Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits
20. September 2016
Ein Hochdurchsatz-Assay für das Enzym-Screening wird beschrieben. Dieses gebrauchsfertige Multiplex-Assay-Kit besteht aus vorausgewählten C-hromogenen P-Olymer-H-Ydrogel-Substraten (CPH) und komplexenI-nlöslichen C-hromogenen B-iomasse(ICB)-Substraten. Zielenzyme sind Polysaccharid-abbauende Endoenzyme und Proteasen.
Das übergeordnete Ziel dieses chromogenen Assays ist es, verschiedene Enzyme in einem Hochdurchsatzformat gegen eine Auswahl verschiedener chromogener Substrate zu screenen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Enzymforschung zu beantworten, wie z. B. die Suche nach neuen Enzymaktivitäten für den Abbau von Biomasse. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die chromogenen Substrate in vier verschiedenen Farben erhältlich sind, was diese Technik mit hohem Durchsatz, extrem zuverlässig und kostengünstig macht.
Aktivieren Sie zunächst die Platte des 96-Well-Filter-Assay-Kits, indem Sie 200 Mikroliter Aktivierungslösung in jedes Well geben. Bei Raumtemperatur ohne Rühren 10 Minuten inkubieren. Verwenden Sie für die Entnahme eine Zentrifuge und eine beliebige Standard-96-Well-Platte.
Um die vorhandene Aktivierungslösung zu schleudern, fügen Sie 100 Mikroliter steriles Wasser zu den chromogenen Polymer-, Hydrogel- oder CPH-Substraten hinzu und wenden Sie ein Vakuum oder Schleudern an, um den Stabilisator zu entfernen. Wiederholen Sie den Waschgang noch zwei Mal. Zur Vorbereitung der Enzymreaktion geben Sie 150 Mikroliter 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,5 und 5 Mikroliter Endo-Cellulase-Lösung mit drei verschiedenen Konzentrationen in jede Vertiefung der Assay-Kit-Platte.
Platzieren Sie die Produktplatte unter der Platte des Assay-Kits, um mögliche Leckagen aus der Reaktionsplatte während des Schüttelns aufzufangen. Inkubieren Sie dann die Platte des Assay-Kits bei Raumtemperatur in einem horizontalen Schüttler bei 100 U/min für 30 Minuten. Um zuverlässige Daten zu erhalten, ist es notwendig, das Reaktionsgemisch während der Inkubation zu rühren.
Legen Sie die Platte des Assay-Kits mit der Produktplatte darunter in die Zentrifuge und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 2.700 x g. Zum Übertragen des Reaktionsprodukts in die Vertiefungen der Produktplatte. Überprüfen Sie nach dem Schleudern die Produktplatte, um zu überprüfen, ob das Flüssigkeitsvolumen in jeder Vertiefung ungefähr gleich ist.
Lesen Sie mit einem Plattenleser die Absorption der Sammelplatte bei 630 nm für die verschiedenen grünen CPH-Substrate ab. Analysieren und plotten Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. Um den chromogenen Assay mit roter, unlöslicher chromogener Biomasse oder ICB-Weizenstroh durchzuführen, geben Sie zunächst 200 Mikroliter Aktivierungslösung in jede Vertiefung der Assay-Platte.
Inkubieren Sie die Platte dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Rühren. Entfernen Sie den Stabilisator, indem Sie die Vertiefungen dreimal mit 100 Mikrolitern sterilem Wasser waschen. Fügen Sie dann 150 Mikroliter 100 mM Natriumacetatpuffer pH 4,5 und 5 Mikroliter mit 10 Einheiten pro Milliliter verschiedener Endo-Xylanase-Lösung hinzu.
Positionieren Sie die Produktplatte unter der Substratplatte, um mögliche Leckagen von der Substratplatte während des Schüttelns aufzufangen. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur bei 100 U/min zwei Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation legen Sie die Platte des Assay-Kits mit der darunter liegenden Produktplatte in die Zentrifuge und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 2.700 x g, um das Reaktionsprodukt in die Vertiefungen der Produktplatte zu übertragen.
Vergewissern Sie sich, dass das Flüssigkeitsvolumen in jeder Vertiefung ungefähr gleich ist. Anschließend wurde mit einem Plattenlesegerät die Absorption der Auffangplatte bei 517 nm für rotes ICB-Weizenstroh abgelesen. Führen Sie eine Datenanalyse gemäß dem Textprotokoll durch.
Hier ist ein Beispiel für eine Dosisreaktion von CPH-Arabinoxylan auf Xylanase bei verschiedenen Konzentrationen des Enzyms gezeigt, wobei die abnehmende Enzymkonzentration visuell beobachtet werden kann. Eine detailliertere spektrophotometrische Quantifizierung wird verwendet, um die Absorption gegen die Enzymkonzentration aufzuzeichnen. Mit dem Signal entspricht die Intensität der Enzymaktivität.
In diesem Beispiel des Assays, der für das Enzymscreening verwendet wird, wurde eine Endocellulase in drei Konzentrationen gegen verschiedene CPH-Substrate getestet. Wie hier zu sehen ist, wurde für CPH-Glucan, CPH-Xylan, CPH-Xyloglucan eine zusätzliche Aktivität und eine geringe Aktivität gegen CPH-Galactomannan beobachtet. Die gleichen CPH-Substrate wurden mit kommerziell erhältlichen Enzymen verdaut, die als Positivkontrollen unter den gleichen Bedingungen verwendet wurden.
Die Ergebnisse hier zeigen, dass alle Substrate in einem Umfang abgebaut wurden, der mit zunehmender Enzymkonzentration zunahm. In diesem Experiment wurden fünf ICB-Substrate mit 19 CPH-Substraten eingeschlossen, um die sezernierten Enzyme von Phanerochaete chrysosporium unter drei verschiedenen pH-Bedingungen zu analysieren. P.chrysosporium-Enzyme bauten verschiedene Glucane, Stärken und Xylane ab.
Niedrigere Signale konnten sowohl für die Hemicellulosen Arabinan und Pektisches Galactan als auch für RGI nachgewiesen werden. Die produzierten Enzyme waren unter sauren Bedingungen aktiver als unter neutralen oder leicht basischen Bedingungen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Reaktion während der Inkubation zu mischen. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet des Hochdurchsatz-Screenings den Weg, um neuartige Enzymaktivitäten für die Biotechnologie zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Screening-Kit verwenden.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt einen Hochdurchsatz-Chromogen-Assay zur Enzymscreening mit multiplexierten Substraten. Der Assay-Satz umfasst chromogene Polymerhydrogel- (CPH-) und unlösliche chromogene Biomasse- (ICB-)Substrate zur Untersuchung von Polysaccharid abbauenden Endoenzymen und Proteasen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Enzymscreening
- Biotechnologie
- Hochdurchsatzanalysen
Hintergrund
- Die Enzymentdeckung ist entscheidend für verschiedene Anwendungen, einschließlich des Abbaus von Biomasse.
- Chromogene Substrate ermöglichen die visuelle Verfolgung der Enzymaktivität.
- Der Test ist so konzipiert, dass er zuverlässig und kostengünstig ist.
- Verschiedene Substrate liefern eine Farbpalette zur verbesserten Analyse.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Untersuchung von Enzymen gegenüber verschiedenen Substraten.
- Identifizierung neuer enzymatischer Aktivitäten für den Abbau von Biomasse.
- Ermöglichung des Hochdurchsatz-Screenings in der Enzymforschung.
Verwendete Methoden
- Aktivierung einer 96-Well-Filter-Assay-Kit-Platte mit einer Aktivierungslösung.
- Inkubation von Enzymreaktionen unter kontrollierten Bedingungen.
- Verwendung einer Zentrifuge zur Sammlung des Produkts.
- Messung der Absorption bei spezifischen Wellenlängen zur Datenanalyse.
Hauptergebnisse
- Für verschiedene CPH- und ICB-Substrate wurden Enzymaktivitäten beobachtet.
- Höhere Enzymkonzentrationen führten zu einer stärkeren Substratabbauung.
- Unterschiedliche Substrate wiesen unterschiedliche Enzymaktivitätsniveaus auf.
- Saure Bedingungen verstärkten die Enzymaktivität im Vergleich zu neutralen oder basischen Bedingungen.
Schlussfolgerungen
- Dieser Assay bietet eine robuste Plattform für das Enzymscreening.
- Er ermöglicht es Forschern, neuartige Enzymaktivitäten effizient zu untersuchen.
- Die Beherrschung der Technik erlaubt eine schnelle Durchführung in weniger als einer Stunde.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Hochdurchsatz-Screening-Methoden für Enzyme stoßen bei der Substratverfügbarkeit und der Skalierbarkeit von Assays an Grenzen, was die schnelle funktionelle Charakterisierung von Kohlenhydrat-aktiven Enzymen (CAZymes) einschränkt, die für Anwendungen in der Bioenergie-, Textil- und Lebensmittelindustrie von entscheidender Bedeutung sind. Dieser chromogene Assay schließt diese technologische Lücke, indem er multiplexe, farbkodierte Substratuntersuchungen im 96-Well-Format ermöglicht, wodurch die Vorhersagesicherheit im frühen Enzym-Discovery-Prozess verbessert und Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in Enzym-Engineering-Pipelines unterstützt werden. Die Methode verbessert die translationale Kontinuität von der Zielidentifizierung bis zur präklinischen Validierung, indem sie quantitative und reproduzierbare Aktivitätsmessungen über verschiedene Polysaccharid-Substrate hinweg bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Untersuchung putativer CAZyme, indem genetische Kandidaten mit biochemischer Aktivität auf definierten Polysaccharid-Substraten verknüpft werden.
- Operationaler Wert: Unterstützt die schnelle Hypothesenprüfung durch farbmultiplexierte CPH-Substrate und erhöht die Durchsatzkapazität der Screening-Verfahren, ohne die Datenzuverlässigkeit zu beeinträchtigen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die mechanistische Risikominimierung durch Quantifizierung der dosisabhängigen Enzymaktivität und unterstützt so die Priorisierung von Zielstrukturen für die Entwicklung industrieller Enzyme.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet standardisierte, unlösliche chromogene Substrate (CPH und ICB), die komplexen Biomassestoffen nachempfunden sind und physiologisch relevante Aktivitätsbestimmungen ermöglichen.
- Operativer Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit des Assays durch standardisierte Aktivierungs-, Wasch- und Zentrifugationsschritte und verringert so die Variabilität in Hochdurchsatz-Arbeitsabläufen.
- Skalierbarkeitswert: Kompatibel mit gängigen 96-Well-Plattenlesegeräten und Flüssigkeitsmanagementsystemen, wodurch eine Integration in bestehende Screening-Plattformen zur Evaluierung von Enzymcocktails oder Kulturen ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme durch die Untersuchung der Enzymaktivität unter variierenden pH-Bedingungen, die industrielle Prozessumgebungen widerspiegeln.
- Operationaler Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem die Enzymkonzentration mit dem Substratabbau über mehrere Biomassetypen hinweg korreliert wird (z. B. Weizenstroh, Glucane, Xylane).
- Prädiktiver Wert: Verbessert die translationalen Biomarkerübereinstimmungen, indem pH-abhängige Aktivitätsmuster identifiziert werden, die für die Formulierungsstabilität in Anwendungen wie Waschmitteln oder Biokraftstoffen entscheidend sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test eignet sich für den Bereich von der frühen Entdeckung bis zur Identifizierung von Leitverbindungen und unterstützt die Hypothesenprüfung, die Aufklärung von Wirkwegen sowie die biologische Risikominderung für kohlenhydratabbauende Enzyme, bevor in die Proteinengineering- oder Fermentationsskalierung investiert wird.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Aufklärung von Wirkwegen durch die Untersuchung der Enzymaktivität gegenüber spezifischen Polysaccharid-Substraten (z. B. CPH-Glucan, CPH-Xylan), um Substratspezifität und funktionelle Rolle abzuleiten.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays und quantitative Ergebnisse durch Absorptionsmessungen bei 630 nm (CPH) und 517 nm (ICB), wodurch ein zuverlässiger Vergleich von Enzymvarianten oder Bedingungen ermöglicht wird.
- Analytik: Liefert Dosis-Wirkungs-Daten, die statistische Analysen und die Auswahl aussagekräftiger Kandidaten unterstützen und Teams dabei helfen, Enzymkandidaten nach Aktivität und Spezifität zu bewerten.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität, indem die Enzymleistung unter industriell relevanten Bedingungen (z. B. saurem pH-Wert, komplexen Biomasse-Substraten) bewertet wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform zum Screening von Enzymsammlungen, Kulturen oder Enzymgemischen über mehrere Projekte in bio-basierten Industrien hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem falsch-positive Ergebnisse durch direkte Aktivitätsmessung an unlöslichen, native ähnlichen Substraten reduziert werden.
- Operationaler Wert: Bietet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Reagenzvolumina, Inkubationszeiten und Zentrifugationsparameter und minimiert so die vom Anwender abhängige Variabilität.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem die schnelle Bildschirmanalyse von Hunderten von Enzymkandidaten ermöglicht wird, wodurch Zeit und Kosten im Zusammenhang mit biochemischen Assays mit geringer Durchsatzleistung reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem quantitative Aktivitätsdaten generiert werden, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in Enzym-Engineering-Kampagnen informieren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Enzymkinetik und der Optimierung chromogener Assays, um eine genaue Substratpräparation und Reaktionsüberwachung sicherzustellen.
- Setzt den Zugang zu einem Plattenreader voraus, der Absorptionsmessungen bei 630 nm und 517 nm ermöglicht, sowie eine Zentrifuge, die mit 96-Well-Platten kompatibel ist, um den Produkttransfer durchzuführen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Pufferbedingungen (z. B. Natriumacetat, pH 4,5) und Inkubationsparameter (z. B. Schütteln mit 100 rpm), um die Reproduzierbarkeit an verschiedenen Standorten zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Verwendung nicht-polysaccharidischer Substrate, da der Assay für kohlenhydratverarbeitende Enzyme optimiert ist und für andere Enzymklassen möglicherweise Modifikationen des Puffers oder des Substrats erfordert.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie das Vermeiden von Agitation während der Aktivierungs- und Stabilisierungsschritte sowie die visuelle Kontrolle gleicher Produktvolumina nach der Zentrifugation, um eine zuverlässige Dateninterpretation zu gewährleisten.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Chromogenic Assay with CPH Substrates, Detection, and Quantification
2:41
Chromogenic Assay with Insoluble Chromogenic Biomass Substrates, Detection, and Quantification
4:15
Results: Enzymatic Degradation of Chromogenic Polymer Hydrogel Substrates
6:02
Conclusion
