Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, humane pluripotente Stammzellen mit hoher Effizienz und Reproduzierbarkeit in Kardiomyozyten zu differenzieren. Dieses Protokoll kann in einem Bioreaktor hochskaliert oder für die Differenzierung von Zelllinien modifiziert werden, die für Einzelzellkulturen empfindlich sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Modellierung von Herzerkrankungen mit humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zu beantworten.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie kostengünstig ist und eine hohe Effizienz, Reproduzierbarkeit und Anwendbarkeit sowohl für menschliche embryonale als auch für induzierte pluripotente Stammzellen aufweist. Unsere heutige Demonstratorin ist Hananeh Fonoudi, derzeit Doktorandin am Victor Chang Cardiac Research Institute, die vom Royan Institute zu uns kommt. Verwenden Sie vor dem Beschichten eine Reinigungsbürste und destilliertes Wasser, um Staub oder Kulturrückstände mit einem Glaspendel gründlich von Staub oder Kulturrückständen aus einem 100-Milliliter-Spinnerkolben zu entfernen.

Füllen Sie anschließend den Kolben mit 70% Ethanol. Nach 30 Minuten wird der Kolben mit destilliertem Wasser gespült und mit fünf molaren Natriumhydroxid gefüllt. Spülen Sie den Blitz am nächsten Morgen fünf Minuten lang unter fließendem Wasser ab und füllen Sie ihn mit einem molaren Salzsäure.

Spülen Sie den Kolben nach 15 Minuten weitere fünf Minuten unter fließendem Wasser aus, gefolgt von zwei Spülgängen mit doppelt destilliertem Wasser. Stellen Sie den Kolben zum Trocknen in eine Biosicherheitswerkbank. Geben Sie dann 1,5 Milliliter Silikonisierungslösung in den Kolben und drehen Sie den Kolben horizontal, um alle Oberflächen mit Silikon zu bedecken.

Den beschichteten Kolben im Trockenofen eine Stunde lang bei 100 Grad Celsius erhitzen. Wenn der Kolben abgekühlt ist, spülen Sie ihn dreimal 15 Minuten lang mit entionisiertem Wasser aus. Sterilisieren Sie den Behälter dann im Autoklaven bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten.

Nach dem Passieren undifferenzierter Sphäroide unter Verwendung der Einzelzell-Passierensmethode mindestens dreimal wird eine Fünf-Milliliter-Pipette verwendet, um alle undifferenzierten Sphäroide in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Waschen Sie die Vertiefungen mit einem Milliliter humanem embryonalem Stammzellmedium, um alle verbleibenden Sphäroide zu sammeln, und legen Sie die Wäsche mit den geernteten Sphäroiden zusammen. Lassen Sie die Sphäroide fünf Minuten lang sedimentieren, um ein loses Pellet zu bilden.

Aspirieren Sie dann den Überstand und achten Sie darauf, keine Sphäroide zu entfernen. Spülen Sie anschließend die Sphäroide fünf Minuten lang mit einem Milliliter PBS und inkubieren Sie sie in 5 Millilitern Trypsin EDTA bei 37 Grad Celsius. Nach vier bis fünf Minuten stoppen Sie die Reaktion mit einem Milliliter humanem embryonalem Stammzellmedium und verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die Sphäroide in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren.

Nach der Zählung durch Trypanblau-Ausschluss resuspendieren die Zellen in einem konditionierten Medium, das mit dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor und dem ROCK-Inhibitor ergänzt ist, und überführen Sie 100 Milliliter der Zellsuspension in den silikonisierten Bioreaktorkolben. Stellen Sie den Kolben bei 35 U/min auf das Rührwerk. Erhöhen Sie nach 24 Stunden das Rührwerk auf 40 U/min.

Nach 48 Stunden wird die Bewegung für fünf bis zehn Minuten gestoppt, bis sich alle reformierten Sphäroide am Boden des Kolbens abgesetzt haben, und die Hälfte des Mediums durch konditioniertes Medium ersetzt, das mit dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor ergänzt ist. Starten Sie dann das Rührwerk für weitere 24 Stunden bei 40 U/min neu und ersetzen Sie in den nächsten drei Tagen täglich die Hälfte des Mediums durch den gleichen Prozess. Halten Sie das Rührwerk am fünften Tag für fünf bis zehn Minuten an.

Übertragen Sie dann alle Sphäroide in ein 50-Milliliter-Röhrchen in 50 Millilitern Medium oder weniger. Das restliche Medium aus dem Kolben wird verworfen, wobei darauf zu achten ist, dass sich keine Sphäroide im Gefäß befinden. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand von den abgesetzten Sphäroiden und waschen Sie die Zellcluster in 25 Millilitern PBS mit Kalzium und Magnesium.

Entfernen Sie nach fünf bis zehn Minuten die Wäsche und resuspendieren Sie die Sphäroide in 40 Millilitern RPMI-B27-Medium, das mit Glykogensynthase-Kinase-3-Inhibitor, ROCK-Inhibitor und Polyvinylalkohol ergänzt wird. Alle Sphäroide werden wieder in den Bioreaktorkolben überführt. Geben Sie dann frisches RPMI-B27-Medium zu einem Gesamtvolumen von 100 Millilitern hinzu und starten Sie das Rühren bei 40 U/min neu.

Befolgen Sie nach 24 Stunden den gleichen Vorgang, um das Medium vom RPMI-B27-Medium zu wechseln. Nach weiteren 24 Stunden gehen Sie auf den gleichen Fall vor und wechseln Sie das Medium mit RPMI-B27 plus IWP2, Purmorphamin und SB43. 48 Stunden einwirken lassen.

Die ersten Schläge werden in der Regel nach sieben Tagen beobachtet. Für die schnelle Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzelllinien, die nicht an Einzelzellkulturen angepasst wurden, behandeln Sie zunächst 70 bis 80 % konfluente humane pluripotente Stammzellkulturen, die auf embryonalen Fibroblastenzellen der Maus gezüchtet wurden, mit 5 Millilitern Dissoziationslösung für 30 bis 60 Sekunden. Die Dissoziationslösung sollte nur so lange belassen werden, bis sich die MEFs aufrunden und die Ränder der hPSC-Kolonie klar werden.

Wenn die Zellen zu lang bleiben, unterscheiden sie sich nicht richtig. Ersetzen Sie zum richtigen Zeitpunkt schnell die Dissoziationslösung durch 75 Milliliter Kollagenase Typ IV und inkubieren Sie die Zellen fünf bis 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, wobei Sie die Kultur alle paar Minuten unter dem Mikroskop überprüfen. Wenn sich ganze Kolonien abzulösen beginnen, ersetzen Sie die Kollagenase durch 1,5 Milliliter humanes embryonales Stammzellmedium und lösen Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig ganze Zellkolonien vom Boden der Platte.

Die Zellen sollten vorsichtig abgelöst werden, damit die Kolonien nicht in kleine Stücke zerfallen. Verwenden Sie dann eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen, und waschen Sie die Vertiefungen mit einem Milliliter humanem embryonalem Stammzellmedium, wobei Sie alle verbleibenden Zellen in dem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln. Nach fünfminütiger Sedimentation wird der Überstand vorsichtig durch zwei Milliliter frisches humanes embryonales Stammzellmedium ersetzt, das mit dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor ergänzt wurde.

Mit einer neuen Fünf-Milliliter-Pipette werden die Zellen in eine extrem niedrige Anheftungsplatte überführt und die Kolonien sechs bis 12 Stunden lang inkubiert. Am Ende der Inkubation verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die Kolonieaggregate vorsichtig in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen zu überführen, und sammeln Sie alle verbleibenden Aggregate mit einem RPMI-B27-Medium Wash. Wenn sich die Kolonien abgesetzt haben, ersetzen Sie den Überstand durch frisches RPMI-B27-Medium, das mit einem Glykogensynthase-Kinase-3-Inhibitor ergänzt ist, und übertragen Sie die Kolonien vorsichtig auf lamininbeschichtete Platten, um sie bei 37 Grad Celsius zu befestigen.

Wechseln Sie nach 24 Stunden das Medium durch das RPMI-B27-Medium. Wechseln Sie nach weiteren 24 Stunden das Medium durch RPMI-B27, das IWP2, Purmorphamin und SB43 enthält. Die ersten Schläge werden in der Regel nach sieben Tagen beobachtet.

Bisher wurde das Protokoll zur Differenzierung der statischen Suspension an fünf humanen embryonalen Stammzellen und vier humanen induzierten pluripotenten Stammzelllinien getestet, was dazu führte, dass mehr als 90 % der Sphäroide aus jeder Linie geschlagen wurden, was die hohe Reproduzierbarkeit dieses Protokolls bei verschiedenen humanen pluripotenten Stammzelllinien zeigt. Die differenzierenden Sphäroide zeigen ein ähnliches Verhalten in einer gerührten Suspensionsbioreaktorumgebung wie im statischen System, wobei etwa 100% der Sphäroide an Tag 10 schlagen sollten. Tatsächlich zeigen schlagende Sphäroidschnitte, die an Tag 30 gesammelt wurden, die zytoplasmatische und nukleäre Expression von kardialem Troponin T bzw. dem kardialen Transkriptionsfaktor NKX2,5.

Wenn undifferenzierte Sphäroide durch undifferenzierte Zellaggregate ersetzt werden, treten sieben Tage nach der Differenzierung schlagende Cluster auf. Mit 42 getesteten humanen induzierten pluripotenten Stammzelllinien erzeugten sie bis zum 15. Tag durchschnittlich mehr als 60 % kardiale Troponin-T-positive Zellpopulationen. Die schlagenden Cluster zeigen auch eine ähnliche kardiale Troponin-T-, zytoplasmatische und NKX2,5-Kernexpression, wie sie für die durch den Rührsuspensionsbioreaktor erzeugten Sphäroide beobachtet wurde.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, hPSCs zu verwenden, die vor der Differenzierung im Bioreaktor mindestens drei Passagen lang an die Einzelzellkultur angepasst wurden. Dieses Verfahren kann mit anderen Methoden zur Anreicherung von Kardiomyozyten kombiniert werden, um eine reine Zellpopulation zu erhalten. Diese Technik hat den Weg für die Kommerzialisierung von hPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten geebnet.

Es hat das Potenzial für den Einsatz in der klinischen, pharmazeutischen, Gewebezüchtungs- und Organ- oder Organoidentwicklung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane pluripotente Stammzellen effizient in Kardiomyozyten differenziert und die Kultur im Bioreaktor skaliert.