Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products
25. Dezember 2016
Dieses Protokoll beschreibt ein Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoff-Transfertechnik, die interzelluläre Kommunikation über Gap Junction Kanäle misst. Gap junctions interzelluläre Kommunikation ist ein wichtiger zellulärer Prozess, durch den Gewebe-Homöostase aufrechterhalten wird und die Unterbrechung dieser Zellsignalisierung hat negative Auswirkungen auf die Gesundheit.
Das übergeordnete Ziel ist es, einen einfachen Assay zur Messung der interzellulären Kommunikation durch eine Population von Säugetierzellen bereitzustellen, der ein breites Spektrum an pharmakologischen und toxikologischen In-vitro-Anforderungen erfüllen kann. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Toxikologie zu beantworten, z. B. ob eine Verbindung die Entwicklung oder den Erhalt eines Gewebes beeinflusst, indem sie die interzelluläre Kommunikation zwischen den Gap Junctions dereguliert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache und schnelle Beurteilung der Gap-Junction-Funktion in einer großen Zellpopulation als Reaktion auf Giftstoffe und Toxine ermöglicht.
Das Verfahren wird von Ajna Uzuni, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, vorgeführt. Zu Beginn des Experiments säen Sie dreimal 10 bis fünfte WB-F344-Rattenleber-Epithelzellen auf Kulturplatten mit einem Durchmesser von 35 Millimetern aus, die das modifizierte Medium von Eagle plus 5 % fötales Rinderserum enthalten. Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator, bis sie eine Konfluenz von 100 % erreichen, und fahren Sie mit der experimentellen Behandlung der Zellen fort.
Um mit Dosis-Wirkungs-Experimenten fortzufahren, fügen Sie 10 Mikroliter und 20 Mikroliter einer zuvor hergestellten, zwei millimolaren Stammlösung von Phenanthren in 100 % Acetonitril und vier Mikroliter, sechs Mikroliter und acht Mikroliter einer 20 millimolaren Stammlösung von Phenanthren in 100 % Acetonitril zu drei Zellplatten hinzu, die zwei Milliliter Wachstumsmedium für jedes hinzugefügte Volumen der Stammlösung enthalten. Als nächstes fügen Sie vier Mikroliter, sechs Mikroliter, acht Mikroliter, 10 Mikroliter und 20 Mikroliter einer 100%igen Lösung von Acetonitril zu drei Zellplatten hinzu, die zwei Milliliter Wachstumsmedium für jedes hinzugefügte Volumen an Acetonitrillösung enthalten, um als Vehikelkontrolle zu dienen. Nach der Zugabe des Acetonitrils die Platten inkubieren.
Um Zeitreaktionsexperimente durchzuführen, geben Sie sieben Mikroliter einer 20 millimolaren Stammlösung von Phenanthren in 100 % Acetonitril zu drei Zellplatten, die für jeden Zeitpunkt zwei Milliliter Wachstumsmedium enthalten. Geben Sie dann sieben Mikroliter 100%iges Acetonitril in drei Zellplatten, die für jeden Zeitpunkt zwei Milliliter Wachstumsmedium enthalten, um als Fahrzeugsteuerung zu dienen. Inkubieren Sie die Platten für jeden angegebenen Zeitpunkt.
Entsorgen Sie das Nährmedium, indem Sie es vorsichtig abgießen. Spülen Sie die Zellen mit drei Millilitern PBS und dekantieren oder aspirieren Sie sie zwischen den Spülgängen. Pipettieren Sie einen Milliliter eines Milligramms pro Milliliter Luzifergelbfarbstoff, der in PBS gelöst ist, in jede Zellplatte.
Laden Sie den Farbstoff in die Zellen vor, indem Sie das Skalpell zwischen Zeigefinger und Daumen einklemmen. Platzieren Sie das Skalpell senkrecht zum Rand der Kulturplatte und fünf Millimeter vom Rand der Kulturplatte entfernt und lassen Sie das Skalpell dann mit Hilfe der Schwerkraft sanft von diesem senkrechten Winkel zu einem Winkel von 15 Grad rollen. Rollen Sie die Klinge durch eine Population von Zellen in drei verschiedenen Bereichen der gesamten Platte.
Inkubieren Sie die Zellen anschließend drei Minuten lang bei Raumtemperatur mit der LY-Lösung. Dekantieren oder aspirieren Sie das LY und spülen Sie die Zellen, um alle extrazellulären Farbstoffe zu entfernen und die extrazelluläre Hintergrundfluoreszenz zu eliminieren. Fügen Sie dann 0,5 Milliliter einer 4%igen phosphatgepufferten Formalinlösung hinzu, um die Zellen zu fixieren.
Betrachten Sie die fixierten Zellen mit einem Epifluoreszenzmikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Richten Sie alle Platten so aus, dass die Einkerbungslinie parallel zum horizontalen Sichtfeld verläuft. Es wurde eine Reihe von SL-DT-Bildern von WB-F344 Rattenleber-Epithelzellen erstellt, die mit steigenden Dosen von Phenanthren behandelt wurden.
Die Abnahme der Migration von luzifergelben Fluoreszenzfarbstoffen wird durch steigende Dosen von Phenanthren verursacht, was die zunehmende durch Toxine induzierte Hemmung der interzellulären Kommunikation (Gap Junctional Intercellular Communication, GJIC) zeigt. Der Anteil der Kontroll- oder FOC-Werte, die aus den SL-DT-Bildern erhalten wurden, wurde gemittelt, statistisch analysiert und dann grafisch dargestellt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Western Blots von einzelnen Transduktionsproteinen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.
Aktivieren diese Verbindungen mitogene Ereignisse der Zellperforation?
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Ladung eines Skalpells und zur Übertragung fluoreszierender Farbstoffe, die die zelluläre Kommunikation durch Gap-Junction-Kanäle misst. Diese Methode bietet einen einfachen Test zur Beurteilung der gap-junctionalen zellulären Kommunikation in Säugerzellen, was für das Verständnis der Gewebehomöostase entscheidend ist.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Toxikologie
Hintergrund
- Die gap-junctionale zelluläre Kommunikation ist für die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase unerlässlich.
- Die Störung dieser Kommunikation kann zu nachteiligen gesundheitlichen Auswirkungen führen.
- Diese Technik ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Gap-Junction-Funktion.
- Sie kann in verschiedenen pharmakologischen und toxikologischen Studien angewendet werden.
Zweck der Studie
- Um die Auswirkungen von Verbindungen auf die gap-junctionale zelluläre Kommunikation zu messen.
- Um eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der Gewebeentwicklung und -erhaltung bereitzustellen.
- Um die Forschung in der Toxikologie in Bezug auf die Auswirkungen von Toxinen auf die zelluläre Kommunikation zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Aussaat von WB-F344 Rattenleberepithelzellen auf Kulturplatten.
- Zellkultur bis zur Erreichung von 100% Konfluenz.
- Anwendung experimenteller Behandlungen auf die Zellen.
- Nutzung der Übertragung fluoreszierender Farbstoffe zur Beurteilung der zellulären Kommunikation.
Hauptergebnisse
- Die Technik ermöglicht die Beurteilung der Gap-Junction-Funktion in großen Zellpopulationen.
- Sie liefert Einblicke darüber, wie Toxine die zelluläre Kommunikation beeinflussen.
- Bewiesene Wirksamkeit in verschiedenen In-vitro-Studien.
- Schnelles und einfaches Protokoll erhöht die Forschungseffizienz.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode ist ein wertvolles Werkzeug für die toxikologische Forschung.
- Sie hilft beim Verständnis der Rolle von Gap Junctions für die Gewebegesundheit.
- Zukünftige Studien können ihre Anwendungen in der Pharmakologie erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Gap junctional intercellular communication (GJIC) serves as a functional biomarker for assessing tissue homeostasis disruption by toxicants and evaluating protective effects of natural products. The scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique enables rapid, population-level assessment of GJIC inhibition, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This assay provides predictive confidence for prioritizing compounds based on their impact on cellular communication pathways critical to organ function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking compound exposure to GJIC disruption as a mechanism of toxicity.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of intercellular channel activity in live cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying early biomarkers of adverse effects on tissue maintenance and homeostasis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline GJIC competence.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative dye transfer readouts amenable to automation and high-throughput imaging.
- Scalability: Adapted for in vivo tissue slices and amenable to automated fluorescence microscopy for increased sample throughput.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through conserved GJIC mechanisms across species.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from disrupted intercellular communication rather than off-target effects.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying structure-activity relationships in GJIC modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The SL-DT assay functions as a discovery-stage tool for mechanistic insight, positioned before lead optimization to filter compounds with high tissue disruption risk.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how toxicants or natural products alter intercellular signaling networks.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, population-based functional readouts that reflect tissue-level communication.
- Analytics: Generates fraction of control (FOC) values enabling statistical comparison across doses and time points.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by linking GJIC function to tissue integrity outcomes in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform across toxicology, pharmacology, and nutraceutical development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct functional readout of gap junction channel activity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via simple scalpel loading and fixed-endpoint imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking early GJIC disruption to downstream adverse tissue effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by identifying compounds that preserve intercellular communication homeostasis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescent dye handling, and epifluorescence microscopy.
- Depends on standardized scalpel technique and consistent incubation times for reliable dye transfer.
- Necessitates cross-team agreement on image analysis thresholds and morphometric parameters.
- Adaptable across mammalian cell types and tissue slices with optimization of loading and fixation parameters.
- Limited to assessing functional channel activity; does not distinguish between connexin expression, phosphorylation, or gating states.
