Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Das übergeordnete Ziel dieser direkten Thrombusbildgebungstechnik besteht darin, fluoreszenzmarkierte zerebrale Thromboembolien in vivo und ex vivo quantitativ mittels Goldnanopartikeln, der Computertomographie und der Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Hämostase und Thrombose zu beantworten, beispielsweise zeit- oder dosisabhängige sowie schwerwiegende orthopädische Reaktionen zerebraler Thromboembolien auf Gewebe-Plasminogen-Aktivator oder neu untersuchte thrombolytische Wirkstoffe. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass nach intravenöser Injektion von Goldnanopartikeln eine hochauflösende Mikro-CT-Bildgebung die dynamische Entwicklung zerebraler Thromboembolien erfasst, indem deren Lokalisation und Belastung in vivo quantitativ visualisiert werden und anschließend durch Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebung des Thrombus ex vivo bestätigt wird.

Die Durchführung des Verfahrens wird von Jeong-Yeon Kim durchgeführt, einer Postdoktorandin aus meinem Labor. Nachdem 300 bis 1.000 Mikroliter arterielles Blut mittels Herzpunktion gesammelt wurden, 70 Mikroliter der Probe zu 30 Mikrolitern des geeigneten aktivierten Gerinnungsfaktors, 13 vermittelter fibrinvernetzender Aktivität empfindlicher fluoreszierender Sonde hinzufügen und eine Dreimilliliter-Spritze, ausgestattet mit einer 23-Gauge-Nadel, mit der resultierenden Mischung befüllen. Anschließend das markierte Blut in einen 20 Zentimeter langen Polyethylen-Schlauch injizieren und das Blut bei Raumtemperatur gerinnen lassen.

Nach zwei Stunden überführen Sie das Röhrchen für 22 Stunden auf vier Grad Celsius und schneiden es anschließend in 1,5 Zentimeter lange Stücke. Mit einer dreimilliliter-Spritze, die mit PBS gefüllt ist, spülen Sie den Thrombus aus jedem Röhrchenstück in einzelne Vertiefungen einer sechs-Vertiefungs-Platte, die PBS enthält. Waschen Sie die Thromben dreimal mit PBS, füllen Sie dann eine einmilliliter-Salzspritze mit einer 30-Gauge-Nadel und führen Sie diese vorsichtig in ein Ende eines 15 Zentimeter langen PE10-Röhrchens ein, um einen gewaschenen Thrombus in das gegenüberliegende Ende des Röhrchens einzusaugen.

Verbinden Sie dann die mit Thrombus beladene PE10-Röhre mit einer drei Zentimeter langen PE50-Röhre, die ein auf 200 Mikrometer Durchmesser zugespitztes Ende aufweist. Nachdem die Anästhesie durch das Fehlen einer Reaktion auf eine Zehenquetschung bestätigt wurde, desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Betadine und 70 %igem Alkohol und verwenden ein Skalpell, um einen einen Zentimeter langen vertikalen Schnitt zwischen dem linken Ohr und dem Auge anzulegen. Kleben Sie das distale Ende der optischen Faser eines Laser-Doppler-Flussmessgeräts auf die freigelegte linke Schädeltemporalfläche, eine Millimeter links und vier Millimeter unterhalb des Bregma, und beginnen Sie die Doppler-Überwachung.

Danach einen drei Zentimeter langen vertikalen medianen Schnitt durch das perivaskuläre Weichgewebe führen, um die linke Karotisbulla freizulegen. Mit einer sterilen 6-0 schwarzen Seidennaht wird die linke proximale Arteria carotis communis ligiert, gefolgt von der Ligatur der linken Arteria carotis interna und der linken Arteria pterygopalatina mit sterilen 7-0 schwarzen Seidennähten. Mit einer monopolar elektrischen Schlinge wird die linke Arteria thyreoidea superior koaguliert, anschließend wird die linke proximale Arteria carotis externa mit sterilen 7-0 schwarzen Seidennähten locker und das distale Ende des Gefäßes fest ligiert.

Verwenden Sie Mikroscheren, um ein Loch von 0,2 bis 0,25 Mikron zwischen den ligierten Stellen der Arteria carotis externa zu erzeugen, und führen Sie den thrombushaltigen Katheter in das Loch ein, während Sie die proximale Ligatur der Arteria carotis externa lockern. Schieben Sie den Katheter in die Arteria carotis communis vor, um ihn an Ort und Stelle zu fixieren, und ziehen Sie die proximale Ligatur der Arteria carotis externa erneut fest. Durchtrennen Sie das distale Ende der Arteria carotis externa mittels Elektrokauterisierung und drehen Sie das freie proximale Ende der Arteria carotis externa im Uhrzeigersinn, um die Gefäßausrichtung mit der Arteria carotis interna zu gewährleisten, während Sie den Katheter zurückziehen.

Danach lockern Sie die Ligatur der Arteria carotis interna und führen den Katheter sofort etwa neun Millimeter in die Bifurkation der Arteria cerebri media und Arteria cerebri anterior ein. Danach ziehen Sie die Naht an der Arteria carotis interna erneut fest, wobei der Katheter umschlossen wird, und drücken Sie vorsichtig die Spritze, um den Thrombus in den Bifurkationsbereich zu injizieren. Wenn am Doppler ein Blutfluss beobachtet wird, der um mehr als oder gleich 30 % unter dem Ausgangswert liegt, entfernen Sie den Katheter und ligieren Sie sofort das proximale Ende der Arteria carotis externa.

Um den Thrombus mittels Mikro-Computertomographie zum geeigneten experimentellen Zeitpunkt abzubilden, verdünnen Sie fibrinzielgerichtete Goldnanopartikel auf eine Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter in 10 Millimolar PBS und beschallen Sie das Thrombus-Bildgebungs-Agens 30 Minuten lang, um eine homogene Suspension der Nanopartikel sicherzustellen. Injizieren Sie anschließend 300 Mikroliter der fibrinzielgerichteten Partikel in die Penisvene des Versuchstieres. Überführen Sie das Tier auf die Untersuchungsliege des Mikro-CT-Geräts und verwenden Sie einen an einer Nadel befestigten Faden, um sanft an den oberen Schneidezähnen zu ziehen, um den Hals zu strecken.

Fünf Minuten nach der Injektion der Goldnanopartikel die Bildgebung beginnen. Um den Thrombus mittels ex vivo Nahinfrarotbildgebung zu visualisieren, das entnommene Gehirngewebe mit der Basis nach oben in den Bildgebungssystem legen. Bilder der fluoreszenzmarkierten Thromboembolien in den Arterien des arteriellen Kreisels (Circle of Willis) aufnehmen.

Danach positionieren Sie das Gewebe mit der Spitze nach oben und nehmen Sie Bilder der kortikalen Thromboembolien auf. Befeuchten Sie das Gewebe mit einigen Tropfen Kochsalzlösung und entnehmen Sie mithilfe eines Gehirnmatrixgeräts gemäß den Herstelleranweisungen schnell sechs zwei Millimeter dicke koronare Gehirnschnitte. Während Sie die Schnitte mit Kochsalzlösung feucht halten, fertigen Sie zusätzliche Nahinfrarotbilder der Vorder- und Rückseiten der Schnitte an.

Um die Thrombusfläche nach der Mikro-CT-Bildgebung zu quantifizieren, öffnen Sie die Bilddatensätze und wählen Sie nacheinander Image und dann Type sowie 8-bit aus, um die Bilder in 8-Bit-Graustufen umzuwandeln. Wenn ein Pixel der CT-Bilddateien 0,053 Millimeter entspricht, verwenden Sie Analyze Set Scale, um jeweils 1, 0,053 und Millimeter für Abstand in Pixeln, Bekannter Abstand und Längeneinheit einzugeben. Wählen Sie anschließend unter Edit nacheinander Selection und Specify aus, um einen interessierenden Bereich (ROI) in einem Bereich des Hirnparenchyms ohne Thrombus oder hyperdichte, knochenbezogene Region festzulegen.

Da der festgelegte interessierende Bereich auf jede Schicht des Stacks angewendet wird, überprüfen Sie, ob der Bereich in keiner der Schichten mit einer hyperdichten Region überlappt. Gehen Sie dann unter Plugin zu „Region of Interest“ und Hintergrundsubtraktion in der Region of Interest und geben Sie zwei als Anzahl der Standardabweichungen vom Mittelwert ein. Suchen Sie hyperdichte, thromboembolischen Ereignissen zuzuordnende Läsionen und zoomen Sie in den Läsionsbereich hinein.

Wählen Sie nun Bild, gefolgt von Anpassen und Schwellwert, und geben Sie einen unteren Schwellwert von 22 und einen oberen Schwellwert von 255 ein. Wählen Sie Über/Unter, um die Pixel unterhalb des unteren Schwellwerts in Blau, die schwellwertgefilterten Pixel in Graustufen und die Pixel oberhalb des oberen Schwellwerts in Grün anzuzeigen. Verwenden Sie anschließend das Freihand-Auswahlwerkzeug, um interessierende Bereiche zu zeichnen, die die thromboembolischen hyperdichten Läsionen umgeben, wobei knöcherne Bereiche ausgeschlossen werden müssen.

Wählen Sie unter „Analysieren“ die Option „Messungen festlegen“ und aktivieren Sie „Fläche“, „Mittlerer Grauwert“ und „Integrierte Dichte (Fläche × Mittelwert)“. Aktivieren Sie außerdem die folgenden Optionen: „Auf Schwellenwert begrenzen“ und „Beschriftung anzeigen“. Nutzen Sie „Analysieren → Messen“, um die quantifizierten Daten zu erhalten, und speichern Sie anschließend die Ergebnisse.

Diese Basis-Mikro-CT-Bilder wurden in vivo fünf Minuten nach der Injektion fibrinzielgerichteter Gold-Nanopartikel eine Stunde nach embolischem Schlaganfall bei Mäusen aufgenommen. Der zerebrale Thrombus ist im Bereich der Bifurkation der Arteria cerebri media und Arteria cerebri anterior der distalen Arteria carotis interna deutlich sichtbar. Nachfolgende Mikro-CT-Bilder zeigen keine Veränderungen des Thrombus im Circulus arteriosus bei den mit Kochsalzlösung behandelten Tieren, während bei den mit Gewebeplasminogenaktivator behandelten Tieren eine allmähliche Auflösung des Thrombus im Circulus arteriosus im Zeitverlauf beobachtet wird, wie durch die blauen Pfeilspitzen angezeigt.

Es besteht eine starke Korrelation zwischen der in-vivo-CT-Dichte und der ex-vivo-Nahinfrarot-Bildgebung für residuale thromboembolische Ablagerungen nach 24 Stunden. Beispielsweise entsprechen sich in diesen Bildern die hyperdichten Mikro-CT-Bereiche, die durch fibrinzielgerichtete Goldpartikel sichtbar gemacht wurden, direkt den durch den gerinnungsfaktor-13A-vermittelten, fibrinvernetzungsaktiven, fluoreszierenden Sonden nachgewiesenen Nahinfrarot-Signalbereichen, die während des Reifungsprozesses des vorformierten Gerinnsels an das Thrombusgebiet binden. Darüber hinaus zeigt die Visualisierung in diesen Aufnahmen, dass die TTC-Färbung zur Beurteilung der Auswirkungen einer Thrombolyse bei ischämischem Hirnschaden im Vergleich von Kontrolltieren, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden, mit Tieren, die mit Gewebeplasminogenaktivator behandelt wurden, herangezogen werden kann.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann die in-vivo-Mikro-CT-Bildgebung und die ex-vivo-Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebung von Thromben innerhalb von etwa einer Stunde durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird und die Bildgebungsproben verfügbar sind. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, nicht aggregierte und fibrinzielgerichtete Gold-Nanopartikel für die mikro-CT-basierte direkte zerebrale Thrombusbildgebung zu verwenden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Elektronenmikroskopie oder die ICP-MS, also die massenspektrometrische Analyse mit induktiv gekoppeltem Plasma, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Gewebeverteilung und Blutkinetik von Gold-Nanopartikeln zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet des Schlaganfalls oder der kardiovaskulären Forschung den Weg, um Thromboembolien in tierischen Modellen zu untersuchen, die an koronarer Thrombose oder embolischer zerebraler Infarktion litten. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fluoreszenzmarkierte Gerinnsel für thromboembolische Schlaganfälle bei Mäusen herstellt, sowie serielle Bildgebung und Quantifizierung zerebraler Thromboembolien in vivo und anschließend ex vivo durchführt, um so die Entwicklung des Thrombus zu überwachen.