Name: Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Lernen Sie die Scalpel-Loading-Technik zur Messung der Gap-Junction-Kommunikation in WB-F344-Rattenleberzellen. Diese einfache Methode ermöglicht schnelle toxikologische Bewertungen von Schadstoffen.

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Das Protokoll für diese Studie wurde von der Animal Care and Utilization Ausschuss der National Institutes of Health Sciences of Japan zugelassen , was ist , wo die in - vivo - Experimente durchgeführt wurden, um sicherzustellen , dass die Ratten auf humane Weise und mit Bezug zur Linderung des Leidens behandelt wurden. 1. SL-DT Bioassay <ol><li> Seed 3 x 10 5 WB-F344 Rattenleber - Epithelzellen auf 35 mm Durchmesser - Kulturplatten Eagles enthaltend modifiziertes Medium plus 5% fötalem Rinderserum, und Kultur der Zellen in einem Inkubator bei 37 ºC, 100% relative Luftfeuchtigkeit (RH), 5% CO 2. </li><li> Kultur die Zellen bis zum Erreichen von 100% Konfluenz (typischerweise, 2 Tage), und leiten die gewünschte experimentelle Behandlung der Zellen wie nachfolgend beschrieben. <ol><li> Führen Dosis-Wirkungs-Experimente <ol><li> Fügen Sie 10 &amp; mgr; l und 20 &amp; mgr; l einer 2 mM Vorratslösung von Phenanthren in 100% Acetonitril und 4 &amp; mgr; l, 6 ul und 8 ul einer 20 mM Stammlösung von phenanThren in 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für jedes hinzugefügte Volumen der Vorratslösung. </li><li> Hinzufügen 4 ul, 6 ul, 8 ul, 10 ul und 20 ul einer 100% igen Lösung von Acetonitril zu drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für jedes hinzugefügte Volumen Acetonitril-Lösung als Fahrzeugsteuerung zu dienen. </li><li> Inkubieren Platten für 15 min in einem Inkubator bei 37 ° C, 100% RH und 5% CO 2 eingestellt. </li><li> Gehen Sie zu Schritt 1.3 umgesetzt. </li></ol></li><li> Verhaltenszeitverhalten Experimente <ol><li> ADD 7 &amp; mgr; l einer 20 mM Stammlösung von Phenanthren in 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für jeden Zeitpunkt (dh 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min). </li><li> ADD 7 ul 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für jeden Zeitpunkt als die Fahrzeugsteuerung zu dienen. </li><li> Die Platten für jede bestimmte Zeit point in einem Inkubator bei 37 ° C, 100% RH und 5% CO 2. </li><li> Gehen Sie zu Schritt 1.3 umgesetzt. </li></ol></li><li> Führen Sie Zeitwiederfindungsversuche <ol><li> ADD 7 &amp; mgr; l einer 20 mM Stammlösung von Phenanthren in 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für 15 min. </li><li> ADD 7 ul 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für 15 min, wenn die Fahrzeugsteuerung zu dienen. </li><li> Dekantiert, das Medium entweder das Phenanthren oder Acetonitril und spülen 3x mit je 3 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) enthält. </li><li> 2 ml frischem Wachstumsmedium auf jeder Platte und Inkubation für den gewünschten Wiederherstellungszeiten (dh 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) in einem Inkubator bei 37 ° C, 100 % rF und 5% CO 2. </li><li> Gehen Sie zu Schritt 1.3 umgesetzt. </li></ol></li><li> Verhaltensmechanismus Experimente <ol><li> Fügen Sie die Signaltransduktion Inhibitor, dh </li><li> Zugabe von 5 &amp; mgr; l 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium für 15 min, wenn die Fahrzeugsteuerung zu dienen. </li><li> ADD 7 &amp; mgr; l einer 20 mM Stammlösung von Phenanthren in 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium plus der D609 für weitere 15 min. </li><li> ADD 7 ul 100% Acetonitril bis drei Platten von Zellen mit 2 ml Wachstumsmedium plus 100% Acetonitril für weitere 15 min, wenn die Fahrzeugsteuerung zu dienen. </li><li> Gehen Sie zu Schritt 1.3 umgesetzt. </li></ol></li></ol></li><li> Entsorgen Sie das Kulturmedium durch entweder sanft das Medium oder durch Vakuum-Saug-Abgießen. Hinweis: Entsorgen Kulturmedium in geeigneter Weise gefährliche Abfälle enthalten. </li><li> Spülen Sie die Zellen dreimal mit je 3 ml PBS und entweder dekantieren oder absaugen between spült. </li><li> Pipette 1 ml von 1 mg / ml Lucifer Yellow-Farbstoff in PBS (LY) in jede Zelle Platte gelöst. </li><li> Preload den Farbstoff in die Zellen durch vorsichtiges ein # 20 chirurgische Stahlklinge mit einer abgerundeten Kante durch eine Population von Zellen in drei verschiedenen Bereichen der Platte rollen. <ol><li> Beginnen Sie mit dem Skalpell senkrecht (90 ° Winkel) und 5 mm vom Rand der Kulturplatte platzieren und dann rollen das Skalpell aus dieser senkrechten Winkel um einen Winkel von 15 ° (siehe Abbildung 1). Hinweis: Dies wird erreicht, indem das Skalpell zwischen dem Zeigefinger und Daumen einklemmen. Verwenden Sie die Schwerkraft das Skalpell zu ermöglichen, sanft zu 15 ° Position aus den 90 ° zu gehen (wie die abgerundete Klinge einfach den Zellen rollt). Diese Bewegung wird eine optisch bemerkbar Einbuchtung Linie verlassen. </li></ol></li><li> Inkubieren der Zellen mit dem LY-Lösung für 3 min bei Raumtemperatur. </li><li> Dekantieren oder die LY absaugen und spülen dreimal mit 3 ml PBS alle extrace zu entfernenllular Farbstoff auf extrazelluläre Hintergrundfluoreszenz zu beseitigen. </li><li> 0,5 ml 10% phosphatgepufferter Formalinlösung die Zellen zu fixieren. Hinweis: Nach dem in Formalin Fixierung Luft die Zellen trocknen und lagern im Dunkeln bis zu zwei Jahren mit mindestens Photobleichens des LY-Farbstoff. Bei Bedarf Rehydrierung mit 10% Formalin-Lösung den Fluoreszenzfarbstoff Vorderseite sichtbar zu machen. </li><li> Sehen Sie sich die fixierten Zellen mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem dichroitischen Würfel ausgestattet für die Anregung / Emissionsspitzen von 428/536 nm bei 200-facher Vergrößerung. Richten Sie alle Platten, so dass die Einbuchtung Linie auf die horizontale Sichtfeld ist parallel. Hinweis: Ein FITC dichroitische Würfel gut funktioniert. <ol><li> Nehmen Sie das Bild mit einer CCD-Kamera und Unterstützung von Software. <ol><li> Öffnen Sie die unterstützende Software für die CCD-Kamera und verwenden Sie die Einstellungen für die automatische Belichtung. Verwenden Sie die "Capture" -Taste, um das Bild digital zu erwerben. Speichern Sie das Bild als TIF-Dateien, die "Save" Taste. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Anpassung des SL-DT Assay auf Lebergewebe <ol><li> Entfernen Sie etwa eine 2 x 2 cm Scheibe von der linken Lappen der Leber von einem 5 - Wochen alten, männlichen Fischer 344 Ratten mit Dissektion Schere und legen Sie es auf einer Plastik weigh Platte 12 mit nassen Gaze abgedeckt. </li><li> Pipette 0,5 ml einer PBS-Lösung, enthaltend 1 mg / ml jeweils von Lucifer Yellow und Rhodamin-Dextran (RD) auf die Oberfläche der Leber slice in der Kunststoffplatte wiegen. Hinweis: Die RD ist ein Farbstoff, der nicht Gap Junction Kanäle durchqueren können und werden die Zellen markieren, die geladen wurden. </li><li> Machen Sie drei vor fünf Einschnitte etwa 1 cm lange auf der Oberfläche der Leber in Scheiben schneiden, die die Farbstofflösung im Wiegeplatte mit einer scharfen Klinge hat und dann fügen Sie zusätzliche Farbstoff ausreicht, um die Einschnitte zu füllen. </li><li> Inkubieren des Gewebes für 3 min bei Raumtemperatur auf die Kunststoffplatte wiegen. </li><li> Spülen dreimal mit 5 ml PBS. </li><li> Befestigen Sie das Gewebe overnight in 30 ml 10% Phosphat-gepuffertem Formalin in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen in der Dunkelheit bei Raumtemperatur. </li><li> Am folgenden Tag, waschen Sie die Scheiben mit Wasser, schneiden Gewebe um den Einschnitt mit einer Schere in 1 x 1 x 0,5 cm 3 Streifen und dann mit Standardtechniken seziert die Scheiben in Paraffin 13 einzubetten. </li><li> Abschnitt die Scheiben senkrecht zur Schnittlinie zu einer Dicke von 5 um und lagern die Proben im Dunkeln , bis sie bereit Standard Schneidetechniken mit einem Mikrotom 13 mit abgebildet werden. </li><li> Verwenden Sie ein Epifluoreszenz - Mikroskop mit einer CCD - Digitalkamera ausgestattet , zu visualisieren und zu erfassen , die Bilder der Fluoreszenzfarbstoff Fronten gemäß Abschnitt 1.10 7. </li></ol> 3. Quantifizieren GJIC <ol><li> Messen Sie den Fluoreszenzfarbstoff Ausbreitung eines morphometrischen Software - Paket (zB ImageJ). <ol><li> Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei" und dann auf "Öffnen" die zu öffnengespeicherte Bild. </li><li> Klicken Sie auf das "Free Hand-Werkzeug" in der Werkzeugleiste Tab den Umriss der Farbstofffront zu verfolgen. </li><li> Klicken Sie auf "Analysieren" klicken und klicken Sie dann auf "Messen". Hinweis: Dies wird eine Fläche Wert in einer Tabellenkalkulation erzeugen, die in andere Tabellenkalkulationsprogramme kopiert werden können, falls gewünscht. </li></ol></li><li> Mit Hilfe eines Tabellenkalkulationsprogramm, berechnen den Anteil der Regelung (FOC) durch den Bereich des Farbstoffs Ausbreitung in der experimentellen Platte dividiert durch die Fläche der Farbstoff in der Steuerplatte gereist, um die folgende Gleichung: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54281/54281equation1.jpg"> A e = Fläche des Farbstoffes Ausbreitung in Zellen zu einem experimentellen variable ausgesetzt, beispielsweise mit einer Chemikalie an einer bestimmten Dosis oder Zeit behandelten Zellen A c = Fläche des Farbstoffes Ausbreitung in der Steuerung, die Zellen mit dem Träger behandelt werden verwendet , um die chemische interessierende aufzulösen Hinweis: Um die Wirkung des Fahrzeugs zu bestimmen,A e würde der Bereich der Farbstoff Ausbreitung in Zellen , die durch das Fahrzeug und A c wäre der Bereich der Farbstoff Ausbreitung in Zellen durch das Fahrzeug nicht behandelt behandelt sein. Die Wirkung des Fahrzeugs sollte vorzugsweise weniger als 10%. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der SL-DT-Test ist eine einfache und vielseitige Technik in GJIC messen, aber es gibt mehrere kritische Bedenken, die berücksichtigt werden sollten geeignete experimentelle Protokolle in der Gestaltung. Für robuste Messungen von GJIC die SL-DT-Test dort verwendet, muss eine gute Farbstoff Ausbreitung des LY durch gap junctions der Zellen sein. Zumindest sollte eine ausreichende Zeit, um sicherzustellen, gewählt werden, dass der Farbstoff breitet sich durch acht oder mehrere Reihen von Zellen aus den Skalpell beladenen Z...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache, umfassende und relativ kostengünstige Technik bereitzustellen, die potentiellen Toxizitäten von Verbindungen zu bewerten. Dies ist ein in vitro - Ansatz , die in mehreren Zelllinien verwendet werden kann. Standard-Zellbiologie Labors ausgestattet mit Epifluoreszenz Mikroskope können die Forschung mit diesen Test durchführen. Unsere Grundkenntnisse in der Zellfunktionen hat sich auf in - vitro - Biotests stark abhängig gewesen und hat eine wesentliche Komponente in die toxikologische Bewertung von Arzneimitteln, Umweltschadstoffe und Essen geboren Verunreinigungen werden. Leider gibt es keine einzige in - vitro - Bioassay - System , das die Anforderungen für alle toxikologische Bewertungen umfassend erfüllen können. Viele in vitro - Assays sind entwickelt und optimiert sowie zu bewerten als eine spezifische biochemische oder molekulare Endpunkt bewerten. Diese sind ziemlich oft kombiniert in einem hohen Durchsatz eingerichtet, um eine Störung eines reflektierenbestimmten Signaltransduktionsweg, wie Östrogen-Rezeptor - 1 signalisiert. Diese Strategie ist recht erfolgreich, aber die umfangreiche Anzahl von Signaltransduktionswegen in Genexpression beteiligt macht die Aufgabe, einen spezifischen Signalweg des Wählens recht komplex zu beurteilen. Hochdurchsatz-Protokolle werden derzeit entwickelt und verwendet, um gleichzeitig zahlreiche Signalwege messen, die ein Ansatz gewesen einige der Beschränkungen der einzelnen Tests zu überwinden. Allerdings sind nicht alle Signalwege wurden erfolgreich in umfassendere Ansätze integriert, sowie neue Signalwege ständig entdeckt werden, dass weitere verkompliziert diesen Bewertungsprozess. Mit umfangreichen Anzahl von in - vitro - Ansätzen, besonders hohe Durchsatzsysteme für umfassende toxikologische Bewertungen sind auch sehr teuer und sind nicht förderlich für die meisten Einzel Ermittler führte Forschungsprojekte. GJIC ist ein Prozess, WIG-htly gesteuert durch Veränderungen in der Spannung, Calciumkonzentration, pH - Wert, Redox - Gleichgewicht, 2,3 von bedeutenden intrazelluläre Signalübertragungswege und Interaktionen mit Membran und Zytoskelett Proteine reguliert. Somit Hemmung der GJIC können verschiedene Arten von zellulärem Stress, Störung von verschiedenen zellulären Funktionen reflektieren oder Störungen verschiedener Signaltransduktionswege. Ein weiterer Ansatz , um die Nutzung der begrenzten Signaltransduktion Biotests zu überwinden , ist die Vorteile der biologischen Phänomene zu nehmen , dass viele, wenn nicht die meisten, Signaltransduktionswege werden durch kooperative Systeme interzelluläre Signalübertragung moduliert durch gap junction Kanäle 4-8. Obwohl interzellulären Signalsystemen auch zahlreich sind und unter mehreren Stoffwechselweg Steuerung, ist die interzelluläre Signalübertragung durch Gap Junction Kanäle letztlich eine Funktion der Kanäle geöffnet wird, teilweise geschlossene oder ganz geschlossen. Dies stellt einen Endpunkt, der leicht gemessen werden kann unter Verwendung verschiedenerIn - vitro - Bioassay - Systeme 7. Bedenkt man, dass die Homöostase Sollwert eines Gewebes offene Kanäle erfordert, um die Wirkung der Verbindungen auf die interzelluläre Kommunikation über Gap junctions Bestimmung (GJIC) ist ein umfassender Ansatz in 4,8 potentiellen toxischen Wirkungen von Verbindungen zu bestimmen. Im Wesentlichen diese kritische biologische Phänomen, das eine zentrale Rolle spielt mehrere Signaltransduktionsereignissen bei der Koordinierung der Expression Steuerung Gen ermöglicht eine umfassende Bewertung der toxischen Wirkungen. So Biotests, die GJIC sind ein ausgezeichneter Ausgangspunkt beurteilen das toxische Potenzial von Verbindungen zu bewerten. Die umfangreichsten verwendeten Techniken GJIC zur Beurteilung basieren auf Zellen mit einer fluoreszierenden Sonde und dann die Überwachung der Migration des Farbstoffs aus der beladenen Zelle oder Zellen zu benachbarten Zellen Vorbelastung. Techniken , um den Farbstoff vorzubelasten haben beteiligten Mikroinjektions 9, Scrape Loading 10, und Methylester der Sonden 11 </sup&gt;. Das Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoffübertragung (SL-DT) Verfahren ist eine Modifikation der schaben Last - FARBSTOFF Assay Transfer entwickelt von El Fouly 10. Anstatt die mehr invasive schaben, das Skalpell Ladeverfahren dieses Berichts beinhaltet eine sanfte Rolle eines Skalpells mit einer runden Klinge durch eine Monoschicht von Zellen , die invasive Schaden (Abbildung 1) zu minimieren. Die Vorteile dieser Technik sind die toxikologische Beurteilung einer Population von Zellen, anstatt einzelne Zellen des Mikroinjektionsassay. Darüber hinaus ermöglicht die Einfachheit dieses Tests für die schnelle Detektion von mehreren Platten in kurzer Zeit während Methoden Mikroinjektionstechniken und Techniken, die Methylester von Fluoreszenzsonden verwenden wesentlich zeitaufwendig und erfordern eine wesentlich höhere Fähigkeitsniveau. Zwar gibt es keine einzige Methode, die Bedürfnisse aller GJIC des Studiums zu erfüllen; SL-DT-Test ist eine einfache, relativ kostengünstig und vielseitig Test, der kannviele der Anforderungen für die erste Bewertung der Toxizitäten verschiedener Verbindungen erfüllen. Hauptvorteile sind: Einfachheit, keine besondere Notwendigkeit für die Ausrüstung oder Fähigkeiten, die für andere Verfahren, wie Mikroinjektion, fluoreszierende Erholung nach Photobleaching (FRAP) -Assay und lokale Aktivierung von molekularem fluoreszierenden Sonden-Assays, eine schnelle und gleichzeitiger Beurteilung von GJIC in einem großen erforderlichen Anzahl der Zellen, förderlich für eine hohe Durchsatzaufbau mit automatisierten Fluoreszenzmikroskopie - Bildgebung und Analyse sowie seine Anpassungsfähigkeit für in vivo - Studien.

<table><tbody><tr><td>WB-F344 Rattenleber-Epithelzellen</td><td>von Drs. J. W. Grisham und M. S. Tsao von der University of North Carolina (Chapel Hill, NC)</td><td>keine</td><td>zur Verfügung gestellt von Dr. J. W. Grisham und M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC</td></tr><tr><td>35 mm Kulturplatten</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Kulturflaschen</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Kulturflaschen</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>D-medium, ein von Eagles modifiziertes Medium&nbsp;</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>Formel Nr. 78-5470EF</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>15050</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>hausgemacht</td><td>, siehe unten für die Zutat Cat#'s</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO><4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Bäcker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3819--01</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>Luzifer Gelb CH, Lithiumsalz</td><td>Sigma-Aldrich Chemikalie</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich Chemikalie</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>1-Methylanthracen</td><td>Sigma-Aldrich Chemikalie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenanthren</td><td>Sigma-Aldrich Chemikalie</td><td>P11409</td><td></td></tr><tr><td>Resveratrol</td><td>Sigma-Aldrich Chemikalie</td><td>R5010</td><td></td></tr><tr><td>D609</td><td>Tocris Bioscience&nbsp;</td><td>1437</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td></td></tr><tr><td>37%ige Lösung Formaldehyd</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>#20 chirurgische Klinge</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10317-14</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische sterile Röhrchen</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>339652</tr><tr><td>Nikon Epifluoreszenzmikroskop&nbsp;</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>Nikon FITC dichroitischer Würfel</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>96107</td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Nikon Cool Snap EZ CCD-Bildgebungssystem</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Nikon NIS-Elements F2.2 Bildgebungssystem.</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Nationales Institut für Gesundheit</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

interzelluläre gap junction-kommunikation: eine funktionelle biomarker zur beurteilung unerwünschte auswirkungen von schadstoffen und toxinen und gesundheitlichen vorteile von natural products

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Dieses Protokoll beschreibt ein Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoffübertragung (SL-DT) Technik, die interzelluläre Kommunikation über Gap Junction Kanälen misst, das ein wichtiger interzellulären Prozess, durch den Gewebshomöostase gehalten wird. Unterbrechung der interzellulären Gap Junction - Kommunikation (GJIC) durch Noxen, Toxine, Drogen usw. zu zahlreichen negativen Auswirkungen auf die Gesundheit in Verbindung gebracht worden. Viele genetisch-bedingte Krankheiten wurden Mutationen in Gap Junction-Genen verbunden. Die SL-DT-Technik ist eine einfache Funktionstest für die simultane Beurteilung der GJIC in einer großen Population von Zellen. Der Assay beinhaltet Vorbelastung Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff kurz mit einer Skalpellklinge durch eine Population von Zellen, die Zellmembran gestört. Der Fluoreszenzfarbstoff wird dann für eine bestimmte Zeit zu benachbarten Zellen zu durchqueren, durch gap junction Kanäle erlaubt. Der Assay wird dann durch Zugabe von Formalin zu den Zellen beendet. Die Ausbreitung der Fluorescent Farbstoff durch eine Population von Zellen mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop beurteilt und die Bilder werden mit einer beliebigen Anzahl von morphologisch Softwarepakete analysiert, die verfügbar sind, einschließlich Pakete freie Software auf dem öffentlichen Bereich gefunden. Dieser Test wurde auch für in vivo - Studien unter Verwendung von Gewebeschnitten aus verschiedenen Organen von behandelten Tieren angepasst. Insgesamt kann der SL-DT - Test eine breite Palette von in - vitro - pharmakologischen und toxikologischen Bedürfnisse dienen, und kann möglicherweise für einen hohen Durchsatz Set-up - Systeme mit automatisierten Fluoreszenzmikroskopie Bildgebung und Analyse angepasst werden , um mehr Proben in kürzerer Zeit aufzuklären.

Unterbrechung der GJIC wurde als Biomarker zur Identifizierung von toxischen Verbindungen in der nicht genotoxisch, epigenetischer Ebene der Gen - Steuerung , die induziert schädliche Auswirkungen auf die Gesundheit 14 ausgiebig genutzt. Zum Beispiel sind polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAHs) ubiquitär Verunreinigungen der Umwelt , sondern unterscheiden sich in ihrer epigenetischen Toxizitäten als Funktion ihrer molekularen Strukturen 15. Die mit niedr...

Dieses Protokoll beschreibt ein Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoff-Transfertechnik, die interzelluläre Kommunikation über Gap Junction Kanäle misst. Gap junctions interzelluläre Kommunikation ist ein wichtiger zellulärer Prozess, durch den Gewebe-Homöostase aufrechterhalten wird und die Unterbrechung dieser Zellsignalisierung hat negative Auswirkungen auf die Gesundheit.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Das übergeordnete Ziel ist es, einen einfachen Assay zur Messung der interzellulären Kommunikation durch eine Population von Säugetierzellen bereitzustellen, der ein breites Spektrum an pharmakologischen und toxikologischen In-vitro-Anforderungen erfüllen kann. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Toxikologie zu beantworten, z. B. ob eine Verbindung die Entwicklung oder den Erhalt eines Gewebes beeinflusst, indem sie die interzelluläre Kommunikation zwischen den Gap Junctions dereguliert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache und schnelle Beurteilung der Gap-Junction-Funktion in einer großen Zellpopulation als Reaktion auf Giftstoffe und Toxine ermöglicht.Das Verfahren wird von Ajna Uzuni, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, vorgeführt. Zu Beginn des Experiments säen Sie dreimal 10 bis fünfte WB-F344-Rattenleber-Epithelzellen auf Kulturplatten mit einem Durchmesser von 35 Millimetern aus, die das modifizierte Medium von Eagle plus 5 % fötales Rinderserum enthalten. Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator, bis sie eine Konfluenz von 100 % erreichen, und fahren Sie mit der experimentellen Behandlung der Zellen fort.Um mit Dosis-Wirkungs-Experimenten fortzufahren, fügen Sie 10 Mikroliter und 20 Mikroliter einer zuvor hergestellten, zwei millimolaren Stammlösung von Phenanthren in 100 % Acetonitril und vier Mikroliter, sechs Mikroliter und acht Mikroliter einer 20 millimolaren Stammlösung von Phenanthren in 100 % Acetonitril zu drei Zellplatten hinzu, die zwei Milliliter Wachstumsmedium für jedes hinzugefügte Volumen der Stammlösung enthalten. Als nächstes fügen Sie vier Mikroliter, sechs Mikroliter, acht Mikroliter, 10 Mikroliter und 20 Mikroliter einer 100%igen Lösung von Acetonitril zu drei Zellplatten hinzu, die zwei Milliliter Wachstumsmedium für jedes hinzugefügte Volumen an Acetonitrillösung enthalten, um als Vehikelkontrolle zu dienen. Nach der Zugabe des Acetonitrils die Platten inkubieren.Um Zeitreaktionsexperimente durchzuführen, geben Sie sieben Mikroliter einer 20 millimolaren Stammlösung von Phenanthren in 100 % Acetonitril zu drei Zellplatten, die für jeden Zeitpunkt zwei Milliliter Wachstumsmedium enthalten. Geben Sie dann sieben Mikroliter 100%iges Acetonitril in drei Zellplatten, die für jeden Zeitpunkt zwei Milliliter Wachstumsmedium enthalten, um als Fahrzeugsteuerung zu dienen. Inkubieren Sie die Platten für jeden angegebenen Zeitpunkt.Entsorgen Sie das Nährmedium, indem Sie es vorsichtig abgießen. Spülen Sie die Zellen mit drei Millilitern PBS und dekantieren oder aspirieren Sie sie zwischen den Spülgängen. Pipettieren Sie einen Milliliter eines Milligramms pro Milliliter Luzifergelbfarbstoff, der in PBS gelöst ist, in jede Zellplatte.Laden Sie den Farbstoff in die Zellen vor, indem Sie das Skalpell zwischen Zeigefinger und Daumen einklemmen. Platzieren Sie das Skalpell senkrecht zum Rand der Kulturplatte und fünf Millimeter vom Rand der Kulturplatte entfernt und lassen Sie das Skalpell dann mit Hilfe der Schwerkraft sanft von diesem senkrechten Winkel zu einem Winkel von 15 Grad rollen. Rollen Sie die Klinge durch eine Population von Zellen in drei verschiedenen Bereichen der gesamten Platte.Inkubieren Sie die Zellen anschließend drei Minuten lang bei Raumtemperatur mit der LY-Lösung. Dekantieren oder aspirieren Sie das LY und spülen Sie die Zellen, um alle extrazellulären Farbstoffe zu entfernen und die extrazelluläre Hintergrundfluoreszenz zu eliminieren. Fügen Sie dann 0,5 Milliliter einer 4%igen phosphatgepufferten Formalinlösung hinzu, um die Zellen zu fixieren.Betrachten Sie die fixierten Zellen mit einem Epifluoreszenzmikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Richten Sie alle Platten so aus, dass die Einkerbungslinie parallel zum horizontalen Sichtfeld verläuft. Es wurde eine Reihe von SL-DT-Bildern von WB-F344 Rattenleber-Epithelzellen erstellt, die mit steigenden Dosen von Phenanthren behandelt wurden.Die Abnahme der Migration von luzifergelben Fluoreszenzfarbstoffen wird durch steigende Dosen von Phenanthren verursacht, was die zunehmende durch Toxine induzierte Hemmung der interzellulären Kommunikation (Gap Junctional Intercellular Communication, GJIC) zeigt. Der Anteil der Kontroll- oder FOC-Werte, die aus den SL-DT-Bildern erhalten wurden, wurde gemittelt, statistisch analysiert und dann grafisch dargestellt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Western Blots von einzelnen Transduktionsproteinen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.Aktivieren diese Verbindungen mitogene Ereignisse der Zellperforation?

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Haftung Frequenz-Assay zur Messung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung Kinetik, wenn beide Moleküle auf der Oberfläche der interagierenden Zellen verankert sind beschrieben. Diese mechanisch-basierter Assay wird beispielhaft mit einer Mikropipette unter Druck menschlichen roten Blutkörperchen als Haftvermittler Sensor und Integrin αLβ2 und ICAM-1 als interagierende Rezeptoren und Liganden.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

Wir beschreiben hier, wie Sie eine Einzelzellmikroinjektion von Lucifer Yellow auszuführen einige nützliche Tipps zur Visualisierung zellulärer Kommunikation über Gap-Junctions in lebenden Zellen und liefern. Wir gehen davon aus, dass dieses Papier allen helfen wird, den Grad der zellulären Kopplung aufgrund funktioneller gap junctions zu bewerten. Alles, was hier beschrieben könnte im Prinzip angepasst anderen Fluoreszenzfarbstoffen mit einem Molekulargewicht unter 1000 Dalton.

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Diese Präsentation demonstriert eine Methode, bei der die Elektroporation von adhärenten, kultivierten Zellen zur Untersuchung der interzellulären, junktionalen Kommunikation verwendet wird, während die Zellen auf einem Objektträger wachsen, der mit leitfähigem und transparentem Indium-Zinnoxid beschichtet ist.

Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

Verbesserte in vitro Neurotoxizitätstests würden die Identifizierung neuer neuroprotektiver Verbindungen unterstützen. Der Nutzen eines impedanzbasierten Echtzeit-Zellanalysators zur Bestimmung der Zytotoxizität und Zytoprotektion in neuronalen Zelllinien und zur Abgrenzung der Beteiligung von Second-Messenger-Signalwegen und damit zur Gewinnung eines Einblicks in den Mechanismus der Neuroprotektion wird vorgestellt.

Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse als Werkzeug, um molekulare Signalwege in Neurotoxizität und Neuroprotektion in einem neuronalen Zelllinie; Delineate

Die Protokolle beschreiben zwei In-vitro-Testsysteme Entwicklungstoxizität (UKK und UKN1) auf der Grundlage humaner embryonaler Stammzellen und Transkriptom-Studien. Die Testsysteme voraussagen menschlichen Entwicklungstoxizität Gefahren und kann dazu beitragen, Tierversuche, die Kosten und die Zeit für die Stoffsicherheitstests zu reduzieren.

Menschliche pluripotente Stammzelle Basierend Entwicklungstoxizität Assays für chemische Sicherheit Screening und Systembiologie Datengenerierung

Die Untersuchung der frühen Migration von Endothelzellen (EEC) ist wichtig, um die Pathophysiologie bestimmter Krankheiten zu verstehen und möglicherweise neue Strategien für therapeutische Interventionen zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt Techniken zur Beurteilung der Zellmigration, die für die Untersuchung von EEC angepasst wurden.

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für eine neuartige Lücke Kreuzung interzelluläre Kommunikation Assay für den Hochdurchsatz-Screening von Lücke Kreuzung modulierende Chemikalien für die Arzneimittelforschung und toxikologische Bewertung entwickelt.

Ein Jodid-gelb fluoreszierende Protein-Gap Junction-interzelluläre Kommunikation Assay

Hier stellen wir ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Spaltknoten-Anschluss 43 zu stören und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die endotheliale Biomechanik durch Beobachtung von Traktionen und interzellulären Spannungen zu messen.

Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung

Dieses Protokoll stellt eine automatisierte, bildbasierte Hochdurchsatztechnik vor, um Verbindungen zu identifizieren, die die natürliche Killerzell-vermittelte Abtötung von Brustkrebszellen in Gegenwart eines therapeutischen Anti-HER2-Antikörpers modulieren.

High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen

Ein Dissektionstechnik zur Entfernung des Gyrus dentatus aus adulten Maus unter einem Stereomikroskop wurde in diesem Video aufgezeichnet Protokoll demonstriert.

Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

Lernen Sie die Scalpel-Loading-Technik zur Messung der Gap-Junction-Kommunikation in WB-F344-Rattenleberzellen. Diese einfache Methode ermöglicht schnelle toxikologische Bewertungen von Schadstoffen.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products (Video) | JoVE Journal

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

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