Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung
7. Oktober 2016
Wir beschreiben ein Protokoll zur volumetrischen Abbildung von fluoreszierenden Protein-markierten Zellen tief in intakten embryonalen und postnatalen Herzen. Durch die Verwendung von Gewebereinigungsmethoden in Kombination mit der Whole-Mount-Färbung können einzelne fluoreszierende Protein-markierte Zellen in einem embryonalen oder postnatalen Herzen klar und genau abgebildet werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, fluoreszierende, proteinmarkierte Zellen tief im Inneren intakter Herzen volumetrisch abzubilden, um die Genfunktion mit Einzelzellauflösung während der kardialen Entwicklung und in postnatalen Herzen zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen während der kardialen Entwicklung zu beantworten, wie z. B. die Untersuchung der Genfunktionen und die Unterstützung der Abbildung in Einzelzellauflösung während der Herzentwicklung und bei tierischen Artefakten. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie relativ einfach, kostengünstig und kostengünstig ist, da eine spezielle zeitliche Analyse der Gen- und Proteinfunktionen mit Einzelzellauflösung in intakten Embryonen oder Herzen durchgeführt werden kann.
Obwohl wir dieses System verwenden, um die Herzentwicklung bei Mäusen zu untersuchen, können Sie es auch zur Untersuchung anderer Organsysteme wie Muskeln, Gehirn und Lunge und auch in anderen Modellorganismen verwenden. Hier werden fluoreszierende proteinpositive Embryonen von Tamoxifren-behandelten R-26 Cre-RET2-Konfetti-Muttertieren verwendet. Beginnen Sie mit der Färbung, indem Sie jeden Paraformaldehyd-fixierten Embryo in einen Milliliter mit 0,1 % PBST in die Vertiefungen einer 48-Well-Platte tauchen.
Zwei Stunden lang auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur inkubieren, um das Gewebe zu permeabilisieren. Ersetzen Sie dann die Permeabilisierungslösung durch einen ml Blockierungspuffer und inkubieren Sie sie unter Schütteln zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie als Nächstes eine Verdünnung des endothelzellspezifischen Antikörpers PECAM von 1 bis 100 in 0,3 Millilitern Blockierungspuffer für jede Vertiefung vor und geben Sie diesen in die Vertiefungen, die die Embryonen enthalten.
48 Stunden lang unter Schütteln bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Embryonen nach der Inkubation fünfmal fünfmal für jeweils 30 Minuten mit PBST, um überschüssige Primärantikörper aus dem Gewebe zu entfernen. Tauchen Sie anschließend die Embryonen in Alexa Fluor 647 Ziegen-Antivat-Sekundärantikörperlösung und inkubieren Sie unter Schütteln 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius, während Sie vor Licht geschützt sind.
48 Stunden später, nach dem Auswaschen zuvor, die Embryonen eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln mit 4%PFA postfixieren. Nachdem Sie die Embryonen zweimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS gewaschen haben, inkubieren Sie sie zehn Minuten lang mit DAPI-Kernfleck. Anschließend zwei PBS-Waschungen von jeweils fünf Minuten durchführen, dann mit der Gewebereinigung fortfahren.
Die Gewebereinigung ist der wichtigste Schritt in diesem Protokoll, um das Herz mit einer Einzelzellauflösung abzubilden. Auch die Wahl der Clearing-Methode, entweder Scale oder CUBIC, ist sehr wichtig, um die Fluoreszenzsignale im intakten embryonalen Herzen zu erhalten. Übertragen Sie die gewaschenen, gefärbten Embryonen in ein in Aluminiumfolie eingewickeltes Szintillationsfläschchen, das einen Milliliter A2-Lösung enthält.
Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius mit gelegentlichem leichtem Schütteln von Hand für 48 Stunden. Nach der Inkubation mit Skala A2 die Lösung in der Durchstechflasche durch einen Milliliter Lösung der Skala B4 ersetzen und weitere 48 Stunden bei vier Grad Celsius unter gelegentlichem leichtem Schütteln inkubieren. Inkubieren Sie die Embryonen für weitere 48 Stunden mit einem Milliliter Skala 70 bei vier Grad Celsius und gelegentlichem leichtem Schütteln wie zuvor.
Tauchen Sie zum Schluss die waagenfreie Probe in einen Milliliter 90 % Glycerin und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei vier Grad Celsius. Um Bilder zu machen, übertragen Sie die Probe in eine Petrischale mit Glasboden mit einer minimalen Menge von 90 % Glycerin und nehmen Sie ein Bild mit einem konfokalen Mikroskop auf, das mit zwei Photonenfunktionen ausgestattet ist. Tauchen Sie für die CUBIC-Clearung jeden Embryo in einen Milliliter CUBIC one und schütteln Sie ihn gelegentlich 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Nach 48 Stunden wird die Lösung durch das gleiche Volumen frisches CUBIC-Reagenz ersetzt und die Probe weitere 48 Stunden wie zuvor inkubiert. Waschen Sie nach der Inkubation die mit CUBIC one behandelten Embryonen mehrmals mit PBS unter leichtem Schütteln von Hand, um die überschüssige CUBIC one Lösung zu entfernen. Tauchen Sie die Embryonen dann 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in die CUBIC two-Lösung und schütteln Sie sie gelegentlich sanft mit der Hand.
Wenn es vor der Bildgebung zu einer Verzögerung kommt, inkubieren Sie die Proben nacheinander mit einem Milliliter 30 %50 % und 70 % Glycerin und PBS für jeweils 30 Minuten. Nach dem Durchlaufen der Serie in 90%ige Glycerinlösung zur Lagerung bei vier Grad Celsius umfüllen. Wenn Sie fertig sind, wie zuvor in einer Petrischale mit Glasboden mit 90 % Glycerin abbilden.
Dieser Film zeigt optische Schnitte eines mit Schuppen behandelten Herzens E 8,75, von der Herzoberfläche bis zum Lumen. Gelb markiert die PECAM-Expression und alle Kardiomyozyten erscheinen grün. Die Tiefe beträgt 110,4 Mikrometer und es gibt insgesamt 93 Scheiben.
Dies ist das eben gezeigte 3D-Oberflächenbild des rekonstruierten Herzens. Auch hier markiert Gelb die PECAM-Expression und Grün alle Kardiomyozyten. Dieser Film zeigt Schnitte eines einzelnen Vorläuferklons aus einem schuppenbehandelten E 9,5-Herz in der Region des Ausflusstrakts.
Gelb markiert den PECAM-Ausdruck und der Klon wird grün angezeigt. Die Tiefe beträgt 36 Mikrometer und es gibt insgesamt 10 Scheiben. Dieser Film zeigt Schnitte eines CUBIC-behandelten P two Herzstücks von der Oberfläche bis zum Lumen.
Die Tiefe beträgt 130 Mikrometer mit drei Mikrometern pro Abschnitt. Dieser Film zeigt Schnitte eines mit CUBIC behandelten E 17,5 Herzens von der Oberfläche bis zum Lumen. Die Tiefe beträgt 630 Mikrometer mit sechs Mikrometern pro Abschnitt.
Dabei handelt es sich um ein eben gezeigtes 3D-Oberflächenbild des Herzens, das mit der 3D-Rekonstruktionssoftware rekonstruiert wurde. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Embryo zerbrechlich ist und die Herzpathologie leicht gestört werden kann. Nach diesem Verfahren können andere Proteine realisiert werden, wobei die Genfunktion durch Färbung nach der Ostierung und Schäumung untersucht wird.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur volumetrischen Abbildung von Zellen mit fluoreszierenden Proteinen in intakten embryonalen und postnatalen Herzen vor. Die Methode kombiniert Gewebesichtmachungstechniken mit der Färbung ganzer Präparate, um eine klare Abbildung mit Einzelzellauflösung zu ermöglichen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Herzentwicklung
- Fluoreszenzbildgebung
- Genfunktionsanalyse
Hintergrund
- Das Verständnis der Genfunktionen während der Herzentwicklung ist entscheidend.
- Mithilfe der Einzelzell-Auflösungsbildgebung ist eine detaillierte Analyse möglich.
- Die Methode ist auf verschiedene Organsysteme und Modellorganismen anwendbar.
- Die Markierung mit fluoreszierenden Proteinen verbessert die Visualisierung spezifischer Zellen.
Zweck der Studie
- Um die Genfunktion in Herzzellen auf Einzelzellauflösung zu untersuchen.
- Um Entwicklungsprozesse in embryonalen und postnatalen Herzen zu erforschen.
- Um eine vergleichsweise einfache und kosteneffiziente Bildgebungsmethode bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Verwendung von Gewebeklärmethoden.
- Ganzpräparat-Färbung von fluoreszierenden Proteinen markierter Zellen.
- Bildgebung von Parafolmaldhyd-fixierten Embryonen.
- Anwendung der Methode auf verschiedene Organsysteme jenseits des Herzens.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Abbildung von fluoreszenzmarkierten Zellen in intakten Herzen.
- Klare Visualisierung der Genfunktionen während der Herzentwicklung.
- Beleg der Vielseitigkeit der Methode über verschiedene Organsysteme hinweg.
- Entwicklung eines zugänglichen und effizienten Protokolls.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Herzentwicklung auf zellulärer Ebene.
- Es kann für die Anwendung in anderen biologischen Systemen angepasst werden.
- Diese Methode vertieft das Verständnis der Genfunktionen in der Entwicklung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Bildgebung von transparent gemachten embryonalen und postnatalen Herzen mit Einzelzellauflösung ermöglicht eine detaillierte Untersuchung des Verhaltens und der Differenzierung kardialer Vorläuferzellen während der Entwicklung. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung, indem er die zellulären und molekularen Mechanismen aufklärt, die der normalen und abnormalen Herzmorphogenese zugrunde liegen. Die Methode liefert eine vorhersagbare Zuverlässigkeit in präklinischen Modellen, indem sie die Genfunktion mit strukturellen Ergebnissen im intakten Gewebe verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung klonaler Dynamiken in sich entwickelndem Herzmuskelgewebe.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Beobachtung des Beitrags von Vorläuferzellen zu Herzmuskelstrukturen.
- Prädiktiver Wert: Steigert das Vertrauen in die Zielstrukturauswahl, indem genetische Störungen mit phänotypischen Ergebnissen auf Einzelzellauflösung verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening vor, indem fluoreszierende Signale nach der Klärung erhalten bleiben.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch reproduzierbare Gewebeklärungs- und Ganzpräparat-Färbeprotokolle.
- Skalierbarkeit: Erleichtert die Wiederverwendung der Plattform über embryonale und postnatale Entwicklungsstadien hinweg mittels stadiengerechter Klärmethoden (ScaLe für embryonale, CUBIC für postnatale Stadien).
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckung und präklinische Validierung, indem sie eine konsistente Abbildung der Genfunktion über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg ermöglicht.
- Mechanistische Entwederung: Ermöglicht die Aufklärung der zellulären Grundlagen angeborener Herzfehler durch klonale Analyse in intakten Herzen.
- Krankheitsrelevante Systematik: Bietet ein physiologisch reichhaltiges Modell zur Untersuchung der kardialen Morphogenese im Kontext der menschlichen Entwicklung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Hypothesenprüfung des Zielmoleküls über die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten bis hin zur präklinischen Validierung, indem sie quantitative, räumlich aufgelöste Nachweise der Genfunktion im intakten Herzgewebe ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Visualisierung der klonalen Expansion und Differenzierung während der Herzentwicklung.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Klär- und Färbeprotokolle, die Epitop- und fluoreszierende Proteinsignale erhalten.
- Analytik: Erzeugt quantitative 3D-Bilddaten, die den Vergleich der klonalen Verteilung, Größe und Lokalisation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem sie die longitudinale Beurteilung kardialer struktureller Phänotypen ermöglicht, die mit genetischen Störungen verknüpft sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungskapazität, die auf verschiedene Organsysteme (Herz, Gehirn, Lunge, Muskel) und Modellorganismen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unklarheiten in kardialen Entwicklungsprozessen reduziert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch definierte Klär- und Färbeprotokolle, die mit konfokaler und Zwei-Photonen-Bildgebung kompatibel sind.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem direkte visuelle Nachweise zur Zielstrukturnbindung und zu phänotypischen Konsequenzen im intakten Gewebe bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung, indem frühe Entwicklungsphänotypen mit potenziellen Mechanismen angeborener Defekte verknüpft werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Markierung mit fluoreszierenden Proteinen, der Ganzpräparat-Immunfärbung und Gewebe-Durchsichtigmachungstechniken.
- Hängt von dem Zugang zu konfokalen oder Zwei-Photonen-Mikroskopiesystemen ab, die zur Tiefengewebebildgebung fähig sind.
- Erfordert die Standardisierung der Wahl der Durchsichtigmachungsmethode (ScaLe vs. CUBIC) entsprechend dem Entwicklungsstadium, um die Gewebeintegrität und das Signal zu bewahren.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung des Protokolls auf andere Organsysteme aufgrund von Unterschieden in der Gewebedichte und der Toleranz gegenüber der Durchsichtigmachung.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Zerbrechlichkeit des Gewebes während der Handhabung und das potenzielle Risiko einer Störung der Pathologie, falls die Durchsichtigmachung nicht auf das Entwicklungsstadium abgestimmt ist.
