, 728,73 &amp; mgr; l 14x Energielösung, 510 ul von 40% PEG-8000 und 121,27 ul steriles ddH 2 O. Schließlich wird in der dritten Schablonenabschnitt, geben Sie 8 nM und 150 nM als optimale Vektor-Konzentration in der zellfreien Reaktion und jeweils Vektor-DNA-Stammlösung Konzentration. Die Vorlage passt die Mengen der verschiedenen Komponenten, die zu den 28 &amp; mgr; l Rohextrakt zugegeben werden müssen, die Herstellung einer 90 &amp; mgr; l zu finalisierenzellfreie Reaktion wie folgt: 15 ul Energiepuffer, 15 ul einer der drei unterschiedlich zusammengesetzte Lösungen Aminosäure, 4,80 ul Vektor - DNA - Lösung (150 nM) und 27,20 &amp; mgr; l sterilem ddH 2 O. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> Ergänzendes Material 2. Ein - Buchstaben - Aminosäuresequenz des Modellproteins deGFP. Dieses Modell Protein enthält 6 Arg und 18 Lys Positionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> Ergänzendes Material 3. In voller Länge und nicht modifizierten Gelspuren , die in jedem einzelnen s präsentiert die Gelt Bilder präsentiert Abbildung 1 und 2. Die Gelspuren entsprechen<html> ubfigure aus demselben SDS-Polyacrylamidgel extrahiert. In Abbildung 1 und 2 dieser Bahnen wurden zusammen für Präsentationszwecke verbunden. Molekulargewichte der Proteinstandard Bänder neben den Figuren angedeutet. (A.1) Unkupierte Gelspuren von 1A. Von links nach rechts: Protein-Standard, Referenz zellfreie Reaktion, negative Kontrolle und zellfreie Reaktion Bereitstellung anstelle von Arg Can. (A.2) Unkupierte Gelspuren von 1B. Von links nach rechts: Protein-Standard, gereinigt deGFP aus der Referenzreaktion gereinigt deGFP aus der Dose enthält Reaktion. (B.1) Unkupierte Gelspuren von 2A. Von links nach rechts: Negative Kontrolle zellfreie Reaktion, zellfreie Reaktion, die Hyl und Proteinstandard. (B.2) Unkupierte Gelspuren von 2B. Von links nach rechts: Gereinigte deGFP aus der Hyl enthaltenden Reaktions und Proteinstandard.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ein einfach zu bedienendes, zellfreies Expressionsprotokoll für den rückstandsspezifischen Einbau von nicht-kanonischen Aminosäureanaloga in Proteine, einschließlich Downstream-Analysen, wird für medizinische, pharmazeutische, strukturelle und funktionelle Studien vorgestellt.

Rückstands spezifische Einbau nichtkanonischer Aminosäuren in Modellproteine ​​eine Verwendung<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zellfreie Transkription-Translation-System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, nichtkanonische Aminosäureanaloga gezielt in Modellproteine mithilfe eines zellfreien Expressionssystems einzubauen und eine nachgeschaltete Analyse bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen medizinische Pharmazie und Strukturbiologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Rolle nichtkanonischer Aminosäuren in der Proteinstruktur. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass toxische Aminosäuren in Abwesenheit eines lebenden Wirts in Modellproteine eingebaut werden können. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie Vollkonzentratlösungen der 20 kanonischen Aminosäuren oder CAAs sowie die zuvor hergestellte Stammlösung der nichtkanonischen Aminosäure oder ncAA auf Raumtemperatur bringen. Sobald die Lösungen aufgetaut sind, wirbeln Sie sie mehrfach um, um ausfallende Aminosäuren wieder aufzulösen, und stellen Sie die Aminosäuren anschließend auf Eis. Übertragen Sie danach 1,4 Milliliter sterilen zweifach destillierten Wassers in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie es auf Eis. Fügen Sie nacheinander jeweils 175 Mikroliter jeder Aminosäure-Stammlösung hinzu, wirbeln Sie das Röhrchen nach jeder Zugabe gründlich durch und stellen Sie es danach wieder auf Eis. Nach Zugabe aller Aminosäuren wirbeln Sie das Röhrchen gründlich durch. Inkubieren Sie das Röhrchen, bis die Lösung so klar wie möglich ist. Teilen Sie die Aminosäure-Mastermix-Lösung in drei gleiche Volumina von jeweils 1,35 Milliliter in 1,5-ml-Reaktionsröhrchen auf und bewahren Sie diese auf Eis auf. Geben Sie 50 Mikroliter der 168 Millimolar-Stammlösung der CAA, die der ncAA entspricht, in das erste Teilvolumen, um eine Aminosäurelösung herzustellen, die alle 20 CAAs enthält. Wirbeln Sie die Lösung gründlich durch und stellen Sie das Röhrchen danach wieder auf Eis. Portionieren Sie die Lösung in Reaktionsröhrchen ab, beschriften Sie diese mit „+CAA“ und schockfrieren Sie die Aliquots in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Geben Sie als Nächstes 50 Mikroliter sterilen zweifach destillierten Wassers zum zweiten Teilvolumen des Aminosäure-Mastermixes, um eine Aminosäuremischung herzustellen, die 19 CAAs enthält, wirbeln Sie die Lösung gründlich durch und stellen Sie sie anschließend auf Eis. Portionieren Sie die Lösung ab und beschriften Sie die Röhrchen mit „–CAA“. Fügen Sie schließlich 50 Mikroliter der 168 Millimolar-Stammlösung der ncAA zum letzten 1,35-Milliliter-Teilvolumen hinzu, um eine Aminosäuremischung herzustellen, die 19 CAAs und die ncAA enthält. Wirbeln Sie die Mischung gründlich durch und stellen Sie sie danach wieder auf Eis. Portionieren, beschriften und einfrieren Sie die Röhrchen. Tauen Sie auf Eis drei 30-Mikroliter-Aliquots rohen Extrakt auf – einen +CAA-Aliquot, einen –CAA-Aliquot und einen ncAA-Aliquot – sowie drei Aliquots Energiemix und die Vektor-DNA-Lösung. Stellen Sie sterilen zweifach destillierten Wassers auf Eis. Geben Sie danach 15 Mikroliter Energiemix hinzu, pipettieren Sie die Lösung mehrfach auf und ab und wirbeln Sie sie vorsichtig durch, um sie zu mischen. Fügen Sie 15 Mikroliter des +CAA-Aminosäurelösung-Aliquots, 10 Mikroliter der 90 Nanomolar-Vektor-DNA-Lösung und 20 Mikroliter sterilen zweifach destillierten Wassers zu den 30 Mikrolitern rohen Extrakt hinzu. Richten Sie die negative Kontrolle ein, indem Sie 15 Mikroliter Energiemix, 15 Mikroliter –CAA, 10 Mikroliter der 90 Nanomolar-Vektor-DNA-Lösung und 20 Mikroliter sterilen zweifach destillierten Wassers zu den 30 Mikrolitern rohen Extrakt hinzufügen. Fahren Sie mit der ncAA-Reaktion fort, indem Sie 15 Mikroliter Energiemix, 15 Mikroliter +ncAA, 10 Mikroliter der 90 Nanomolar-Vektor-DNA-Lösung und 20 Mikroliter sterilen zweifach destillierten Wassers zu den 30 Mikrolitern rohen Extrakt kombinieren. Inkubieren Sie danach alle Röhrchen. Zehn Minuten vor der Durchführung der SDS-PAGE verdünnen Sie je ein Mikroliter jeder viskosen zellfreien Reaktion in vier Mikroliter sterilem zweifach destillierten Wasser in Reaktionsröhrchen. Wirbeln Sie gründlich durch und zentrifugieren Sie die Flüssigkeiten kurz mit einem Minizentrifugen. Geben Sie fünf Mikroliter 2X-Lade-Puffer zu den fünf Mikrolitern verdünnter zellfreier Reaktion hinzu. Wirbeln Sie gründlich durch und zentrifugieren Sie die Flüssigkeiten mit einer Minizentrifuge. Stellen Sie die Reaktionsröhrchen in einen Heizblock und vergewissern Sie sich, dass die Deckel ordnungsgemäß verschlossen sind. Übertragen Sie inzwischen den Laufpuffer in die Gelelektrophoresekammer. Nach dem Erhitzen zentrifugieren Sie die Flüssigkeit mit einer Minizentrifuge. Nach der Zentrifugation wirbeln Sie die Röhrchen kurz durch und wiederholen das Zentrifugieren. Übertragen Sie 15 Mikroliter Proteinstandard und je 10 Mikroliter jeder Probe in die Geltaschen und starten Sie die Elektrophorese. Entnehmen Sie das Gel vorsichtig aus der Kassette und fixieren Sie es 30 Minuten lang. Übertragen Sie danach das Gel 60 Minuten lang in die Färbelösung. Nach der Färbung überführen Sie das Gel 60 bis 120 Minuten lang in die Entfärbelösung. Mischen Sie gleiche Volumina His-Bindungspuffer und zellfreie Reaktion und pipettieren Sie die Mischung mehrfach auf und ab. Wirbeln Sie das Röhrchen danach vorsichtig durch. Bauen Sie anschließend das Säulensystem zusammen. Wirbeln Sie die Stammlösung des His-Affinitäts-Gels gründlich durch, bis das Gelharz vollständig suspendiert ist. Übertragen Sie mithilfe einer 1-Milliliter-Pipettenspitze 250 Mikroliter Gelharz in die Säule. Zentrifugieren Sie die Säule fünf bis zehn Sekunden bei 13.000 bis 15.000 × g. Stellen Sie sicher, dass das Gelharz vollständig abgelaufen ist, und übertragen Sie danach 150 bis 300 Mikroliter der Mischung aus zellfreier Reaktion und His-Bindungspuffer auf die Säule. Zentrifugieren Sie die Säule. Entsorgen Sie den Durchlauf und setzen Sie die Säule zurück in das Sammelröhrchen. Geben Sie 250 Mikroliter His-Waschpuffer hinzu und klopfen Sie leicht sowie wirbeln Sie die Säule vorsichtig durch, um das Gelharz erneut aufzuschwemmen. Zentrifugieren Sie das Säulenröhrchen. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen und setzen Sie die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Standard-Reaktionsröhrchen ein. Geben Sie 150 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und resuspendieren Sie das Gelharz durch leichtes Klopfen und vorsichtiges Wirbeln. Zentrifugieren Sie die Säule, um das gereinigte Protein im Elutionspuffer zu verdünnen. Entfernen Sie zuerst die untere Kappe von der Gel-Filtrations-Spin-Säule und danach die obere Kappe. Setzen Sie die Säule in ein 2-Milliliter-Waschröhrchen ein und zentrifugieren Sie sie, um den Gel-Lagerungspuffer zu entfernen. Entsorgen Sie den Durchlauf, geben Sie anschließend bis zu 400 Mikroliter des Protein-Lagerungspuffers hinzu und zentrifugieren Sie die Säule. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal, damit der gesamte Protein-Lagerungspuffer in das Gel geladen wird. Setzen Sie die Säule in ein frisches Sammelröhrchen ein und geben Sie vorsichtig bis zu 100 Mikroliter der Lösung des gereinigten Modellproteins direkt in die Mitte des Gelbetts. Zentrifugieren Sie die Säule. Nach dem Pufferaustausch geben Sie die gesamten 100 Mikroliter Modellproteinlösung in ein offenes Röhrchen in den rotierenden Vakuumkonzentrator. Schließen Sie den Deckel des Konzentrators und starten Sie die Rotation bei 30 Grad Celsius. Diese SDS-PAGE zeigt die erfolgreiche Einbindung von L-Canavanin oder Can in das Zielprotein deGFP. Die Referenz-Zellfreie Reaktion weist die höchste deGFP-Expressionsrate auf. Die zellfreie Can-Reaktion ergibt eine leicht geringere deGFP-Konzentration, während im negativen Kontrollversuch keine deGFP-Expression nachweisbar ist. Eine SDS-PAGE wurde nach His-Tag-Reinigung und Pufferaustausch der exprimierten deGFP-Moleküle durchgeführt. HPLC

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