Name: Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Lernen Sie die FINA-Methode zur schnellen DNA-Extraktion aus komplexen Proben wie Vollblut für HIV-Diagnostik. Diese papierbasierte Technik ermöglicht die Probenaufbereitung in unter zwei Minuten ohne Zentrifuge.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Protokollentwicklung wurde durch den Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774 unterstützt. Real-Time-PCR-Reagenzien und Beratung wurden von Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, zur Verfügung gestellt. 8E5-LAV-Zellen wurden vom Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medizinisches Zentrum. HIV-1-negatives Blut wurde von Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL, zur Verfügung gestellt. Vielen Dank an Mark Fisher für die Hilfe beim Fotografieren.

Ethik-Erklärung: Die Vollblut-Proben in dieser Studie verwendet werden, nicht am Menschen zu sein Forschung. Die Proben wurden für klinische Diagnosezwecke erhalten, die erfüllt waren, und der restliche Teil dieser Proben wurde für die FINA Forschungs Assay bereitgestellt. Die Proben wurden so codiert, daß die Forscher die Identität von Personen nicht in der Lage, ohne weiteres festzustellen waren. 1. Herstellung von FINA Probenvorbereitungsmodul <ol><li> Bereiten Sie Pad Blotting eine 35 x 35 mm 2 einer 2,6 mm dicken 100% Baumwolle - Pad durch Schneiden. Schneiden Sie ein Pad pro Probe. </li><li> Bereiten Kunststoff Paraffinfilm mit einem Papierträgerband durch ein Schneidstück Paraffinfilm (25 mm (h) von 50 mm (w)) und dann eine 7,14 mm Durchmesser Loch in der Mitte des Bandes Stanzen eines Hammer angetrieben Locher mit. Bereiten Sie eine Band pro Probe. </li><li> Bereiten Sie ein gebundenes Glas Bluttrennmembran (Capture-Membran) Scheibe durch einen 8,35 mm Durchmesser-Kreis Stanzenmit einem Hammer angetrieben Locher. Lochen eine Platte pro Probe. Die Scheibe hat eine Partikelrückhaltevermögen von 2,3 &amp; mgr; m. </li><li> Montieren Sie die FINA Probenvorbereitungsmodul durch die Aufnahmeplatte in der Mitte der Schreibunterlage mit einer Pinzette platziert. Legen Sie das Paraffin Filmband über die Capture-Scheibe, so dass das Loch des Paraffins Band in der Mitte der Fangplatte ausgesetzt verlässt. </li><li> Stellen Sie sicher, einen maximalen Kontakt zwischen der Platte und dem Löschblatt durch das Paraffin Band dehnen leicht die Schreibunterlage und Drücken des Paraffin Band zu bedecken fest an die Schreibunterlage zu bleiben, um alle Kanten der Platte. </li><li> Machen Sie so viele Module wie für das Experiment oder Halde für die zukünftige Verwendung benötigt. </li></ol> 2. Herstellung von qPCR-Schlauch <ol><li> Vorbereiten eines 5,1 mm-Bandscheibe, die die Zelle Einfangmembran auf der Seite der qPCR Röhre verankern wird die Membran von Blockierung der Fluoreszenzdetektion durch Stanzen eines Kreises von doppelt beschichteten polye zu verhindernster Diagnoseband mit einem Hammer angetriebenen Stempel aus einem Blatt des Bandes. Bereiten Sie eine Bandscheibe pro Probe. </li><li> Entfernen Sie eine Seite der Aufkleber Schiff der Band. Legen das Band in einem 200 &amp; mgr; l PCR-Röhrchen, das auf der einen Seite und in Richtung der Unterseite des Rohres haften. Entfernen Sie den zweiten Sticker-Liner. Das Rohr ist nun fertig vorbereitete Platte zu erhalten. </li><li> Produzieren Sie so viele Rohre wie für das Experiment oder Halde für die zukünftige Verwendung benötigt. </li></ol> 3. Contrive Blutprobe Hinweis: Wenn ein echter Testprobe vorbereitet wird, gehen Sie zu Schritt 4. <ol><li> Thaw 8E5-LAV - Zellen 15 eine einzige Kopie der HIV-1 - Provirus erhalten aus der Virologie Qualitätssicherung Labor beherbergen (VQA; Eile Presbyterian / St Lukes Medical Center, Chicago, IL.). Hinweis: sie gespeichert sind, als gefrorene Zellpellets in einer Konzentration von 4.000 Zellen / &amp; mgr; l. Zellzahl wurde zuvor 9 wie beschrieben verifiziert. </li><li> bereiten serial Verdünnungsmedium (90% fötales Rinderserum, 10% Dimethylsulfoxid) auf Konzentrationen von 1 bis 400 Zellen / ul in einfriert. </li><li> Pipette 10 ul Zellen aus jedem der seriellen Verdünnungen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l Frisch HIV-1 negativen EDTA behandelt Vollblutprobe in jedes Röhrchen 10-4,000 eine Standardkurve von 8E5-LAV-Kopienzahlen zu erstellen. Mischen Sie vorsichtig den Boden der Röhre 5 mal schnippen. </li></ol> 4. Führen Sie FINA-Extraktion <ol><li> Lyse Blutzellen durch Zugabe von Triton-X100) bis zu einer Endkonzentration von 1% (11 &amp; mgr; l 10% Triton-X100 bis 110 &amp; mgr; l Vollblut und Zellen aus Schritt 3.3). </li><li> Mischen Sie vorsichtig den Boden der Röhre 5 mal schnippen. Das Blut sollte durchscheinend rot. </li><li> Pipettieren alle der Blutprobe auf die Capture-Platte. Hinweis: Eine wasserdichte Abdichtung zwischen dem Paraffin Band und der Einfangmembran stellt sicher, daß das Blut die Membran fließt, und einen guten Kontakt zwischen dem Erfassungs membrane und Schreibunterlage Montage sorgt für eine schnelle Probe Feuchtigkeitstransport. </li><li> Lassen Sie Probe durch den Filter zu tränken. Hinweis: Die Blut-Lysat Dochte in die Schreibunterlage aufgrund der Kapillarwirkung, die genomische DNA auf der Oberfläche der Capture-Platte zu erfassen. Das Lysat wurde in die Scheibe eingetaucht, wenn es matt erscheint. </li><li> In 600-1.000 &amp; mgr; l 10 mM NaOH tropfenweise auf die Capture-Platte. Hinweis: Die Pufferwäsche kann auch als bulk Zugabe von 600 &amp; mgr; l zugegeben werden. Der Puffer wird ein Tröpfchen auf dem hydrophoben Paraffinband bilden und in etwa 20 sec auf die Platte durch das Loch Docht. Der Filter wird von rot auf weiß anzeigt, Clearance von Hämoglobin ändern. </li><li> Trennen Sie die Diskette aus dem Löschblatt mit einer Zange und ziehen Sie die Platte auf das Band in die vorbereitete PCR-Röhrchen. Wenn es eine rote Farbe auf dem Filter hinzufügen, 50-100 &amp; mgr; l Waschpuffer gelassen ist, den Filter zu löschen, bevor in die Röhre platzieren. Hinweis: Gelegentlich kam es Überdruck angewendet bei der Herstellung vondie FINA-Module Ergebnisse in Partitionierung der Membranschichten während der Trennung von der Schreibunterlage. Entsorgen Sie diese Disketten und bereiten eine neue Probe. </li><li> Nachdem der Filter in dem PCR-Röhrchen platziert wird, analysieren die Proben sofort. Alternativ trocken über Nacht in einem Karton mit Calciumsulfat Trocken, dann verschließen und in einen Folienbeutel mit Kieselsäure Trocken- und Speicher bis zur Analyse bereit. </li></ol> 5. qPCR-Reaktion <ol><li> Bereiten Sie 100 ul qPCR Mastermix pro Reaktion unter Verwendung von HIV - spezifische Primer und Sonden , wie zuvor beschrieben 9,11. Umfassen eine interne Amplifikationskontrolle für die Anwesenheit von Amplifikationsprodukten Inhibitoren zu überwachen und zu überprüfen, ob eine negative Probe ein wahrer negativ ist. Stellen Sie sicher, dass der Filter vollständig mit Mastermix abgedeckt ist und dass der Filter zur Seite des Rohres während der gesamten Reaktions fixiert bleibt. </li><li> Für die Amplifikation eine Echtzeit - PCR - Gerät , wie zuvor 9 beschrieben. </li></ol>

<ol><li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li>
<li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Paper+Machine%22+for+Molecular+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li>
<li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world%3B+an+example+of+microfluidic+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li>
<li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+molecular+diagnostic+for%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li>
<li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-Based+RNA+Extraction%2C+in+Situ+Isothermal+Amplification%2C+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost%2C+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+%28H1N1%29+from+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li>
<li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+%28STIs%29%3A+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).</li>
<li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+the+developing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li>
<li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li>
<li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li>
<li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).</li>
<li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li>
<li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li>
<li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-PCR+processing%3A+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
<li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).</li>
<li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization%22">World Health Organization</a>. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).</li>
<li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afr+Med+J%22%5BJournal%5D)">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

EID verbunden schnelle Behandlung Zugang hat sich gezeigt , die Kindersterblichkeit zu reduzieren aufgrund einer HIV - Infektion 16. Aufgrund der Persistenz der mütterlichen Antikörper bei einem Säugling Blut haben Dienstprogramm schnellen HIV-Antikörper-Tests begrenzt den Status von HIV-exponierten Neugeborenen bei der Bestimmung. Die WHO empfiehlt , dass alle Kinder von HIV-1 - positiven Müttern geboren sollte bei 4-6 Wochen alt getestet werden, eine virologische Test 17 ​​verwendet wird . Wir ha...

Mehrere Berichte haben die Entwicklung von papier- oder membranbasierten Extraktionsverfahren für die Verwendung in Point-of-Care (POC) -Geräte 1-5 mit dem Ziel, die exquisite Sensitivität und Spezifität der molekularen Diagnostik zur Verfügung zu allen diskutiert. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) Sexuell übertragbare Krankheiten Diagnostics Initiative prägte den Begriff ASSURED (Bezahlbar, empfindlich, spezifisch, benutzerfreundliche, schnelle und robuste, Ausrüstung frei und Lieferung für diejenigen, die es brauchen) die idealen Eigenschaften eines POC zu beschreiben Test 6. Von diesen Richtlinien ist die Ausrüstung freie charakteristische besondere Herausforderung für die molekulare Diagnostik zu erreichen. Jede Innovation auf dem Gebiet wird jedoch voran das Ziel , die in den meisten Bedürftigen erreicht, und es gibt Hoffnung für kurzfristige Verbesserungen der Testleistung von bestehenden Technologie zur Anpassung 7. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die DNA aus Vollblut zu extrahierendass erfordert keine komplexe Chemie oder Laborinstrumente. Die FINA (Filtration Isolierung von Nukleinsäuren) Probenvorbereitung wurde ursprünglich um DNA aus Vollblut zu extrahieren Leukozyten entwickelt, um die HIV-1-Provirus als Teil einer Probe zu beantwortende Point-of-Care (POC) quantitative PCR zu erkennen (qPCR) frühkind Diagnose (EID) Plattform für den Einsatz in begrenzten Ressource - Einstellungen 8-11. FINA Extraktion unterscheidet sich von herkömmlichen Reinigungsverfahren Silikamembranen oder Silika-beschichteten paramagnetischen Partikeln verwenden , um reversibel DNA in Gegenwart von chaotropen Mitteln 12 binden. Stattdessen verwendet FINA vertikale Filtration über eine Trennmembran direkt zelluläre DNA aus Vollblut zu extrahieren. Die Membran , die die eingeschlossene DNA enthält , kann direkt in einem PCR - Röhrchen gegeben werden und entweder sofort in einer PCR - Reaktion oder Luft für die spätere Amplifikation 9 getrocknet eingesetzt. Keine chaotropen Mitteln, Phenol oder Alkohole werden in der Probenextraktion verwendet, eliminating die umfangreichen Waschschritte benötigt starke qPCR - Inhibitoren aus dem Extraktionsprozess 13,14 abgeleitet zu entfernen. Die FINA Membran kann entweder Zellen 9 oder genomische DNA erfassen durch Zelllyse freigesetzt 11 , bevor die Probe auf die Membran gegeben wird. Für die Zell capture wird Vollblut direkt auf die Membran gegeben. Anschließend werden die Zellen in der Membran lysiert durch Zugabe von 10 mM NaOH. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es nur drei Schritten durchgeführt: 1) Probenzugabe; 2) Zelllyse / Wäsche und 3) Filterscheibe Platzierung in qPCR Rohr. Der Nachteil dieser Methode ist, dass die Membran nur eine definierte Anzahl von Zellen direkt proportional zum Durchmesser der Membranscheibe halten kann. Um die Nachweisgrenze zu erreichen für EID benötigt wurden 100 ul Vollblut wird für die Probeneingabe erforderlich, die einen Filter beinhaltet, der zu groß ist, in einem qPCR Rohr platziert werden. Lyse der Blutzellen mit einem Reinigungsmittel, bevor die Probe in die Auflistung hinzufügenMembran fügt einen Verarbeitungsschritt, jedoch ermöglicht die Verwendung eines kleineren Filters für die gleiche Probengröße. Wir konnten eine hohe Reproduzierbarkeit, einzelne Kopie Erkennung und Quantifizierung von weniger als 10 Kopien des HIV-1 proviralen DNA von 100 ul Blut Konfiguration 11 mit diesem Test zu demonstrieren. In diesem Bericht beschreiben wir die FINA-Protokoll, wie sie ursprünglich für den Laboreinsatz entwickelt. Die Membran / Filter-Sandwich als FINA Probenvorbereitungsmodul bekannt sind, können in großen Chargen und auf Halde für die spätere Verwendung vorbereitet werden. Wenn die Proben in diesem Prozess, 2 dauert min extrahiert werden und kann in unterschiedlicher Größe Chargen durchgeführt werden. Die qPCR können sofort ausgeführt werden oder die Filter die eingebettete DNA enthalten, können gespeichert werden, bis es bequem ist, qPCR auszuführen. Diese Methode ist sehr bequem für die Routineanalyse von Proben in niedrigen und hohen Ressourceneinstellungen.

<table><tbody><tr><td>Fusion 5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>8151-9915</td><td></td></tr><tr><td>707 Löschpad</td><td>VWR International</td><td>28298-014</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M</td><td>VWR International</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>3M Doppelt beschichtetes Polyester-Diagnoseband</td><td>3M Medical Specialties</td><td>9965</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l qPCR-Streifenröhrchen</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>optische Streifenkappen</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005p qPCR-System</td><td>Agilent</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>A.C.S. Reagenz</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>fötales Rinderserum, zertifiziert, U.S. Herkunft</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Hammergetriebener kleiner Locher mit 3/16" Lochdurchmesser (5,1 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A16</td><td></td></tr><tr><td>Hammergetriebener kleiner Locher mit 1/4" Lochdurchmesser (7,14 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A19</td><td></td></tr><tr><td>Hammergetriebener kleiner Locher mit kleinem Lochdurchmesser 5/16" (8,35 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A23</td><td></td></tr></tbody></table>

filtration isolierung von nukleinsäuren: eine einfache und schnelle dna-extraktionsmethode

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, Filtration Isolierung von Nukleinsäuren, ist ein neuartiges Extraktionsverfahren, das über eine Trennmembran und absorbierendes Kissen zum Extrahieren der zellulären DNA aus Vollblut in weniger als 2 min vertikale Filtration verwendet. Die Blutprobe wird mit einem Detergens, behandelt kurz gemischt und mit einer Pipette auf die Trennmembran aufgebracht. Das Lysat Dochte in die Schreibunterlage aufgrund der Kapillarwirkung, die genomische DNA auf der Oberfläche der Trennmembran zu erfassen. Die extrahierte DNA wird auf die Membran während einer einfachen Waschschritt zurückgehalten, wobei PCR-Inhibitoren Schlechten in das absorbierende Löschblatt sind. Die Membran, die die eingeschlossene DNA enthält, wird dann ohne weitere Reinigung der PCR-Reaktion zugesetzt. Diese einfache Methode nicht Laborausrüstung erfordern und kann leicht mit preiswerten Labormaterialien realisiert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum hochempfindlichen Nachweis und die Quantifizierung von HIV-1 proviralen DNA von 100 ul Vollblut als ein Modell für frühfant Diagnose von HIV, die ohne weiteres auf andere genetische Ziele angepasst werden könnte.

Der Workflow für provirale DNA aus Vollblut extrahieren gespickt mit 8E5-LAV - Zellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2 zeigt die FINA Probenmodul und vorbereitet qPCR Rohr. Dieses Verfahren ermöglicht eine effiziente Amplifikation von HIV-1 - Provirus von 8E5-LAV - Zellen bei unterschiedlicher Kopienzahl, wie in der Standardkurve von künstlich Proben (Figur 3) dargestellt. PCR hatte einen Wirkungsgrad von 103%, wie aus Efficie...

Wir beschreiben hier ein einfaches und schnelles papierbasierten DNA-Extraktionsverfahren von HIV provirale DNA aus Vollblut durch quantitative PCR nachgewiesen. Dieses Protokoll kann bei der Aufdeckung von anderen genetischen Markern oder alternative Amplifikationsverfahren zur Verwendung verlängert werden.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Das übergeordnete Ziel dieser FINA-Methode, die für die Filtrationsisolation von Nukleinsäuren steht, besteht darin, genomische DNA für die PCR-Amplifikation schnell und einfach aus komplexen Proben zu isolieren, ohne den Einsatz von Laborgeräten wie einer Zentrifuge. Diese schnelle, auf Papier basierende DNA-Extraktionsmethode für HIV-provirale DNA wurde zur Integration in ein quantitatives PCR-Diagnosegerät entwickelt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Probenvorbereitungsmodule und PCR-Röhrchen im Voraus vorbereitet werden können, sodass die DNA-Extraktion weniger als zwei Minuten dauert.Wir haben diese Methode ursprünglich entwickelt, um sie in eine Probe zur frühen Säuglingsdiagnostik von HIV-1 aus Blut aus der Ferse zu integrieren. Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, könnten zunächst Schwierigkeiten haben, da das Entfernen der Unterlage des doppelseitigen Klebebands, das die Zellfangmembran an der Seite des PCR-Gefäßes befestigt, Übung erfordert. Die Durchführung des Verfahrens wird Jen Reed, eine leitende Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Materialien vorbereiten, die für die Montage des FINA

filtration-isolation-nucleic-acids-simple-rapid-dna-extraction

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein Gerät mit Chemikalien werden beschrieben, um sequentiell Isolierung von Nukleinsäuren durch Proteine ​​aus einer Probe ohne Einsatz von Elektrizität an. Das Werkzeug besteht aus einem Sorptionsmittel innerhalb einer Transferpipette gehalten, während die Isolation Chemie auf Festphasenextraktion Prinzipien beruhen. Die isolierten Makromoleküle durch Immun-basierten und PCR-basierten Assays analysiert werden.

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Quelle: Dembowski, J. A., et al. Aufreinigung viraler DNA zur Identifizierung assoziierter viral bedingter und zellulärer Proteine. J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video demonstriert die Isolierung von Protein–virale DNA-Komplexen aus Zellkernen mithilfe der Click-Chemie und der Reinigung mit magnetischen Bäden. Das Protokoll umfasst die Markierung viraler Genome mit alkinmodifizierten Nukleotiden, die Biotinylierung über eine Click-Reaktion und die Bindung an mit Streptavidin beschichtete...

Isolierung von Proteinen aus viralen DNA-Protein-Komplexen

Wir skizzieren eine Methodik für die Verarbeitung von Vollblut, um eine Vielzahl von Komponenten für die weitere Analyse zu erhalten. Wir haben ein optimiertes Protokoll optimiert, das eine schnelle gleichzeitige Verarbeitung von Vollblutproben mit hohem Durchsatz in einer nicht-klinischen Umgebung ermöglicht.

Schnelle Fraktionierung und Isolierung von Vollblutkomponenten in Proben aus einer Gemeinschaft basierende Einstellung Erhalten

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die schnelle Virus Nukleinsäure-Extraktion aus der Vollblut-Virus inaktiviert. Die Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom. Die Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und kann überall (z.B.in Feldlazaretten) verwendet.

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

Die Isolierung einzelner Kerne beruht auf der Dissoziation und der Waschmittel-basierten Permeabilisierung der Zellmembran, Schritte, die optimiert werden müssen und anfällig für die Einführung technischer Artefakte sind. Wir zeigen ein Waschmittel- und enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung intakter Kerne direkt aus dem gesamten Gewebe, das Kerne liefert, die für Single-Nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) oder ATAC-seq geeignet sind.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

Die Studie beschreibt ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenem Säugetiergewebe für die nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung.

Ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll für die Isolierung von Einzelkernen aus gefrorenem Säugetiergewebe für die Einzelkernsequenzierung

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente Methode zur Beschleunigung der Plasmid-DNA-Extraktion. Durch die Verwendung von maßgeschneiderten 3D-gedruckten Racks, die mit Standardrotoren mit Schaufelplatten kompatibel sind, können Forscher bis zu 48 Rotationssäulen mit Kappen oder bis zu 116 Rotationssäulen ohne Kappen gleichzeitig verarbeiten, was die Handhabungszeit im Vergleich zu manuellen Mikrozentrifugenmethoden deutlich verkürzt.

Mitteldurchsatz-Säulen-DNA-Extraktion mit 24-Well-Racks

Die Verwendung von NanoDrop Mikrovolumens Systeme als praktische und effiziente Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure Quantifizierung Methodik ist durch die Demonstration von zwei Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung Protokollen beschrieben.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Diese Mitteilung enthält Daten über die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der BioSpec-nano UV-VIS Spektralphotometer für dsDNA-und Protein-Quantifizierung. Selbst bei extrem kleinen Volumina (1 bis 2 L), ist die Reproduzierbarkeit ausgezeichnet, während die automatische Wisch-Funktion verbessert den Durchsatz und die Ergebnisse in minimaler Verschleppung für genauere Ergebnisse.

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Dieses Video zeigt das Protokoll für die DNA-Extraktion aus Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Material. Dies ist eine mehrtägige Prozedur, in der Gewebeschnitte werden deparaffinierten mit Xylol, rehydriert mit Ethanol und mit Proteinase K zu reinigen und zu isolieren DNA für die nachfolgende Gen-spezifischen oder genomweite Analyse.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Lernen Sie die FINA-Methode zur schnellen DNA-Extraktion aus komplexen Proben wie Vollblut für HIV-Diagnostik. Diese papierbasierte Technik ermöglicht die Probenaufbereitung in unter zwei Minuten ohne Zentrifuge.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

Weitere Videos entdecken