Patch-Clamp-Aufnahmen auf Intact Dorsalwurzelganglien von erwachsenen Ratten

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Methoden zur Präparation der intakten Spinalganglien einzuführen und mit dieser Präparation eine Patch-Clamp-Aufzeichnung durchzuführen. Diese Methode ermöglicht die Einzelzellaufzeichnung aus den intakten Spinalganglien bei gleichzeitiger Stimulation des eintretenden Spinalnervs oder der austretenden Spinalwurzel. Dieser Ansatz ist besonders nützlich, wenn es darum geht, den Beitrag der primären sensorischen Neuronen zum Schmerz zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sowohl Neuronen als auch benachbarte Satelliten-Gliazellen erhalten bleiben. Daher ist dieses Präparat näher an der In-vivo-Situation. Bei diesem Verfahren wird nach der Betäubung der Ratte die Lendenwirbelsäule rasiert.

Schneiden Sie dann die Haut und das Unterhautgewebe entlang der Mittellinie ein. Lösen Sie anschließend die perispinalen Muskeln mit Hilfe eines feinen Periostlifts von den Dornfortsätzen auf Höhe L1 bis S2. Schneiden Sie als nächstes die Dornfortsätze von L1 nach S2 ab. Anschließend werden zwei Querschnitte in die freiliegende Wirbelsäule bei etwa L1 und S1 gemacht und dieses Segment der Wirbelsäule en bloc entfernt.

Tauchen Sie es dann schnell für zwei bis drei Minuten in kaltes Bakterium. Danach spülen Sie das Blut aus der entnommenen Wirbelsäule ab und übertragen die Wirbelsäule in eine Petrischale mit kaltem Liquor, dann verwenden Sie einen feinen Rongeur, um die Laminae zu entfernen. Schneiden Sie die Dura mater entlang der Mittellinie mit einer Mikroschere, um das Rückenmark freizulegen.

Übertragen Sie anschließend den restlichen Wirbel mit DRG in die zweite Petrischale, die mit kaltem Liquor gefüllt ist. Identifizieren Sie die L4- und L5-DRGs anhand ihrer relativen Position zu den Querfortsätzen und dem Ischiasnerv. Befreien Sie dann das DRG vom umgebenden Bindegewebe und halten Sie die Nervenwurzel und den Spinalnerv am DRG befestigt.

Übertragen Sie danach das DRG zur weiteren Dissektion in die dritte Petrischale. Schneiden Sie eine Öffnung an der Stelle, an der die dorsalen und ventralen Wurzeln in das DRG münden, und trennen Sie die ventrale Wurzel davon. Verwenden Sie dann eine Pinzette mit stumpfen Spitzen, um das Epineurium zu halten, und verwenden Sie eine weitere feine Pinzette, um das DRG aus dem Epineurium zu rollen.

Fahren Sie fort, so viel Epineurium wie möglich zu entfernen, das an das DRG gebunden ist. Übertragen Sie nun das DRG in die Aufnahmekammer. Stellen Sie sicher, dass die Seite des DRG, von der die Nervenwurzeln stammen, nach unten zeigt.

Als nächstes stabilisieren Sie das DRG mit einem Anker. Dann perfundieren Sie das DRG mit sauerstoffhaltigem aCSF durch die Kunststoffschläuche, die mit einer Peristaltikpumpe verbunden sind, und lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang sich erholen. Nach 30 Minuten beurteilen Sie die DRG-Qualität unter IR-DIC-Optik bei 40-facher Vergrößerung durch eine CCD-Kamera.

Einzeln werden zwei Ein-Milliliter-Spritzen durch zwei Stücke Gummischläuche mit kleinem Durchmesser mit den Pipettenhaltern verbunden. Legen Sie dann eine mit Kollagenase gefüllte Glaspipette in einen der Pipettenhalter und eine leere Glaspipette in den anderen. Positionieren Sie anschließend die Pipetten mit dem Mikromanipulator knapp über dem DRG.

Lassen Sie die Spitzen von zwei Pipetten vorsichtig gegeneinander prallen, um die Öffnungen der Pipettenspitzen zu vergrößern. Bewegen Sie danach die mit Kollagenase gefüllte Pipette nahe an die DRG-Oberfläche. Üben Sie durch das Röhrchen, das den Halter und die Spritze verbindet, kurzzeitig Überdruck auf die kollagenasehaltige Pipette aus, indem Sie den Kolben um etwa 0,5 Milliliter verschieben.

Nach 10 bis 15 Minuten, wenn die Ablagerungen des verbleibenden Epineuriums beobachtet werden, üben Sie einen sanften Unterdruck auf die leere Pipette aus, um die Ablagerungen abzusaugen. Auf diese Weise werden die Neuronen und die umgebenden Satelliten-Gliazellen eindeutig freigelegt und sind bereit für die Patch-Aufzeichnung. Legen Sie bei diesem Verfahren die Elektrodenlösung auf Eis, um eine Degradation zu verhindern.

Füllen Sie anschließend die Glaspflasterpipette mit gefilterter intrazellulärer Lösung. Setzen Sie dann die Pipette in den Pipettenhalter des Kopftisches ein. Üben Sie durch eine Fünf-Milliliter-Spritze einen sanften Überdruck auf die Pipette aus, indem Sie den Kolben um etwa einen Milliliter verschieben, bevor Sie die Pipette in die Badlösung absenken.

Wählen Sie anschließend den V-Clamp-Modus am Verstärker und öffnen Sie die Membrantestschnittstelle in der Software. Bewegen Sie die Pipette unter dem Mikroskop nahe an das Zielneuron. Üben Sie anschließend positiven Druck von der Pipette aus, um die Schicht der Satelliten-Gliazellen zu durchqueren, bis eine plötzliche Vergrößerung des Raums zwischen dem Neuron und der umgebenden Schicht der Satelliten-Gliazellen beobachtet wird.

Bewegen Sie dann die Pipette weiter in Richtung des Neurons, bis ein Grübchen auf dem Neuron zu sehen ist. In unserer Präparation sind die Neuronen von Satelliten-Gliazellen umgeben. Um in die Gliazellschichten einzudringen und einzelne Neuronen zu erreichen, wird die Aufzeichnungspipette daher auf einem hohen Überdruck gehalten.

Reduzieren Sie danach den Überdruck. Erzielen Sie eine Giga-Ohm-Dichtung mit sanftem Sog. Um eine Ganzzellaufzeichnungskonfiguration zu erhalten, dringen Sie durch einen kurzen, aber starken Sog in die Zellmembran der Neuronen ein.

Alternativ können Sie die Zap-Funktion am Verstärker verwenden, während die Saugkraft angelegt ist. Sobald ein Ganzzellenmodus eingerichtet ist, kompensieren Sie die Gesamtzellenkapazität und den Serienwiderstand, indem Sie die Kapazitäts- und Widerstandskompensationsknöpfe am Verstärker drehen. Schließen Sie dann das Membrantestfenster.

Wählen Sie den I-Clamp Normal-Modus, indem Sie den Modusknopf am Verstärker drehen. Klicken Sie anschließend in der Software auf Protokoll öffnen. Wählen Sie das Protokoll für die Messung von Rheobase aus, laden Sie es und klicken Sie auf Aufnahme, um die Aufzeichnung zu starten.

Um die neuronale Erregbarkeit zu untersuchen, messen Sie den Eingangswiderstand und die Rheobas, indem Sie eine abgestufte Reihe von depolarisierenden Strömen in Schritten von 100 Pikoampere injizieren. Klicken Sie anschließend erneut auf Protokoll öffnen und wählen Sie das Protokoll für die Messung des Membranschwellenwerts aus. Injizieren Sie anschließend einen depolarisierenden Rampenstrom von 500 Millisekunden in das Neuron.

Um die ligandeninduzierten Ströme aufzuzeichnen, füllen Sie eine Pipette mit spezifischen Agonisten. Überprüfen Sie die Pipette, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen im Inneren befinden. Legen Sie dann die Pipette in den Pipettenhalter, der mit einem Medikamentenausgabesystem verbunden ist.

Bewegen Sie die Pipette mit dem Manipulator bis auf 15 Mikrometer an das Neuron heran. Stellen Sie den Druck des Medikamentenabgabesystems auf einen PSI und die Dauer auf eine Sekunde ein. Schalten Sie dann den Aufnahmemodus auf Spannungsklemme bei 70 Millivolt um.

Üben Sie kurzzeitig Druck über das Medikamentenabgabesystem aus, um einen medikamenteninduzierten Strom aufzuzeichnen. In dieser Abbildung wurde die Rheobase gemessen, indem eine Reihe von Strömen in das DRG-Neuron injiziert wurde. Die niedrigste Stromstärke, die ein Aktionspotential induzieren kann, wird als Rheobase definiert, wie durch den Pfeil angezeigt.

Die Rheobase für dieses Neuron beträgt 300 Pikoampere. Die Messung der Membranschwelle erfolgte durch Injektion eines Rampenstroms. Das Potential ist definiert als die Membranschwelle, wenn ein Aktionspotential hervorgerufen wird.

Die Membranschwelle für dieses Neuron liegt bei 11,9 Millivolt. In dieser Abbildung wurden die Ströme durch Puffapplikation von Glutamat oder AITC für eine Sekunde induziert. Beide Agonisten induzierten nach innen gerichtete Ströme, was auf das Vorhandensein von Glutamatrezeptoren und TRPA-1-Rezeptoren auf kleinen DRG-Neuronen hindeutet.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Epineurium zu entfernen und den hohen Druck für die Aufnahmepipette aufrechtzuerhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Patch-Clamp-Aufzeichnung an Satelliten-Gliazellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Rezeptoren und Kanäle in Satelliten-Gliazellen zu beantworten.

Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet des Schmerzes den Weg geebnet, den Beitrag der Spinalganglien zur Nozizeption zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein ganzes Spinalwurzelganglia präpariert und wie man dann eine Klemme aus einzelnen Zellen auf diese ganzen Spinalganglien flickt.