Name: Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Lernen Sie eine volumetrische Bildgebungsmethode für embryonale und postnatale Herzen bei Einzelzell-Auflösung. Dieses Protokoll kombiniert Gewebe-Clearing mit Ganzmontage-Färbung fluorescenzmarkierter Zellen zur Untersuchung der Genfunktion.

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Wir danken den Mitgliedern des MW-Labors für die wissenschaftliche Diskussion. Diese Arbeit wird unterstützt durch AHA [13SDG16920099] für M.W. und durch Zuschüsse des National Heart, Lung, and Blood Institute [R01HL121700] für M.W. Die Bilder wurden in der Imaging Core Facility am Albany Medical College aufgenommen.

Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) at Albany Medical College und ausgeführt zugelassen nach dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Lösung Vorbereitungen HINWEIS: Die Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, &amp; alpha; MHC-Cre 17 und Rosa26-mTmG (mTmG) 20 Mauslinien wurden im Handel erworben cTnT-Cre 18 ein Geschenk von Dr. Jiao an der Universität von Alabama war NFATc1-Cre.. war 19 am Albert Einstein College of Medicine ein Geschenk von Dr. Bin Zhou. Mäuse wurden für mindestens 60 Sekunden durch Kohlendioxidinhalation in einer geschlossenen Kammer euthanasiert gefolgt durch physikalische Mittel Todes Überprüfung durch bilaterale Thorakotomie, Enthauptung oder zervikale Dislokation. <ol><li> Bereiten Sie Tamoxifen. Man löst 10 mg Tamoxifen in 10 ml Sonnenblumenkerne oil. Sobald es vollständig gelöst ist, aliquotieren und bei -20 ° C. </li><li> Bereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Auflösen Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) und KCl (0,20129 g) in 1 l destilliertem Wasser und Einstellen des pH - Werts auf 7,4. </li><li> Bereiten PBST: 0,1% Tween-20-Lösung in PBS durch Auflösen von 100 &amp; mgr; l Tween-20 in 100 ml PBS. </li><li> Bereiten Sie Puffer blockiert. Machen 3% Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungslösung durch Lösen von 3 g BSA in 100 ml PBST, enthaltend 0,2% Tween-20. </li><li> Bereiten Sie CUBIC-1 (Reagenz 1). Mischungs 25 wt% Harnstoff, 25 Gew% N, N, N &#39;, N&#39;-Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin und 15 Gew% Triton X-100 in dH 2 O. </li><li> Bereiten Sie CUBIC-2 (Reagenz 2). Mischungs 50 Gew% Saccharose, 25 Gew% Harnstoff, 10 Gew% 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;- Nitrilotriethanol und 0,1% (v / v) Triton X-100 in dH 2 O. </li><li> Bereiten Sca le A2: 4 M Harnstoff, 10% w / v Glycerin und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,7. </li><li> Bereiten Sca le B4: 8 M Harnstoff und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,7. </li><li> Bereiten Sca le 70: 4 M Harnstoff, 70% w / v Glycerin und 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. </li></ol> 2. Tamoxifen Induktion, Embryo Isolierung und Fixierung <ol><li> Tamoxifen Induktion und Embryo Isolation <ol><li> Mit Hilfe eines gekrümmten Ernährungsschlauch genehmigten Protokoll (ACUP 13-12007), Schlundsonde die weiblichen R26Cre ERT2 Confetti Mäuse (gesteckt von R26Cre ERT2 männliche Mäuse) mit 10 ug / g Tamoxifen an embryonalen Entwicklungs Tag E7.75 33. Bei embryonalen Tag 9,5 (E9.5) oder E10,5, einschläfern die weibliche Mäuse mit CO 2 und Genickbruch. </li><li> Nach Überprüfung der Maus Tod, öffnen Sie die Maus Bauchhöhle mit einer Schere (Abschnitt 1 Hinweis sehen) und das Uterushorn sezieren aus, die Eileiter Schichten mit Hilfe von Schere und Pinzette entfernen und wiederleasen die Embryonen aus dem Eileiter 23,24. <ol><li> Transfer der Embryonen auf eine Petrischale mit PBS (pH 7,4). Unter dem Binokular, entfernen Sie die nicht-embryonale Schichten (Chorion, Dottersack und Amnion) mit Hilfe einer Pinzette entfernen. </li></ol></li><li> Mit einer Pinzette und Schere, sammeln die weibliche Maus und Embryo Schwanz Proben für die Genotypisierung wie zuvor 22 berichtet. Mit Hilfe einer Plastikpipette, übertragen jeden Embryo in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 1 ml 1x PBS. </li><li> Unter einem Fluoreszenzmikroskop, identifizieren die GFP / RFP / GFP positive Embryonen über ein inverses Mikroskop mit einer Kamera. Schälen Sie die Herzbeutel mit einer Pinzette entfernt und drehen Sie das Herz / Embryo mit Hilfe von gebogenen Pinzette, um die Anzahl von fluoreszierenden Klone auf beiden Seiten des Herzens mit den GFP / RFP / CFP Filter zu bestimmen. Keine Schnitte erforderlich sind. </li></ol></li><li> GFP / RFP / GFP positive Embryonen Nach der Identifizierung, schnell die Embryonen waschen zweimal (je 2 min) mit 1x PBS in the 48 Well-Platte auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur (RT). Dies wird überschüssiges Blut zu entfernen. </li><li> Befestigen Sie den Embryo / embryonale Herz mit 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT. Die Fixierungszeit ist abhängig von der embryonalen Alter und Gewebegröße. Für E9.5 fixieren den Embryo für 2 h bei RT. Die späten embryonalen Stadium Embryonen erfordern längere Fixierungszeit, die sogar bis 24 Stunden für die postnatale Herz verlängert werden kann. ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig, sollte der Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhäute. </li><li> Nach der Fixierung, waschen Sie den Embryo / Herz in der 48-Well-Platte zweimal (jeweils 10 Minuten) mit 1x PBS auf einem Plattenschüttler bei RT. Dies entfernt die überschüssige PFA aus dem Embryo / Herz. Die Embryonen werden dann weiter verarbeitet für ganze Berg Färbung und Gewebe Lichtung. </li></ol> 3. Ganze Berge Färbung HINWEIS: Nach dem PFA Fixierung der Embryo / Herz ganze Berg-Färbung wird wie folgt. <ol><li> Permeabilisierung den Embryo / Herz in einer 48-Well-Platte mit 1 ml von 0,1% PBST für 2 Stunden auf Plattenschüttler bei RT. </li><li> Nach Permeabilisierung, tauchen Sie den Embryo / Herz in 1 ml Blockierungspuffer, für 2 Stunden oder über Nacht auf einem Plattenschüttler bei 4 ºC. </li><li> Tauchen Sie den Embryo / Herz in die Endothelzellen-spezifischen Antikörper PECAM (CD31), verdünnt (1: 100) in 0,3 ml Puffer für 48 Stunden auf einem Plattenschüttler bei 4 ° C blockiert. </li><li> Waschen Sie den Embryo / Herz mit PBST 5-mal, jeweils 30 min bei RT auf einem Plattenschüttler. Dies entfernt den Überschuß unspezifische gebundenen primären Antikörpers aus dem Gewebe. </li><li> Tauchen Sie den Embryo / Herz in Alexa Fluor 647 Ziege anti-Ratte-Sekundär-Antikörper, verdünnt (1: 1000) in 1 ml Puffer für 48 Stunden auf einem Plattenschüttler bei 4 ° C blockiert. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.4 den sekundären Antikörper zu waschen. </li><li> Post-fix den Embryo / Herz mit 4% PFA für 1 h bei RT auf einem Plattenschüttler und waschen zweimal mit PBS jeweils 5 Minuten. </li><li> Stain den Embryo / Herz mit der Kernfärbung 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (verdünnt in PBST bei einer concentVerhältnis von 0,01 mg / ml) für 10 min auf Plattenschüttler bei RT. Folgen Sie mit zwei PBS Waschungen von jeweils 5 Minuten. </li></ol> 4. Embryo / Herz Clearing mit Sca l e oder CUBIC - Methode HINWEIS: Nach der ganze Berg Färbung der Embryo / Herz entweder auf die Sca le oder CUBIC Gewebe Clearing - Verfahren unterzogen wird. Die Wahl des Verfahrens hängt von der Gewebegröße und embryonalen Alter. Für E11,5 oder früheren Alter Embryonen, l e Gewebe Clearing- Verfahren Verwendung Sca, während für ältere Embryonen oder postnatale Herzen der CUBIC Gewebe Clearing- Verfahren wird bevorzugt. <ol><li> Scale-Tissue Clearing-Methode <ol><li> Inkubieren Sie den Embryo / Herz mit 1 ml Sca l e A2 - Lösung in einem Szintillationsphiole (eingewickelt in Alufolie) mit gelegentlichen sanften (von Hand) für 48 Stunden bei 4 ° C schütteln. </li><li> L e A2 Inkubation Nach Sca, Inkubation des Embryos / Herz mit 1 ml Sca l e B4 Lösung bei 4 ° C in der gleichen Fläschchen mit gelegentlichen sanften für anot Schüttelnsie 48 Stunden. </li><li> Inkubieren Sie den Embryo / Herz für weitere 48 Stunden mit 1 ml Sca l e 70 bei 4 ° C mit gelegentlichen leichtem Schütteln. Berg Embryo 90% Glycerin (siehe Abschnitt 5.1). </li></ol></li><li> CUBIC Tissue Clearing-Methode <ol><li> Für ganze Embryo / Herz CUBIC Lichtung, tauchen jeden Embryo / Herz in 1 ml CUBIC-1 mit gelegentlichen leichtem Schütteln für 48 Stunden bei 37 ºC 7. Nach 48 Stunden, um die Lösung mit dem gleichen Volumen an frischem CUBIC Reagenz 1, zu ersetzen und die Probe für weitere 48 Stunden bei 37 ° C mit gelegentlichem Schütteln mit der Hand inkubiert. </li><li> Waschen Sie die CUBIC-1 behandelt Herz / Embryo mit 1x PBS mehrmals bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit der Hand. Dies entfernt die überschüssige CUBIC-1-Lösung. </li><li> Nach CUBIC-1 mit PBS ausgewaschen, tauchen die Embryonen / Herzen in CUBIC-2-Lösung (1 g pro Embryo / Herz) für 48 Stunden bei 37 ° C mit gelegentlichen sanft mit der Hand schütteln. Dies folgt Embryo / Herz Montage Glycerin (siehe Abschnitt 50,2). </li></ol></li></ol> 5. Proben Montage und Imaging HINWEIS: Die geräumten Embryonen oder Organe in Sca l e 70 oder CUBIC-2 - Lösung kann mit Skala 70 und CUBIC-2 - Lösung als Abbildungsmedium direkt abgebildet werden, beziehungsweise. Betrachtet man jedoch die Anfälligkeit der embryonalen Proben Clearing Reagenzien, wenn die Proben nicht unmittelbar abgebildet werden, sondern langfristige, speichern Sie die Proben in 90% Glycerin nach dem Protokoll unten gespeichert. <ol><li> Direkt die Sca le in 1 ml 90% Glycerin und lagern bei 4 ° C bis zur Bildgebung gelöscht Probe tauchen. </li><li> Waschen Sie die CUBIC behandelte Probe mit 1x PBS zweimal, jeweils 5 min und Inkubation sequentiell die Probe mit 1 ml 30%, 50%, 70% und 90% Glycerin-Lösung jeweils für 30 min. </li><li> Zur Bebilderung, Transfer der Probe auf Glasboden Petrischale mit einer minimalen Menge von 90% Glycerin und Bild Klone mit einem konfokalen Mikroskop mit zwei Photonen-Fähigkeiten ausgestattet. </li><li> Bild das Herz oder Embryo im Glycerin mit einer 10X / 0.3 NA, ein 25X / 0,8 NA Tauch-, oder ein 40X / 1.2 NA Wasser Korrekturobjektivlinse. Bild DAPI unter Verwendung von 2-Photonen-Anregung von einer kohärenten Titan: Saphir-Laser-Chamäleon. Die Wahl des Mikroskops und die Objektivlinse von dem Zweck der Experimente abhängen wird, beispielsweise für Superauflösung, ein Lichtbogen Fluoreszenzmikroskop verwendet werden könnten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Der Embryo Isolation ist ein sehr wichtiger Schritt. E9.5 Embryonen sind sehr zerbrechlich und klein, so besonders darauf geachtet werden, sollten nicht die Embryo / Herzstrukturen während der Isolierung nicht zu beschädigen. Die nicht-embryonale zusätzliche Schichten des Embryos / Herz umhüllt sollte sorgfältig besonders entfernt werden, wenn die gesamte Embryo-Bildgebung. Auf diese Weise können Antikörper und Clearing-Mischung Eindringen tief in den embryonalen Geweben und hilft auch das Hintergrundsignal bei der Entf...

Cardiac Morphogenese ist eine sequenzielle Ereignis, das die räumlich - zeitliche Organisation von vier verschiedenen Arten von Herzvorläuferzellen in verschiedene Sektoren des Herzens erforderlich ist , und erfordert auch mehrere Genregulationsnetzwerken diesen Prozess zu dirigieren die funktionelle Herz 1,2 zu bilden. Cardiac Spezifikation, Differenzierung, Strukturierung und Kammer Reifung werden von kardiogenem Transkriptionsfaktoren 3 geregelt. Genetische Mutation oder posttranskriptionalen Aberration dieser Faktoren in Herzvorläuferzellen in entweder embryonale Letalität oder angeborene Herzfehler (CHD) 4 führen könnte. Die Studie von Herzmorphogenese erfordert ein Verständnis der inhärenten strukturellen Details in drei Dimensionen (3D) und einzelne Linie Herzvorläufer markierte Zelle während der Herzentwicklung verfolgt wird das Verständnis der Herzmorphogenese fördern. Eine Reihe von hochauflösenden Abschnitt basierte Tomographieverfahren wurden in th entwickelte vergangenen Jahrzehnten zu Bild Organstruktur 5,6; Allerdings erfordern diese Verfahren teuer, spezialisierte Instrumente, umfangreiche Arbeit, und es fehlt ihnen detaillierte strukturelle Organisation auf Einzelzellauflösung in das endgültige Volumen rekonstruiert Bild 7,8. 3D volumetrischen Bildgebung auf Einzelzellebene stellt ein Mittel Vorläuferzelldifferenzierung und Zellverhalten in vivo 7 zu untersuchen. Allerdings bleibt Gewebe Lichtstreuung das primäre Hindernis Zellen und Strukturen in 3D tief im Inneren des intakten Herzens Bildgebung. Lipide sind eine Hauptquelle der Lichtstreuung, und die Entfernung von Lipiden und / oder Einstellung des Brechungsindexunterschied zwischen Lipiden und deren Umgebung sind mögliche Ansätze zur Erhöhung der Gewebetransparenz 8. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Gewebeclearingverfahren entwickelt, das Gewebe Opazität und Lichtstreuung zu reduzieren, wie BABB (Benzylalkohol und Benzyl benzoate-Gemisch) und DBE (Tetrahydrofuran und Dibenzylether); aber bei diesen Verfahren, Fluoreszenzlöschung bleibt ein Problem 8-10. Die Lösungsmittelbasis hydrophile Methoden, wie SeeDB (Fructose / Thioglycerin) und 3DISCO (Dichlormethan / Dibenzylether), erhalten Fluoreszenzsignale, aber machen nicht das ganze Organ transparent 7,8,11. Im Vergleich dazu macht die CLARITY Gewebe-Clearing - Verfahren der Organ transparent, aber es erfordert eine spezialisierte Elektrophoreseautomat Lipide zu entfernen 8,12, ebenso wie PACT (passive Klarheit Technik), die auch Hydrogel 7,13 Einbettung erfordert. Detaillierte Informationen zu allen verfügbaren Gewebe-Clearing - Verfahren, siehe Tabelle 1 in Richardson und Lichtman et al. 7. Im Jahr 2011 Hama et al. Serendipitously eine hydrophile Mischung &#39;Sca le&#39; (Harnstoff, Glycerin und Triton X-100 - Gemisch) entdeckt , das macht das Gehirn der Maus und Embryo durchsichent während vollständig fluoreszierende Signale von markierten Klone 14 zu erhalten. Dies ermöglicht die Abbildung des intakten Gehirn in einer Tiefe von mehreren Millimetern und großen Rekonstruktion von neuronalen Populationen und Vorsprünge an einer subzellulären Auflösung. Susaki et al. weiter verbessert Sca le von Aminoalkoholen und entwickelte die &quot;CUBIC&quot; ( eine klare, uneingeschränkte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) Gewebe Clearing - Verfahren, das Phospholipid Solubilisierung reduziert Klärzeit erhöht und erlaubt für den Mehrfarbenfluoreszenzabbildung 8 hinzugefügt wird . In der vorliegenden Studie, die Vorteile der le Sca nehmen und CUBIC Gewebe Clearing Techniken und hochauflösende 3D - optischen Schneidens, einzelne Klone innerhalb des Herzens während der Herzentwicklung wurden unter Verwendung von Rosa26Cre ERT2 verfolgt 15, R26R-Confetti 16, &amp; alpha; MHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong&gt; NFATc1-Cre 19 und Rosa26-mTmG (mTmG) 20 Mauslinien. Die Kombination der whole mount - Färbung (WMS) Verfahren weiterhin für die Färbung von anderen Proteinen in markierten Klone und für die Untersuchung ihres Verhaltens in einem 3D - Volumen Kontext erlaubt zuvor 21,22 mit Gewebe Verrechnungsverfahren entwickelt. Die Kombination von Gewebe Clearing- und WMS ermöglicht ein besseres Verständnis der Rolle der verschiedenen Gene und Proteine ​​während der Herzentwicklung und der Ätiologie von angeborenen Herzfehlern. Dieses Protokoll kann angewandt werden, um andere Vorläuferzelldifferenzierung, Zellverhalten zu untersuchen und organ Morphogenese Ereignisse während der Entwicklung.

<table><tbody><tr><td>2,2&Primzahl;,2&Primzahl; '-Nitrilotriethanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd in PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP16000</tr><tr><td>N,N,N',N'-Terkis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Sonnenblumenöl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>550274</tr><tr><td>Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Nuklearfärbung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37oC Inkubator</td><td>Thermowissenschaftlicher Fischer</td><td>Heratherm, kompakte mikrobiologische Inkubatoren</td><td></td></tr><tr><td>48-Well-Platten</td><td>Zellbehandlungs</td>- <td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 Konfokalmikroskop</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 Glasperlensterilisator</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Lichtquelle</td><td></td><td>SCHOTT ACE I</td><td></td></tr><tr><td>Paar</td><td>Scheren Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 60 mm x15 mm&nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Wippe II&nbsp; Plattformwippe</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Szintillierende Röhrchen</td><td>Fischer Scientific &nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging gelöscht embryonale und postnatale hearts bei einzelzell-auflösung

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Einzel klonalen Verfolgung und Analyse auf Vollherzhöhe kann Herzvorläuferzellverhalten und Differenzierung während der Herzentwicklung, bestimmen und für die Untersuchung der zellulären und molekularen Grundlagen von normalen und abnormalen Herzmorphogenese ermöglichen. Neue aufkommende Technologien der retrospektiven Einzel klonalen Analysen machen die Untersuchung von Herz-Morphogenese auf Einzelzellauflösung möglich. Allerdings Gewebe Opazität und Lichtstreuung des Herzens als Abbildungstiefe von ganzem Herzen Bildgebung auf Einzelzellauflösung hinder erhöht. Um diese Hindernisse zu überwinden, eine ganze Embryo Clearing-System, das das Herz hoch transparent für beide Beleuchtung und Detektion machen können, müssen entwickelt werden. Zum Glück, in den letzten Jahren, viele Methoden für die ganze Organismus Clearingsystemen wie CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, kubisch, DBE, BABB und PACT berichtet. Dieses Labor ist daran interessiert, die zellulären und molekularen Mechanismen der KarteIAC Morphogenese. Vor kurzem haben wir einzelne Zelllinie über die ERT2 ROSA26-Cre Tracing; ROSA26-Confetti System zu dünn Label - Zellen während der Herzentwicklung. Wir passten mehrere ganze Embryo-Clearing - Methoden einschließlich Sca le und CUBIC (klar, ungehinderte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) mit whole mount Färbung Bild einzelne Klone im Inneren des Herzens , den Embryo in Kombination zu löschen. Das Herz wurde erfolgreich auf Einzelzell Auflösung abgebildet. Wir fanden , dass Sca le die embryonale Herz beseitigen können, aber die postnatale Herz nicht effektiv beseitigen können, während CUBIC die postnatale Herz beseitigen können, sondern schädigt die embryonale Herz durch das Gewebe auflöst. Die hier beschriebenen Methoden wird die Untersuchung der Genfunktion in einem einzigen Klon Auflösung während kardialen Morphogenese ermöglichen, was seinerseits die zellulären und molekularen Basis angeborener Herzfehler aufdecken kann.

Abbilden der gelöscht embryonale Herz Wirbelherzbildung ist ein räumlich - zeitlich geregelt morphogenic Prozess und hängt von der Organisation und Differenzierung von Vorläuferzellen aus vier verschiedenen Quellen 1. Zellen aus dem ersten Herzfeld des Herz Mondsichel wird in Richtung der ventralen Mittellinie falten, um eine lineare Herzrohr zu bilden. Die Zellen aus dem zweiten Herzfeld zunächst dorsomedial zum er...

Wir beschreiben ein Protokoll zur volumetrischen Abbildung von fluoreszierenden Protein-markierten Zellen tief in intakten embryonalen und postnatalen Herzen. Durch die Verwendung von Gewebereinigungsmethoden in Kombination mit der Whole-Mount-Färbung können einzelne fluoreszierende Protein-markierte Zellen in einem embryonalen oder postnatalen Herzen klar und genau abgebildet werden.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszierend markierte Zellen volumetrisch tief im Inneren intakter Herzen abzubilden, um die Genfunktion während der Herzentwicklung und in postnatalen Herzen auf Einzelzellauflösung zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen während der Herzentwicklung zu beantworten, beispielsweise durch die Untersuchung von Genfunktionen und die Unterstützung der Bildgebung auf Einzelzellauflösung während der Herzentwicklung sowie bei tierischen Artefakten. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie vergleichsweise einfach, kostengünstig und vorteilhaft dahingehend ist, eine spezielle zeitliche Analyse der Gen- und Proteinfunktionen auf Einzelzellauflösung in intakten Embryonen oder Herzen durchzuführen.Obwohl wir dieses System verwenden, um die Herzentwicklung bei Mäusen zu untersuchen, kann es auch zur Untersuchung anderer Organsysteme wie Muskulatur, Gehirn und Lunge sowie bei anderen Modellorganismen eingesetzt werden. Hier werden fluoreszierendes Protein-positiven Embryonen von mit Tamoxifen behandelten R-26 Cre-RET2 Confetti-Dams verwendet. Beginnen Sie die Färbung, indem Sie jeden mit Paraformaldehyd fix

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Mutationen, die zu angeborenen Herzfehlern führen, profitieren von der in vivo Untersuchung der Herzstruktur während der Entwicklung, aber hochauflösende Strukturstudien im embryonalen Herzen der Maus sind technisch anspruchsvoll. In dieser Arbeit stellen wir eine robuste Immunfluoreszenz- und Bildanalysemethode vor, um Kardiomyozyten-spezifische Strukturen im sich entwickelnden Mausherz zu beurteilen.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

Wir präsentieren ein Protokoll für die Analyse der Herzkranzgefäße in ganzen embryonalen Maus-Herzen bis E15.5, durch optische Clearance und der konfokalen Mikroskopie, gefolgt von immunologischen Standard Färbemethoden verwendet wird. Diese Technik ermöglicht die Darstellung von Blutgefäßen während des gesamten Herzens ohne die Notwendigkeit für zeitaufwendige Analyse von Serienschnitten.

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Um die Zellteilung von Zellzyklusvariationen in Kardiomyozyten zu unterscheiden, präsentieren wir Protokolle mit zwei transgenen Mauslinien: Myh6-H2B-mCh-transgene Mäuse, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und CAG-eGFP-Anillin-Mäuse, zur Unterscheidung der Zellteilung von Zellzyklusvariationen.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Hier beschreiben wir ein Protokoll für ganze Berg Immunfluoreszenz und Image-basierten quantitativen volumetrische Analyse der frühen Stadium Mausembryonen. Wir präsentieren diese Technik als ein leistungsfähiger Ansatz qualitativ und quantitativ kardialen Strukturen während der Entwicklung zu bewerten, und schlagen vor, dass es möglicherweise sehr anpassungsfähig an andere Organsysteme.

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Technik kombiniert mit optischen Ausgleich der murine Herz zu studieren.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Die Proliferation von Cardiomyozyten nach einer Verletzung ist ein dynamischer Prozess, der eine Symphonie extrazellulärer Hinweise aus Nicht-Myozyten-Zellpopulationen erfordert. Mit Lineage-Tracing, passiven CLARITY und dreidimensionalen konfokalen Mikroskopie-Techniken mit ganzer Montage können wir den Einfluss einer Vielzahl von Zelltypen auf die Herzreparatur und -regeneration analysieren.

Erfassung der Herzverletzungsreaktion von gezielten Zellpopulationen über cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Wir berichten über eine Methode zur mesoskopischen Rekonstruktion des gesamten Mausherzens durch die Kombination neuer Fortschritte in der Gewebetransformation und Färbung mit der Entwicklung eines axial gescannten Lichtblattmikroskops.

Mesoskopische optische Bildgebung des ganzen Mausherzens

Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Embryokultur und Bildgebung von Mäusen vor, das eine 3D + Zeit-Bildgebung von kardialen Vorläuferzellen ermöglicht. Dieses Video-Toolkit befasst sich mit den Schlüsselqualifikationen, die für eine erfolgreiche Live-Bildgebung erforderlich sind, die sonst nur schwer von reinen Textpublikationen zu erwerben sind.

Live-Bildgebung früher kardialer Vorläuferzellen im Mausembryo

Das Protokoll nutzt fortschrittliche Lichtblattmikroskopie zusammen mit angepassten Gewebereinigungsmethoden, um komplizierte kardiale Strukturen in Nagetierherzen zu untersuchen, was ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Dieses Protokoll stellt eine schnelle Methode für die quantitative dreidimensionale Gefäßbildgebung mit Hilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie vor. Die Wirksamkeit der Methode wird anhand des pharyngealen Bogenarteriensystems des Hühnerembryomodells demonstriert, wobei die hämodynamischen Kräfte mittels Computational Fluid Dynamics quantifiziert werden.

Schnelle hochauflösende Bildgebung des Gefäßsystems von Kleintieren für quantitative Studien

Lernen Sie eine volumetrische Bildgebungsmethode für embryonale und postnatale Herzen bei Einzelzell-Auflösung. Dieses Protokoll kombiniert Gewebe-Clearing mit Ganzmontage-Färbung fluorescenzmarkierter Zellen zur Untersuchung der Genfunktion.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

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