Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode für ein schnelles, automatisiertes Hochdurchsatz-Screening von pflanzlichen Protoplasten zu entwickeln, um speziell den derzeitigen Engpass beim frühen Screening einer großen Anzahl von Genom-Editing- und Gen-Silencing-Zielen zu beheben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Pflanzenbiotechnologie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine automatisierte Hochdurchsatzproduktion und -transformation von Protoplasten für ein schnelles paralleles Screening der Promotorfunktion bei der Genexpression ermöglicht.

Dieses Verfahren wird unter Verwendung der weit verbreiteten hellgelben Zwei- oder BY-2-Suspensionskultur von Tabak demonstriert. Beginnen Sie mit der Züchtung einer BY-2-Kultur in einem Erlenmeyerkolben, wie im Protokolltext beschrieben. Mischen Sie die Kultur am Tag der Protoplastenisolierung gründlich, da sich die Zellen schnell absetzen, und geben Sie sechs Milliliter der Kultur in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit konischem Boden.

Lassen Sie die Zellen mindestens 10 Minuten ruhen. Das Volumen der gepackten Zellen wird auf 50 % des Gesamtvolumens eingestellt, indem das entsprechende Volumen des Überstands entfernt wird. Schütteln Sie das Röhrchen, indem Sie es umdrehen, und pipettieren Sie dann mit Pipetten mit breitem Durchgang 500 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte für den Aufschluss.

Der erste Schritt in diesem Verfahren besteht darin, alle Komponenten des Robotersystems einzuschalten, d. h. den Mikroplatten-Mover, den Liquid Handler, den Multi-Mode-Plattenleser, den Multi-Mode-Dispenser, die Plattenheizung oder den Plattenkühler und die Computer. Öffnen Sie als Nächstes die Aufgabenplanungssoftware für den Plattenbeweger, die den Mikroplatten-Mover in die anderen Geräte integriert, um den Transfer von Platten zwischen den einzelnen Geräten zu ermöglichen. Definieren Sie in der Plattenmover-Software die technischen Spezifikationen für die im Protokoll verwendeten Laborgeräte.

Klicken Sie in der Hauptsymbolleiste auf Setup und wählen Sie den Befehl Containertypen verwalten. Wählen Sie den entsprechenden Containertyp aus der Liste der vorhandenen Containertypen aus. Definieren Sie die technischen Spezifikationen für alle Laborgeräte, mit denen der Plattenbeweger konfrontiert wird.

Der nächste Schritt besteht darin, die Start- und Endpositionen für jeden Container zu definieren. Klicken Sie in einem bestimmten Protokoll auf die Registerkarte Start/Ende. Wählen Sie die Startposition jedes Behälters aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Deckel, ohne Deckel sowohl an der Start- als auch an der Endposition.

Nachdem Sie die Start- und Endpositionen für jedes Laborgerät definiert haben, legen Sie alle Platten manuell in die Ausgangsposition für den gesamten Arbeitsablauf ein. Laden Sie die 96-Well-Fluoreszenz-Screening-Platten in Hotel zwei, die Sechs-Well-Platten mit BY-2-Zellen in Hotel drei, eine 96-Deep-Well-Platte, die für die Transformation in Nest zwei des Plattenheizers oder -kühlers verwendet wird, und ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit der Enzymlösung in den Multi-Mode-Dispenser. Um die Transformation im Protokoll durchzuführen, laden Sie jede Vertiefung der 96-Deep-Well-Platte mit 10 Mikrolitern Plasma-DNA, die das orange fluoreszierende Proteinreporterkonstrukt enthält, vor und inkubieren Sie auf der Plattenheizung oder dem Kühler bei vier Grad Celsius.

Laden Sie alle Vorräte und Platten an den dafür vorgesehenen Stellen auf die automatisierte Liquid-Handling-Plattform. Laden Sie eine 96-Well-Platte, die mit 200 Mikrolitern einer 40%igen Polyethylenglykollösung pro Well in Spalte eins vorgeladen ist. Laden Sie eine Schachtel mit Pipettenspitzen in Nest acht.

Um den Standort der einzelnen Elemente in der Software für automatisierte Liquid-Handling-Plattformen zu definieren, wählen Sie Tools aus dem Menü und klicken Sie auf Labware Editor. Wählen Sie die Art des Laborgeräts aus dem Pulldown-Menü aus. Wählen Sie die Registerkarte Hauptprotokoll und klicken Sie auf Laborgeräte konfigurieren, um die Position der einzelnen Laborgeräte zu definieren.

Klicken Sie auf Ausführen, um alle Geräte zu initialisieren, die im Protokoll verwendet werden. Klicken Sie abschließend im Arbeits-Explorer-Fenster auf Arbeitseinheit hinzufügen, um alle Laborgeräte im System zu überprüfen und das automatisierte Protokoll zu starten. Der empfindlichste Teil des Verfahrens ist die Protoplastentransformation.

Da die Transformation vom Robotiksystem durchgeführt wird, ist es entscheidend, dass die automatisierten Protokolle korrekt eingerichtet sind. Für die Zwecke dieses Videos werden nur ausgewählte Schritte in den automatisierten Protokollen gezeigt. Während des Transformationsprotokolls saugt die automatisierte Liquid-Handling-Plattform 70 Mikroliter der Protoplastenlösung aus der Sechs-Well-Platte ab und dosiert sie in die 96-Deep-Well-Platte im sechsten Nest.

Anschließend werden mit neuen Pipettenspitzen 70 Mikroliter der hochviskosen Polyethylenglykollösung langsam aus der vorgeladenen Deep-Well-Platte abgesaugt und die Lösung vollständig in die entsprechenden Wells der Deep-Well-Platte dosiert. Als nächstes bewegt die automatisierte Liquid-Handling-Plattform die Deep-Well-Platte von den nächsten sechs in Nest neun, wo der Plate Mover die Platte aufnimmt und zur Plattenschüttelstation transportiert und sie 30 Sekunden lang mit 1500 U/min schüttelt. Nach einer 20-minütigen Inkubation ohne Schütteln, um die Äquilibrierung der Protoplasten zu ermöglichen, bewegt der Plate Mover die 96-Deep-Well-Platte in den Multi-Mode-Dispenser und löst das Waschprotokoll aus.

Wenn das automatisierte Protokoll zur Isolierung und Umwandlung von Protoplasten abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte mit den transformierten Protoplasten aus dem ersten Hotel des Robotersystems. Schalten Sie das inverse Mikroskop, die Kamera und die Leuchtstofflampe ein. Wählen Sie das 10X-Objektiv für die anfängliche Fokussierung auf die Protoplasten.

Schalten Sie die Halogenlampe ein und schließen Sie den Verschluss für die Leuchtstofflampe. Legen Sie die Platte auf das Mikroskopsystem und fokussieren Sie die Protoplasten mittels Hellfeld. Schalten Sie dann die Halogenlampe aus und öffnen Sie den Verschluss für die Leuchtstofflampe.

Wählen Sie das Cy3/TRITC-Filterset für die Visualisierung des orange fluoreszierenden Proteins, das von den transgenen Protoplasten exprimiert wird. Scannen Sie jede Vertiefung, um die Anzahl der Protoplasten zu bestimmen, die den Fluoreszenzmarker exprimieren. Der Enzymverdau von Protoplasten unter den in diesem Protokoll angegebenen Bedingungen führte zu 2.820.000 Protoplasten pro Sechs-Well-Platte.

Der Verlust der Protoplastenkonzentration nach jedem Transferschritt im Protokoll wurde bewertet. Nach dem Aufschlussprotokoll wurden 11.500 Protoplasten in jede Vertiefung der 96-Tiefen-Well-Platten übertragen. Nach Abschluss des Transformationsprotokolls wurden 1.230 Protoplasten auf die 96-Well-Fluoreszenz-Screening-Platte übertragen.

Um sicherzustellen, dass mehrere Pipettierschritte die Protoplasten nicht beschädigten, wurde ihre Lebensfähigkeit durch Propidiumiodid-Färbung getestet. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Viabilität nach dem Aufschluss, nach dem Transfer auf die 96-Well-Fluoreszenz-Screening-Platte und nach dem Transformationsprotokoll. Das Transformationsprotokoll war erfolgreich bei der Erzeugung transgener Zellen, die orange fluoreszierendes Protein exprimieren, obwohl die Transformationseffizienz mit nur etwa 2 % gering war. Dies ist darauf zurückzuführen, dass das verwendete große binäre Plasma verwendet wurde und das Protokoll nicht speziell für BY-2-Protoplasten optimiert wurde.

Die für den Zeitverlauf des Protokolls erhaltenen Metriken zeigten, dass der größte Zeitaufwand während der Verdauungsphase aufgewendet wird. Die gesamte Dauer der Protoplastenisolierung und -transformation betrug drei Stunden, 50 Minuten und 53 Sekunden, ohne dass ein externer Input des Bedieners erforderlich war. Einmal richtig eingerichtet, kann diese Technik vom Roboter in weniger als vier Stunden durchgeführt werden.

Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Pflanzenbiotechnologie den Weg, um genomische Verfahren mit hohem Durchsatz an Nutzpflanzen durchzuführen, wie z. B. Genome Editing und Promotor-Screening.