Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

Das übergeordnete Ziel dieser FINA-Methode, die für die Filtrationsisolation von Nukleinsäuren steht, besteht darin, genomische DNA für die PCR-Amplifikation schnell und einfach aus komplexen Proben zu isolieren, ohne den Einsatz von Laborgeräten wie einer Zentrifuge. Diese schnelle, auf Papier basierende DNA-Extraktionsmethode für HIV-provirale DNA wurde zur Integration in ein quantitatives PCR-Diagnosegerät entwickelt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Probenvorbereitungsmodule und PCR-Röhrchen im Voraus vorbereitet werden können, sodass die DNA-Extraktion weniger als zwei Minuten dauert.

Wir haben diese Methode ursprünglich entwickelt, um sie in eine Probe zur frühen Säuglingsdiagnostik von HIV-1 aus Blut aus der Ferse zu integrieren. Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, könnten zunächst Schwierigkeiten haben, da das Entfernen der Unterlage des doppelseitigen Klebebands, das die Zellfangmembran an der Seite des PCR-Gefäßes befestigt, Übung erfordert. Die Durchführung des Verfahrens wird Jen Reed, eine leitende Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Materialien vorbereiten, die für die Montage des FINA-Probenpräparationsmoduls benötigt werden. Bereiten Sie den Abtupfpad vor, indem Sie ein 35 mal 35 Millimeter großes Quadrat aus einem 2,6 Millimeter dicken 100 % Baumwollpad ausschneiden. Bereiten Sie eine Plastikparaffinfolie mit einem Papierrückseitenband vor.

Schneiden Sie ein 25 mal 50 mm großes Stück Paraffinfolie zu und stanzen Sie mit einem Hammer ein Loch mit einem Durchmesser von 7,14 mm in die Mitte des Streifens. Bereiten Sie eine gebundene gläserne Blut-Trennmembran oder Erfassungsscheibe vor, indem Sie mit einem Hammer einen Kreis mit einem Durchmesser von 8,35 mm ausschlagen. Um das FINA-Probenpräparationsmodul zusammenzubauen, platzieren Sie mit einer Pinzette die Erfassungsscheibe in die Mitte des Abtupfpads.

Entfernen Sie die Unterlage des Paraffinfolienbandes und legen Sie es so über die Erfassungsscheibe, dass der gesamte Paraffinband den Mittelbereich der Erfassungsscheibe freilässt. Stellen Sie durch leichtes Dehnen des Paraffinbandes sicher, dass es die Blotting-Matte vollständig bedeckt und durch festes Andrücken um sämtliche Ränder der Scheibe herum gut mit der Blotting-Matte verbunden ist, um den maximalen Kontakt zwischen Scheibe und Blotting-Matte zu gewährleisten. Eine 5,1-mm-Band-Scheibe ist erforderlich, um die Erfassungsmembran an der Seite des qPCR-Röhrchens zu befestigen und zu verhindern, dass die Membran die Fluoreszenzdetektion des Echtzeit-PCR-Geräts blockiert.

Stellen Sie diese Klebeband-Disc her, indem Sie mit einem Hammer einen Kreis aus doppelseitig beschichtetem Polyester-Diagnoseband aus einem Blatt des Bandes stanzen. Entfernen Sie mit einer Pinzette eine Seite der Schutzfolie des Klebebands. Legen Sie das Band in eine 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen, wobei es an einer Seite und näher zum Boden des Röhrchens haften soll.

Entfernen Sie die zweite Abziehfolie. Das Röhrchen ist nun bereit, die vorbereitete Scheibe aufzunehmen. In diesem Video wird der Nachweis von proviraler DNA aus Vollblut, das mit 8e5 LAV-Zellen versetzt wurde, demonstriert.

Tauen Sie die zuvor gefrorenen 8e5 LAV-Zellpellets auf Eis auf. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung der Zellen in dem Gefriermittel mit Konzentrationen von 1 bis 400 Zellen pro Mikroliter vor. Pipettieren Sie 10 Mikroliter Zellen aus jeder Verdünnung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Geben Sie 100 Mikroliter frische, mit eDTA behandelte Vollblutprobe, die HIV-1-negativ ist, in jedes Röhrchen, um eine Standardkurve zu erstellen. Mischen Sie durch vorsichtiges Antippen des Röhrchenbodens fünfmal. Um die DNA-Extraktion zu beginnen, lysieren Sie die Blutzellen durch Zugabe von Triton X-100 auf eine Endkonzentration von einem Prozent.

Mischen Sie, indem Sie vorsichtig fünfmal an den Boden des Röhrchens klopfen. Das Blut sollte sich durchscheinend rot färben. Pipettieren Sie die gesamte Blutprobe auf die Erfassungsscheibe.

Eine wasserdichte Abdichtung zwischen dem Paraffinband und der Capture-Membran stellt sicher, dass das Blut durch die Membran fließt. Ein guter Kontakt zwischen der Kontaktmembran und der Blotting-Pad-Anordnung gewährleistet ein schnelles Durchziehen der Probe. Lassen Sie die Probe vollständig in den Filter eindringen.

Das Blutlysat hat sich in der Erfassungsscheibe verteilt und die Scheibe erscheint matt. Geben Sie 600 bis 1.000 Mikroliter 10 mmol Natriumhydroxid tropfenweise auf die Erfassungsscheibe. Der Filter wechselt von rot zu weiß, was auf die Entfernung von Hämoglobin hinweist.

Trennen Sie anschließend die Scheibe vom Blotting-Pad und bringen Sie die Scheibe auf dem Klebeband im vorbereiteten PCR-Röhrchen an. Sobald der Filter im PCR-Röhrchen platziert ist, analysieren Sie die Probe sofort. Bereiten Sie die qPCR-Master-Mix gemäß der Beschreibung im Protokolltext vor und stellen Sie sicher, dass der Filter vollständig mit dem Master-Mix bedeckt ist und während der gesamten Reaktion an der Röhrchenwand fixiert bleibt.

Führen Sie die Amplifikation mit einem Echtzeit-PCR-Gerät wie im Protokolltext beschrieben durch. Alternativ, falls die qPCR nicht sofort durchgeführt werden kann, trocknen Sie den Filter über Nacht in einer Box mit Calciumsulfat-Trockenmittel. Am folgenden Tag verschließen Sie das PCR-Röhrchen und legen es in eine mit Aluminiumfolie umhüllte Tüte mit Silica-Trockenmittel; bewahren Sie es bei Raumtemperatur auf, bis es zur Analyse bereit ist.

Diese Methode ermöglicht eine effiziente Amplifikation des HIV-1-Provirus aus 8e5 LAV-Zellen bei unterschiedlichen Kopienzahlen. Die durchgezogenen Linien zeigen Amplifikationskurven, die aus vier Wiederholungen von HIV-1-negativem Vollblut stammen, das mit 4.000, 400, 40 und 10 8e5 LAV-Zellen versetzt wurde, jeweils mit 500 Kopien pro Reaktion als interner Kontrolle. Die gestrichelte Linie markiert die Schwelle.

Der nächste Graph zeigt Standardkurven von Quantifizierungszykluswerten, die aus dem Amplifikationsplot im Vergleich zum Logarithmus der Kopienzahl von 8e5 LAV-Zellen pro 100 Mikroliter Vollblut berechnet wurden. Die berechnete PCR-Effizienz betrug 103 %. Die Replikate der HIV-proviralen DNA-Standardkurve weisen ebenfalls eine sehr reproduzierbare Amplifikation auf.

Zusätzlich zeigt das Vorhandensein einer internen Kontrolle mit 500 Kopien der Hydroxypyruvat-Reduktase, dass keine PCR-Hemmung auftritt, die durch die Blutgewinnung mit dieser Methode verursacht wird, unabhängig von der Anzahl vorhandener HIV-1-Provirus-Kopien. Die durchgezogenen Linien stellen die Amplifikationskurven dar und die gestrichelte Linie repräsentiert die Schwelle. Mit diesem Verfahren können PCR-Ziele aus verschiedenen Probenarten amplifiziert werden, um Ihr Gen von Interesse nachzuweisen.

Beispielsweise Wangenabstriche zur pharmakogenetischen Untersuchung oder Blut zur schnellen Genotypisierung von Tiermodellen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit blutübertragbaren Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann, und beachten Sie stets universelle Vorsichtsmaßnahmen, während Sie diesen Eingriff durchführen.