Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

Das übergeordnete Ziel dieser FINA-Methode, die für Filtration und Isolierung von Nukleinsäuren steht, besteht darin, genomische DNA für die PCR-Amplifikation aus komplexen Proben schnell und einfach ohne den Einsatz von Laborinstrumenten wie einer Zentrifuge zu isolieren. Diese schnelle papierbasierte DNA-Extraktionsmethode für HIV-provirale DNA wurde für den Einbau in ein quantitatives PCR-Diagnosegerät entwickelt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Probenvorbereitungsmodule und PCR-Röhrchen im Voraus vorbereitet werden können, so dass die DNA-Extraktion weniger als zwei Minuten dauert.

Wir haben diese Methode zunächst entwickelt, um sie in eine Probe zu integrieren, um einen frühen Säuglingsdiagnosetest auf HIV-1 aus Fersenstockblut zu beantworten. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Entfernen der Rückseite des doppelseitigen Klebebandes, das die Zelleinfangmembran an der Seite des PCR-Röhrchens hält, Übung erfordert. Das Verfahren wird von Jen Reed, einer leitenden Technikerin aus meinem Labor, demonstriert.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Materialien vorbereiten, die für den Zusammenbau des FINA-Probenvorbereitungsmoduls benötigt werden. Bereiten Sie den Löschpad vor, indem Sie ein 35 x 35 Millimeter großes Quadrat eines 2,6 Millimeter dicken Pads aus 100 % Watte zuschneiden. Bereiten Sie die Paraffinfolie mit einem Papierklebeband vor.

Schneiden Sie ein 25 x 50 mm großes Stück Paraffinfolie ab und stanzen Sie dann mit einem Hammer ein Loch mit einem Durchmesser von 7,14 mm in die Mitte des Bandes. Bereiten Sie eine Blutabscheidermembran oder eine Fangscheibe aus gebundenem Glas vor, indem Sie mit einem Hammer einen Kreis mit einem Durchmesser von 8,35 mm stanzen. Um das FINA-Probenvorbereitungsmodul zusammenzubauen, platzieren Sie die Capture-Disc mit einer Pinzette in der Mitte des Blotting-Pads.

Entfernen Sie die Rückseite des Paraffinfilmbandes und legen Sie es so über die Capture-Disc, dass das gesamte Paraffinband die Mitte der Capture-Disc freilegt. Stellen Sie einen maximalen Kontakt zwischen der Disc und dem Blottingpad sicher, indem Sie das Paraffinband leicht dehnen, um das Blottingpad zu bedecken, und das Paraffinband fest andrücken, um es an allen Kanten der Disc mit dem Blottingpad zu verkleben. Eine 5,1-mm-Bandscheibe ist erforderlich, um die Capture-Membran an der Seite des qPCR-Röhrchens zu verankern und zu verhindern, dass die Membran die Fluoreszenzdetektion des Echtzeit-PCR-Instruments blockiert.

Bereiten Sie diese Bandscheibe vor, indem Sie mit einem Hammer einen Kreis aus doppelt beschichtetem Polyester-Diagnoseband aus einem Blatt des Bandes stanzen. Entfernen Sie mit einer Pinzette eine Seite der Klebebandaufkleberfolie. Legen Sie das Tape in ein 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen und kleben Sie es auf eine Seite und auf den Boden des Röhrchens.

Entfernen Sie die zweite Stickerfolie. Die Röhre ist nun bereit, die vorbereitete Scheibe aufzunehmen. In diesem Video wird der Nachweis von proviraler DNA aus Vollblut, das mit 8e5 LAV-Zellen gespickt ist, demonstriert.

Tauen Sie die zuvor eingefrorenen 8e5 LAV-Zellpellets auf Eis auf. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung der Zellen in Gefriermedium mit Konzentrationen von 1 bis 400 Zellen pro Mikroliter vor. Pipettieren Sie 10 Mikroliter Zellen aus jeder der Verdünnungen in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Geben Sie 100 Mikroliter frische, mit HIV-1 negativem eDTA behandelte Vollblut in jedes Röhrchen, um eine Standardkurve zu erstellen. Mischen Sie, indem Sie fünfmal vorsichtig mit dem Boden der Tube schnippen. Um mit der DNA-Extraktion zu beginnen, lysieren Sie die Blutzellen, indem Sie Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration von einem Prozent hinzufügen.

Mischen Sie, indem Sie fünfmal vorsichtig mit dem Boden der Tube schnippen. Das Blut sollte sich durchscheinend rot färben. Pipettieren Sie die gesamte Blutprobe auf die Fangscheibe.

Eine wasserdichte Versiegelung zwischen dem Paraffinband und der Fangmembran sorgt dafür, dass das Blut durch die Membran fließt. Und der gute Kontakt zwischen der Kontaktmembran und der Blotting-Pad-Baugruppe sorgt für einen schnellen Probenableitung. Lassen Sie die Probe durch den Filter einweichen.

Das Blutlysat ist in die Auffangscheibe eingedrungen und die Scheibe erscheint matt. Geben Sie 600 bis 1.000 Mikroliter 10 mmol Natriumhydroxid tropfenweise auf die Auffangscheibe. Der Filter wechselt von rot auf weiß, was die Beseitigung von Hämoglobin anzeigt.

Trennen Sie anschließend die Disc vom Blottingpad und legen Sie die Disc auf das Tape im vorbereiteten PCR-Röhrchen. Nachdem der Filter in das PCR-Röhrchen eingesetzt wurde, analysieren Sie die Probe sofort. Bereiten Sie den qPCR-Mastermix wie im Protokolltext beschrieben vor und stellen Sie sicher, dass der Filter vollständig mit dem Mastermix bedeckt ist und während der gesamten Reaktion an der Seite des Röhrchens fixiert bleibt.

Führen Sie die Amplifikation mit einem Echtzeit-PCR-Gerät durch, wie im Protokolltext beschrieben. Wenn die qPCR nicht durchgeführt werden kann, können Sie den Filter alternativ sofort über Nacht in einer Box trocknen, die das Trockenmittel Calciumsulfat enthält. Am folgenden Tag verschließen Sie das PCR-Röhrchen, legen Sie es in einen folierten Beutel mit Kieselgel-Trockenmittel und lagern Sie es bei Raumtemperatur, bis es für die Analyse bereit ist.

Diese Methode ermöglicht eine effiziente Amplifikation des HIV-1-Provirus aus 8e5 LAV-Zellen mit unterschiedlichen Kopienzahlen. Die durchgezogenen Linien sind Amplifikationsdiagramme, die von vier Replikaten HIV-1-negativen Vollbluts erhalten wurden, die mit 4.000, 400, 40 und 10 8e5 LAV-Zellen mit 500 Kopien pro Reaktion der internen Kontrolle dotiert wurden. Die gestrichelte Linie zeigt den Schwellenwert an.

Das nächste Diagramm zeigt Standardkurven der Quantifizierungszykluswerte, die aus dem Amplifikationsdiagramm vs. log der Kopienzahl von 8e5 LAV-Zellen pro 100 Mikroliter Vollblut berechnet wurden. Die berechnete PCR-Effizienz betrug 103 %Die HIV-Replikate der proviralen DNA-Standardkurve weisen ebenfalls eine hochgradig reproduzierbare Amplifikation auf.

Darüber hinaus zeigt das Vorhandensein einer internen Kontrolle von 500 Kopien der Hydroxypyruvatreduktase, dass es keine PCR-Hemmung gibt, die sich aus der Extraktion von Blut mit dieser Methode ergibt, unabhängig von der Anzahl der vorhandenen Kopien des HIV-1-Provirus. Die durchgezogenen Linien stellen die Verstärkungsdiagramme dar, und die gestrichelte Linie stellt den Schwellenwert dar. Nach diesem Verfahren können PCR-Targets aus verschiedenen Probentypen amplifiziert werden, um das gewünschte Gen nachzuweisen.

Zum Beispiel Wangenabstriche für das pharmakogenetische Screening oder Blut für die schnelle Genotypisierung von Tiermodellen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit durch Blut übertragenen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer allgemeine Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.