Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, humane pluripotente Stammzellen mit hoher Effizienz und Reproduzierbarkeit in Kardiomyozyten zu differenzieren. Dieses Protokoll kann in einem Bioreaktor hochskaliert oder für die Differenzierung von Zelllinien angepasst werden, die empfindlich gegenüber Kultur als Einzelzellen sind. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Modellierung von Herzerkrankungen unter Verwendung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen zu beantworten.

Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind ihre Kosteneffizienz sowie hohe Effizienz, Reproduzierbarkeit und Anwendbarkeit für humane embryonale Stammzellen und induzierte pluripotente Stammzellen. Unsere Demonstratorin heute ist Hananeh Fonoudi, derzeit Doktorandin am Victor Chang Cardiac Research Institute, die zu uns vom Royan-Institut kommt. Vor dem Beschichten verwenden Sie eine Reinigungsbürste und destilliertes Wasser, um jeglichen Staub oder Kulturrückstände gründlich aus einem 100 Milliliter fassenden Spinnerkolben mit Glaspendel zu entfernen.

Füllen Sie anschließend den Kolben mit 70 % Ethanol. Nach 30 Minuten spülen Sie den Kolben mit destilliertem Wasser und füllen ihn mit fünf molarer Natronlauge. Am nächsten Morgen spülen Sie den Kolben unter fließendem Wasser für fünf Minuten und füllen ihn mit einmolarer Salzsäure.

Nach 15 Minuten das Kolben unter fließendem Wasser weitere fünf Minuten lang abspülen, gefolgt von zwei Spülgängen mit doppelt destilliertem Wasser. Den Kolben zur Trocknung in einen Sicherheitswerkbank stellen. Anschließend 1,5 Milliliter Silikonisierungslösung zum Kolben hinzufügen und den Kolben horizontal drehen, um alle Oberflächen mit Silikon zu bedecken.

Erhitzen Sie den beschichteten Kolben eine Stunde lang bei 100 Grad Celsius in einem Trockenofen. Nach dem Abkühlen spülen Sie den Kolben dreimal je 15 Minuten mit entionisiertem Wasser aus. Anschließend autoklavieren Sie den Behälter zur Sterilisation bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten.

Nachdem undifferenzierte Sphäroide mindestens dreimal mit der Einzelzell-Passagierungsmethode passiert wurden, alle undifferenzierten Sphäroide mit einer 5-Milliliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Konischglas überführen. Die Vertiefungen mit einem Milliliter menschlichem embryonalen Stammzellmedium ausspülen, um verbliebene Sphäroide einzusammeln, und diese Waschfraktion mit den geernteten Sphäroiden vereinigen. Die Sphäroide fünf Minuten lang sedimentieren lassen, um ein lockeres Pellet zu bilden.

Anschließend den Überstand abziehen, wobei darauf geachtet werden sollte, keine Sphäroide zu entfernen. Danach die Sphäroide mit einem Milliliter PBS für fünf Minuten spülen und sie in 5 Milliliter Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach vier bis fünf Minuten die Reaktion mit einem Milliliter humanem embryonalem Stammzellmedium stoppen und eine P1000-Pipette verwenden, um die Sphäroide in eine Einzelzell-Suspension zu dissoziieren.

Nach der Zählung nach der Trypanblau-Ausschlussmethode die Zellen in konditioniertem Medium, das mit basischem fibroblastärem Wachstumsfaktor und ROCK-Inhibitor ergänzt ist, erneut auf eine Konzentration von 200.000 Zellen pro Milliliter suspendieren und 100 Milliliter der Zellsuspension in die silikonisierte Bioreaktorflasche überführen. Die Flasche auf den Rührer mit 35 U/min stellen. Nach 24 Stunden die Rührgeschwindigkeit auf 40 U/min erhöhen.

Nach 48 Stunden die Agitation fünf bis zehn Minuten lang anhalten, bis alle neu gebildeten Sphäroide sich am Boden des Kolbens abgesetzt haben, und die Hälfte des Mediums durch konditioniertes Medium ergänzt mit basischem Fibroblastenwachstumsfaktor ersetzen. Danach den Agitator erneut mit 40 U/min für weitere 24 Stunden starten und die Hälfte des Mediums jeden Tag nach dem gleichen Verfahren für die nächsten drei Tage erneuern. Am fünften Tag den Agitator fünf bis zehn Minuten lang anhalten.

Überführen Sie anschließend alle Sphäroide in ein 50-Milliliter-Gefäß mit 50 Millilitern Medium oder weniger. Entsorgen Sie das restliche Medium im Kolben unter der Vorsicht, dass keine Sphäroide im Gefäß verbleiben. Entfernen Sie dann vorsichtig das Überstand aus den abgesetzten Sphäroiden und waschen Sie die Zellkluster in 25 Milliliter PBS mit Calcium und Magnesium.

Nach fünf bis zehn Minuten den Waschschritt beenden, die Sphäroide in 40 Milliliter RPMI-B27-Medium resuspendieren, das mit Glykogensynthase-Kinase-3-Inhibitor, ROCK-Inhibitor und Polyvinylalkohol ergänzt wurde. Alle Sphäroide anschließend in den Bioreaktor-Flasken zurücküberführen. Danach frisches RPMI-B27-Medium bis zu einem Gesamtvolumen von 100 Milliliter hinzufügen und die Agitation erneut mit 40 U/min starten.

Nach 24 Stunden denselben Vorgang wiederholen, um das Medium durch RPMI-B27-Medium zu ersetzen. Nach weiteren 24 Stunden denselben Vorgang erneut durchführen und das Medium durch RPMI-B27 ergänzt mit IWP2, Purmorphamin und SB43 wechseln. 48 Stunden einwirken lassen.

Der erste Schlag ist gewöhnlich nach sieben Tagen zu beobachten. Für die schnelle Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzelllinien, die noch nicht an die Kultur als Einzelzellen angepasst wurden, behandeln Sie zunächst eine auf embryonalen Mausfibroblasten kultivierte menschliche pluripotente Stammzellkultur bei 70 bis 80 % Konfluenz mit 5 Milliliter Dissoziationslösung für 30 bis 60 Sekunden. Die Dissoziationslösung sollte nur so lange belassen werden, bis sich die MEFs abrunden und die Ränder der hPSC-Kolonien sichtbar werden.

Wenn die Zellen zu lange belassen werden, differenzieren sie nicht korrekt. Ersetzen Sie die Dissoziationslösung zum geeigneten Zeitpunkt schnell durch 75 Milliliter Kollagenase Typ IV und inkubieren Sie die Zellen für fünf bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, wobei Sie die Kultur alle paar Minuten unter dem Mikroskop überprüfen. Sobald ganze Kolonien beginnen, sich zu lösen, ersetzen Sie die Kollagenase durch 1,5 Milliliter humanen embryonalen Stammzell-Medium und lösen Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig ganze Zellkolonien vom Boden der Platte ab.

Die Zellen sollten vorsichtig abgelöst werden, damit die Kolonien nicht in kleine Stücke zerfallen. Anschließend die Zellen mit einer fünf Milliliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Konischglas umfördern und die Vertiefungen mit einem Milliliter humanem embryonalem Stammzellmedium ausspülen, wobei verbleibende Zellen im 15-Milliliter-Konischglas gesammelt werden. Nach fünfminütiger Sedimentation das Überstandvolumen vorsichtig durch zwei Milliliter frisches, mit basischem fibroblastärem Wachstumsfaktor angereichertes humanes embryonales Stammzellmedium ersetzen.

Unter Verwendung einer neuen fünf Milliliter-Pipette überführen Sie die Zellen in eine Ultra-Low-Attachment-Platte und inkubieren Sie die Kolonien sechs bis zwölf Stunden lang. Am Ende der Inkubation übertragen Sie die Kolonie-Aggregate mithilfe einer fünf Milliliter-Pipette vorsichtig in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und sammeln verbleibende Aggregate mit einem RPMI-B27-Medium-Waschschritt. Nachdem sich die Kolonien abgesetzt haben, ersetzen Sie den Überstand durch frisches RPMI-B27-Medium, das mit einem Glykogen-Synthase-Kinase-3-Inhibitor angereichert ist, und überführen Sie die Kolonien vorsichtig in Laminin-beschichtete Platten zur Anheftung bei 37 Grad Celsius.

Nach 24 Stunden wechseln Sie das Medium in RPMI-B27-Medium. Nach weiteren 24 Stunden wechseln Sie das Medium in RPMI-B27, das IWP2, Purmorphamin und SB43 enthält. Das erste Schlagen wird gewöhnlich nach sieben Tagen beobachtet.

Bisher wurde das statische Suspensionsdifferenzierungsprotokoll an fünf menschlichen embryonalen Stammzelllinien und vier menschlichen induzierten pluripotenten Stammzelllinien getestet, wobei aus jeder Linie mehr als 90 % schlagende Sphäroide hervorgingen, was die hohe Reproduzierbarkeit dieses Protokolls zwischen verschiedenen menschlichen pluripotenten Stammzelllinien belegt. Die differenzierenden Sphäroide zeigen ein ähnliches Verhalten in einem gerührten Suspensions-Bioreaktor-System wie im statischen System, wobei etwa 100 % der Sphäroide am Tag 10 schlagend beobachtet werden. Tatsächlich zeigen Schnitte von schlagenden Sphäroiden, die am Tag 30 gewonnen wurden, die zytoplasmatische und nukleäre Expression von kardialem Troponin T bzw. des kardialen Transkriptionsfaktors NKX2.5.

Außerdem erscheinen sieben Tage nach der Differenzierung kontrahierende Zellkluster, wenn undifferenzierte Sphäroide durch undifferenzierte Zellaggregate ersetzt werden. Bei 42 getesteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzelllinien entstehen im Durchschnitt mehr als 60 % kardiale Troponin-T-positive Zellpopulationen bis zum Tag 15. Die kontrahierenden Zellkluster zeigen zudem einen ähnlichen zytoplasmatischen kardialen Troponin-T- und nukleären NKX2.5-Expressionsmuster, wie bereits bei den in Rührkulturbioreaktoren erzeugten Sphäroiden beobachtet.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, hPS-Zellen zu verwenden, die mindestens drei Passagen vor der Differenzierung im Bioreaktor an die Kultur als Einzelzellen angepasst wurden. Dieses Verfahren kann mit anderen Methoden zur Anreicherung von Kardiomyozyten kombiniert werden, um eine reine Zellpopulation zu erhalten. Diese Technik hat den Weg zur kommerziellen Nutzung von aus hPS-Zellen abgeleiteten Kardiomyozyten geebnet.

Es hat das Potenzial für den Einsatz in klinischen, pharmazeutischen, Gewebeengineering- sowie Organ- oder Organoidentwicklungsanwendungen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie menschliche pluripotente Stammzellen effizient in Kardiomyozyten differenziert und die Kultur in einem Bioreaktor hochskaliert werden können.