Name: Imaging Calcium in Drosophila Bei Eiaktivierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Calciumdynamiken während der Eiaktivierung in Drosophila melanogaster mit hochauflösender Bildgebung visualisieren. Diese ex-vivo-Methode ermöglicht die Untersuchung von Kalziumwellen und deren Rolle in der Entwicklungsbiologie.

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Wir sind dankbar, dass Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya für die Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts; Mariana Wolfner für Diskussionen über die Ei-Aktivierung; Matt Wayland für die Bildgebung zu unterstützen; und Nan Hu für die allgemeine Unterstützung im Labor. Diese Arbeit wurde von der University of Cambridge, ISSF TTW [Gewährungsnummer 097814] unterstützt.

Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. 1. Vorbereitung für Dissection Hinweis: Die beschriebenen Schritte sind hier in Übereinstimmung mit E. Gavis, Princeton University &amp; Weil et. al. 18. Führen Sie die folgenden Schritte zwei Tage vor Bildgebung. <ol><li> Nehmen Sie eine Fliege Fläschchen ca. 10 ml feste Nahrung enthält, und eine kleine Menge von Trockenhefe zu einer Ecke hinzufügen, weniger als 1 g ausreichend ist. Hinweis: Weitere Informationen über das Fliegenflaschen oder Nahrung siehe &quot;Drosophila Wartung&quot; 19. </li><li> Merken 1 - 3 Tropfen Wasser, um die Hefe zu hydratisieren. </li><li> Stellen Sie das Fläschchen beiseite zu einem Winkel von 45 ° und ermöglichen 3-5 min für die Hefe, das Wasser aufzunehmen. </li><li> Während die Hefe das Wasser absorbiert, wählen Sie eine Flasche von Fliegen UASt- myr GCaMP5 20 angetrieben durch wannen VP16GAL4 (bezeichnet als GCaMP5) zum Ausdruck , die vor kurzem entstanden sind (ein myristoyumgerechnet Form wurde der GCaMP5 durch Anbinden der GECI an die Membran in dem Ei) ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu schaffen, gewählt. </li><li> Betäuben die Fliegen in der Flasche mit CO 2 -Gas. Achten Sie darauf, die Flasche umgedreht zu halten, um nicht Fliegen im Nassfutter zu verlieren. </li><li> Zünglein an der narkotisierten Fliegen auf einen CO 2 Pad und sortieren 10 bis 15 Frauen und 5 Männer mit einem Pinsel unter einem Binokular mit. Hinweis: Es ist Standard-Männchen sind gesunde Frauen für die Präparation zur Verfügung zu stellen. </li><li> Wenn das Fläschchen aus Schritt 1.3 bereit ist, fügen Sie in das Fläschchen die ausgewählten Fliegen. Achten Sie darauf, das Fläschchen horizontal zu halten, bis die Fliegen aktiv. </li><li> Legen Sie das Fläschchen bei 25 ° C für ca. 36 Std. </li><li> Lege die restlichen Fliegen aus dem CO 2 - Pad auf der Flasche oder zu verwerfen. </li></ol> 2. Präparieren Drosophila Ovarien Anmerkung: Die beschriebenen Schritte sind hier gemäß Weil et. al. <sbis&gt; 18. <ol><li> Nach 36 h, mit CO 2 , die Fliegen aus dem yeasted Fläschchen betäuben. </li><li> Sobald die Fliegen in der Phiole narkotisiert werden , um sie auf das Kissen CO 2 Spitze mit einem Pinsel unter einem Binokular sortiert werden. </li><li> Wählen Sie eine Frau. </li><li> Isolieren Sie die beiden Ovarien vom Weibchen. Für detaillierte und vollständige Protokoll siehe Weil et. al. 18. Zusammenfassend: <ol><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen mit Sauerstoff angereichert Halocarbonöl (Serie 95) auf einem Nr 1.5, 22 x 40 mm Deckglas. </li><li> Fassen Sie die Frau mit einer Pinzette an der vorderen des Bauches. </li><li> das Weibchen unter dem Binokular halten, um den zweiten Satz von Zangen verwenden, um sanft den hinteren Teil des weiblichen entfernen. </li><li> Wischen Sie das hintere Gewebe aus der zweiten Zange ab. </li><li> Druck auf den Bauch Hohlraum mit dem zweiten Zange von der anterioren zum posterioren des Bauches. Die beiden undurchsichtigen Ovarien sollte die Zange halten, wenn sie außerhalb der FEMAle. </li><li> Tippen Sie auf die Ovarien in das Öl. </li><li> Entfernen Sie alle Gewebe aus der Zange durch die Zange Abwischen. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte (2.4.1 - 2.4.7) drei Deck zu erhalten, mit je Ovarien von einer Fliege. </li></ol></li></ol> 3. Isolierkanne Einzelne Ältere Eier <ol><li> Unter einem Standard-Binokular mit der Vergrößerung 4X gesetzt, auf dem ersten Deckglas aus Schritt 2.4, trennen die beiden Ovarien durch die Eileiter reißen. </li><li> Führen Sie ein Paar geschlossene Zange in die Mitte eines einzigen Ovar, dabei keine Eikammern zu durchstechen. </li><li> Legen Sie eine Standard-Sezieren Sonde in die Mitte des Ovar neben der geschlossenen Zange. </li><li> Vorsichtig ziehen Sie das Sezieren Sonde durch den Ovarien in Richtung des hinteren Pol, wo die reifen Eier (Stufe 14 Eikammern) angeordnet sind. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,4 2 bis 5 mal je nach Größe des Eierstocks und der Anzahl der Eier. Anmerkung: Die Zugabe von CO 2 </sub&gt; verursacht typischerweise die Abscheidung eines einzigen Ei, das größer mit erhöhten Rückenanhänge als vorher entnommenes Eier erscheinen. Dieses Ei ist für die Bildgebung verworfen werden, da sie bereits in dem weiblichen aktiviert wurde. Hinweis: Ältere Eier sind wahrscheinlich leicht von ovarian Bindegewebe zu trennen. </li><li> Wenn keine reifen Eizellen außerhalb des Ovars sichtbar sind, weiterhin vorsichtig mit dem Sezieren Sonde necken. </li><li> Sobald die reifen Eier auf dem Deckglas außerhalb des Ovars sichtbar sind, manövrieren 3 bis 5 in einer Linie in der Mitte des Deckglases. Hinweis: Die besten Ergebnisse erzielen, die Sonde sanft an der Seite der Eier laufen. Hinweis: Vermeiden Sie auf die Rückenanhänge ziehen, da dies das Ei beschädigen können. Hinweis: Abhängig von der künftigen Abbildungsaufbau, richten Sie die Eier etwa 200 &amp; mgr; m Abstand senkrecht zur Deck für maximale Abbildungsbereich. </li><li> Einmal ausgerichtet, entfernen Sie den Rest des Ovargewebe indem sie sie weg von den ausgerichteten Eier Ziehen der f mitorceps. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Öl von der Ecke eines medizinischen wischen Abtupfen. Achten Sie darauf, nicht die reifen Eier zu berühren mit der medizinischen wischen als reife Eier, die verloren werden, sind in Kontakt gebracht. </li><li> Zeichnen Sie ein Fadenkreuz auf dem Deckglas mit einem Marker unter dem Mikroskop Auffinden der Probe zu vereinfachen. </li><li> Legen Sie das Deckglas an einem sicheren Ort und lassen Sie die vorbereiteten Eikammern auf dem Deckglas für 5 ruhen - 10 min. Dies ermöglicht das Ei im Öl zu begleichen. Die Proben können bis zu 1 h nach Präparation verwendet werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,11 für den Rest der Deckgläser mit Ovarien auf ihnen. </li></ol> 4. Vorbereitung für Imaging <ol><li> Bringen bereit Aktivierungspuffer 15 auf Raumtemperatur. Hinweis: Der Aktivierungspuffer ist ein hypotonischen Puffer: 3,3 mM NaH 2 PO 4, 16,6 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% Polyethylenglykol 8000, 2 mM CaCl 2, auf pH 6,4 mit einer 1: 5-Verhältnis von NaOH: KOH.Für weitere Informationen siehe Mahowald 1983 15. Aliquots Aktivierungspuffer kann über Monate bei -20 ° C gelagert werden und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. </li><li> Transport sorgfältig vorbereitete Deck, Aktivierungspuffer und Glaspipetten auf die Abbildungsmöglichkeiten. Hinweis: Ein Weitfeld, konfokale kann sich drehende Scheibe oder Lichtblatt-Mikroskop verwendet werden. Wir empfehlen ein umgekehrtes Mikroskop. Unsere repräsentative Ergebnisse wurden mit einem konfokalen Mikroskop erhalten. </li><li> Ein Ziel für die gesamte reife Eizelle Bildgebung sollte (20x 0,7 NA hier) gewählt werden. </li><li> Montieren Sie die erste vorbereitete Deckglas auf den Mikroskoptisch. Achten Sie darauf, nicht die Deckgläser auf der Bühne zu brechen. </li><li> Qualitativ wählen ein Sichtfeld mit einer reifen Eizelle Kammer zur Aktivierung. Nicht Bild durchstochen Eikammern oder solche mit blebbing in der Membran. Hinweis: Für die Schritte 4,6-4,7, Software-Befehle in Abhängigkeit von Mikroskop und Hersteller unterschiedlich. </li><li> Set Imaging paraMeter für Standard-GFP-Anregung (488 nm) und Emission (500-580 nm). Auch eine Hellfeld-Ansicht, um die reife Eizelle und verdrängte Öl zu visualisieren und zu orientieren einzurichten. </li><li> Wählen Sie den niedrigsten Z-Ebene, wo reife Eier sind sichtbar und stellen einen vollen Z-Stapel werden für 40 &amp; mgr; m bei etwa 2 &amp; mgr; m pro Schritt getan. Stellen Sie die Parameter so gibt es keine Verzögerung zwischen den Z-Stack-Übernahme ist. Stellen Sie die Zeitreihen für ca. 30 min zu erfassen. </li></ol> 5. Imaging Ex Vivo Eiaktivierung <ol><li> Starten der Bildaufnahme. </li><li> Warten Sie mit 1 - 2 Badezimmer mit Z-Stapel erworben werden. Dies zeigt die reife Eizelle vor der Aktivierung. </li><li> Ziehen Sie etwa 300 ul Aktivierungspuffer in einer Glaspipette. </li><li> Positionierung der Spitze der Glaspipette enthält Aktivierungspuffer bei einem Winkel von 45 ° über dem Deckglas, bewegen sich langsam die Pipette in den Strahlengang, bis er direkt über die reife Eizelle ist abgebildet wird. Die Glaspipette solltesein, 1 bis 2 cm über dem Öl. </li><li> Hinzufügen von 1 bis 2 Tropfen Aktivierungspuffer in weniger als 5 Sekunden von der Glaspipette. Dies sollte das Öl verdrängen. Vermeiden Zugabe von überschüssigem Aktivierungspuffer oder berühren Sie das Ei mit der Glaspipette, wie es Verschiebung des reifen Eizelle verursachen kann. Achten Sie darauf, nicht das Deckglas mit der Pipette zu berühren, da dies eine Änderung in der Brennebene oder Luftblasen verursachen können im Tauchöl zwischen Objektiv und Deckglas zu bilden. </li><li> Während das Hinzufügen Aktivierungspuffer während der Bildaufnahme, überprüfen Sie das Hellfeld-Kanal, um sicherzustellen, dass das Öl durch den Aktivierungspuffer verschoben wurde. Anmerkung: Dieser wird zunächst als Schatten erscheinen aufgrund der Pipette den Strahlengang zu brechen, sondern auch in dem Auftreten von kleinen Öltröpfchen führen. Einige Öltröpfchen können mit dem reifen Ei verbunden bleiben, die experimentellen Ergebnisse und die Bildqualität beeinflussen. </li><li> Wenn das Öl nicht aus der anfänglichen Zugabe von Aktivierungspuffer Wiederholung verschoben Schritte 5,4-50,6. </li><li> Sobald das Öl erfolgreich verschoben wird, damit die Serie der Zeit bis zum Abschluss zu führen. Hinweis: Aufgrund bei Aktivierung von Eizellen zu Schwellungen, einige Eikammern der Fokusebene oder Feld dramatisch aus Sicht bei der Zugabe von Aktivierungspuffer bewegen wird. In dieser Situation, die Übernahme zu stoppen und die nächste Deck montieren. </li><li> Nachdem die Bildfolgeerfassung abgeschlossen ist, speichern Daten. </li></ol> 6. Nach der Akquisition Bildverarbeitung <ol><li> Öffnen Sie den Datensatz mit Fidschi (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) oder eine gleichwertige Bildverarbeitungssoftware, und wählen Sie die entsprechenden Dateien für die Analyse. </li><li> Um eine Projektion der erfassten Daten bauen wählen: Bild&gt; Stacks&gt; Z-Projekt. </li><li> Wählen Sie eine Start Z-Scheibe und einen Anschlag Z-Scheibe, in der Regel den ganzen Abschnitt. Wählen Sie eine Projektionstyp, in der Regel auf &quot;Max Intensity&quot;. Überprüfen Sie Kontrollkästchen &quot;All Time Frames&quot;, um die gewählten Einstellungen für die gesamte Serie zu übernehmen. </li><li> Obmehr als ein fluoreszierendes Kanal abgebildet worden ist, die Kanäle Tool Bewegung zwischen den Farben zu ermöglichen, einen Verbund zu machen, oder das Bild Graustufen zu machen. Wählen Sie Bild&gt; Farben&gt; Kanäle Werkzeug. </li><li> Um die Bildhelligkeit ein und wählen Sie den Bildkontrast&gt; Anpassen&gt; Helligkeit / Kontrast. </li><li> Um ein einzelnes Bild exportieren, bewegen Zeitplan Regler nach relevanten Rahmen und wählen Sie Datei&gt; Speichern unter&gt; JPEG oder in einem bevorzugten Format. </li><li> Wählen Sie einen Ort und Titel für die exportierte Datei, dann speichern. Hinweis: Die Bildrate von der Imaging-Software wird benötigt, mit einem Zeitstempel auf dem Bild zu geben. </li><li> Um die Zeitreihe als Film exportieren wählen: Datei&gt; Speichern unter&gt; AVI, dann Frame-Rate wählen (~ 7 Bilder pro Sekunde). </li><li> Wählen Sie einen Ort und Titel für die exportierte Datei, dann speichern. </li><li> Um die eingestellte Datei in Fidschi-Format, wählen Sie Datei&gt; Speichern. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der erste kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Isolierung der reifen Eizellen ohne Beschädigung. Dies kann durch sanftes Manövrieren der Eier mit der Präpariersonde erreicht werden. Die Übung wird es ermöglichen, diese Manipulation ohne Beschädigung der Eier durchzuführen. Ein zweiter entscheidender Schritt besteht darin, den Verlust der Probe zu vermeiden, wenn Aktivierungspuffer auf das reife Ei in Öl aufgetragen wird. Das Auftragen des Aktivierungspuffers sollte langsam und ohne Kontakt mit dem Deckglas erfolgen. Dieser Schritt kann eine Herausforderung darstellen, wenn die Mikroskopeinrichtung keinen einfachen Zugang zur Probe ermöglicht. Es ist ratsam, bewegliche axilläre Teile des Mikroskops, wie z. B. einen Temperaturinkubator, zu verschieben. 
Modifikationen an diesem Protokoll können vorgenommen werden, um andere fluoreszenzmarkierte Faktoren anstelle von Ca2+ bei der Eiaktivierung sichtbar zu machen. Allgemeiner gesagt, könnten verschiedene Stadien der Drosophila-Entwicklung oder die Ergebnisse der Zugabe eines anderen Puffers mit diesem Protokoll analysiert werden. 
Eine Fehlerbehebung kann erforderlich sein, wenn die Einstellungen am Mikroskop nicht optimal sind, um das Signal der Probe sichtbar zu machen. Dies kann durch Erhöhen oder Verringern der Laserleistung, Ändern des Erfassungsbereichs und Anpassen der Z-Stack-Parameter erreicht werden. Ein weiteres Problem könnten sein, dass sich Eier nach der Zugabe von Aktivierungspuffer ständig aus dem Sichtfeld bewegen. Wenn dies regelmäßig passiert, lassen Sie die reifen Eier für einen längeren Zeitraum, 15 bis 20 Minuten, auf den Deckgläsern liegen. Beachten Sie, dass die Verwendung eines Öls mit höherer Viskosität die Verdrängung des Öls durch Aktivierungspuffer verändert. 
Diese hier vorgestellte Technik ist begrenzt durch den Arbeitsabstand des Objektivs, die Dehydrierung der reifen Eizellen und die Möglichkeit, die reifen Eizellen ohne Beschädigung zu sezieren. Im Vergleich zu in vivo bildgebenden Verfahren, bei denen die reife Eizelle die erwachsene Frau durchläuft und abgelegt wird 13, ermöglicht unsere Methode jedoch eine höhere räumliche Auflösung, die Möglichkeit, die reife Eizelle vor der Aktivierung physisch zu manipulieren und die Rolle der Eizellaktivierung ohne Befruchtung zu testen. 
Es gibt viele potenzielle zukünftige Anwendungen dieser Technik, einschließlich des Testens von Reporterkonstrukten auf zelluläre Komponenten bei der Eiaktivierung und der Visualisierung der Ca2+ -Welle in mutierten Hintergründen 14,24. Zusammen mit experimentellen und genetischen Werkzeugen ermöglicht der hier vorgestellte ex vivo Ei-Aktivierungs-Assay die Untersuchung des Auslösers, der Ausbreitung und der nachgeschalteten Effekte der universell konservierten Ca2+ -Welle.

Eine Änderung der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration in Ei (Eizelle) Aktivierung ist ein konserviertes Bestandteil aller untersuchten Organismen 1,2. Dieses Ereignis löst eine breite Palette von Ca 2+ -abhängigen Prozessen des Zellzyklus und Übersetzung von gespeicherten mRNAs einschließlich Wiederaufnahme. Aufgrund dieser Anforderung für Ca 2+, hat die vorübergehende Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationen Visualisierung gewesen Zentrum des Interesses. Historisch wurden Modellorganismen für Studien über Eiaktivierung ausgewählt basierend auf der Größe und Verfügbarkeit ihrer Eier. Verschiedene Visualisierungs Ansätze wurden verwendet , um folgen und zu quantifizieren Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationen in diesen Systemen, einschließlich: das Photoprotein Aequorin in Medaka - Fisch 3; Ca 2+ empfindliche fluoreszierende Farbstoffe wie Fura-2 in Seeigel und Hamster 4,5; und Calcium - Grün-1-Dextran in Xenopus 6. Die Erzeugung und Verbesserung von genetisch kodierte Kalzium - Indikatoren (GeCIS) hat die Fähigkeit , Ca zu visualisieren umgewandelt 2+ Dynamik in vivo 7. Diese genetischen Konstrukte werden in spezifischen Geweben und begrenzen die Notwendigkeit für invasive Gewebezubereitungen 8 ausgedrückt. GCaMPs sind ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) -basierten Klasse von GeCIS , die aufgrund ihrer hohen Affinität Ca 2+ sehr effektiv gewesen sind, Signal-zu-Rausch - Verhältnis und die Kapazität zu 9-11 angepasst werden. In Gegenwart von Ca 2+ erfährt der GCaMP Komplex eine Reihe von Konformationsänderungen, wobei der Ca 2+ Bindung an Calmodulin ausgehend , dass die Ergebnisse in einer erhöhten Fluoreszenzintensität der GFP - Komponente 9. GCaMPs wurden in der Forschung über Drosophila Neuronen zu visualisieren Änderungen in intrazellulärem Calcium 12 extensiv verwendet. Die jüngsten applicatiauf der GCaMP Technologie Ca 2+ in reifen Drosophila Eier zu visualisieren hat einen einzigen transienten Ca 2+ Welle bei Eiaktivierung 13,14 enthüllt. Die Ca 2+ Welle kann während des Eisprungs in vivo 13 oder bei höherer Vergrößerung unter Verwendung eines ex vivo - Aktivierungs - Assay 13,14 bei geringer Vergrößerung sichtbar gemacht werden. In dem ex vivo Assay werden Einzel reifen Eizellen aus den Ovarien isoliert und aktiviert , um eine hypotonische Lösung, bezeichnet als Aktivierungspuffer, der die Ereignisse in vivo Aktivierung 15-17 zu rekapitulieren gezeigt wurde. Diese Ex - vivo - Test ermöglicht eine einfache hochauflösende Visualisierung der Ca 2+ Welle unter verschiedenen experimentellen Bedingungen einschließlich pharmakologische Unterbrechung, physikalische Manipulationen und genetische Mutanten. Dieser Artikel zeigt die Herstellung von reifen Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung und the nachfolgende Mikroskopie die Ca 2+ Welle mit GCaMP zur Visualisierung verwendet. Dieser Ansatz kann verwendet werden , um die Initiierung und Kontrolle der Ca 2+ Welle zu testen und nachgelagerten Ergebnisse zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Trockenhefe</td><td>Fleischman' s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Verschiedenes funktioniert</td></tr><tr><td>Lampe</td><td>Mircotec Faseroptik</td><td>MF0-90</td><td>Verschiedenes funktioniert</td></tr><tr><td>Medizinische Tücher</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marker</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen universal, schwarz - in den meisten stationären Geschäften erhältlich. Superfeine Breite 0,4 mm</td></tr><tr><td>CO2 Polster</td><td>&nbsp; Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas Nr. 1.5, 22 x 50 mm</td><td>International- Nr. 1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Halogenkohlenwasserstofföl, Serie 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Vertrieb in Europa:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Öl 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Kann anstelle von Halogenkohlenwasserstofföl verwendet werden, Serie 95</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Obwohl diese Werkzeuge sauber sein sollten, ist die Verwendung eines Autoklaven nicht erforderlich, Ethanol wäre ausreichend.</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Glaspipette</td><td>Fisherbrand,</td> <td>FB50251</td><td>Pasteurpipetten, Glas, unplugged, 150 mm Länge&nbsp;</td></tr><tr><td>Fläschchen</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

imaging calcium in<em&gt; drosophila</em&gt; bei eiaktivierung

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Die Aktivierung der Eizelle ist ein universeller Prozess, der eine Reihe von Ereignissen umfasst, die es der befruchteten Eizelle ermöglichen, die Meiose abzuschließen und die Embryonalentwicklung zu initiieren. Ein Aspekt der Eiaktivierung, der bei allen untersuchten Organismen konserviert ist, ist eine Veränderung der intrazellulären Konzentration von Kalzium (Ca2+), die oft als "Ca2+-Welle" bezeichnet wird. Während die Geschwindigkeit und Anzahl der Schwingungen derCa2+-Welle von Spezies zu Spezies variiert, ist die Veränderung des intrazellulären Ca2+-Signals der Schlüssel zum Auslösen wesentlicher Ereignisse für die Embryonalentwicklung. Zu diesen Veränderungen gehören die Wiederaufnahme des Zellzyklus, die mRNA-Regulation, die Exozytose der kortikalen Granula und die Neuanordnung des Zytoskeletts.
Im reifen Drosophila-Ei findet die Aktivierung im weiblichen Eileiter vor der Befruchtung statt und löst eine Reihe von Ca2+-abhängigen Ereignissen aus. Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung der Ca2+-Welle in Drosophila vor. Dieser Ansatz bietet ein manipulierbares Modellsystem, um den Mechanismus der Ca2+-Welle und die damit verbundenen nachgelagerten Veränderungen zu untersuchen.

Hier haben wir gezeigt , wie reif Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung vorzubereiten. Eier Exprimieren eines GECI ermöglichen Abbildung von Ca 2+ Dynamik bei Ei - Aktivierung und den Beginn der Embryonalentwicklung (Abbildung 1). Es sollte , daß auf der GCaMP je bemerkt werden , verwendet, und zwar das Vorhandensein einer Myristoylgruppe, Ergebnisse haben kann leichte qualitative Unterschiede 13 14. Wir haben auch eine Rolle für die funktionelle Aktin während Ei Aktivierung durch die Zugabe eines Inhibitors der Aktin - Polymerisation nachgewiesen, Cytochalasin D, auf den Aktivierungspuffer (Abbildung 2) 14. Eine Voraussetzung für das Zytoskelett bei Eiaktivierung konserviert. In C. elegans, nach der Befruchtung werden Zytoskelett - Komponenten neu organisiert 21,22 die Ein-Zellen Embryo zum ersten asymmetrischen Teilung vorzubereiten. In Seeigel, Störung der cytoskeletal Umorganisation nach Aktivierung wurde durch Verhindern kontraktilen Ringbildung 23 in den Zellzyklus zu beeinflussen , gezeigt. Die Rolle von Aktin in vermittelnde bleibt ein Ca 2+ Welle und ihrem stromabwärtigen Funktion bei Eiaktivierung in Drosophila vollständig aufgeklärt werden. In Drosophila, Co-Visualisierung der Ca 2+ Wellen- und Aktin - Zytoskelett können mit dieser ex vivo - Aktivierungs - Assay erreicht werden. Zeitreihen von mehreren Kanälen kann der intrazellulären Ca erworben und Dynamik werden 2+ kann mit Änderungen in Actin - Organisation in der Eizelle (Abbildung 3) angepasst werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Abb . 1: A Single Ca 2+ Welle von Drosophila Eiaktivierung Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 nach dem einddition der Aktivierungspuffer (AH). Der Anstieg der cytoplasmatischen Ca 2+ entsteht am hinteren Pol (B) und pflanzt (BF) mit einer mittleren Geschwindigkeit von ungefähr 1,5 &amp; mgr; m / sec. Initiierung der Welle wird in der Regel innerhalb von 3 min von der Zugabe von Aktivierungspuffer beobachtet. Nach der Aktivierung liefert die intrazellulären Calciumspiegel des reifen Eizelle Voraktivierung Ebenen (G, H). Siehe ergänzende Film 1 (Gesamtzeit 33 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Zugabe von Cytochalasin D zu Activation Buffer stört Ca2+ Wellenausbreitung. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei UASt- myrGCaMP5 exprimierenden Puffer nach Zugabe von Aktivierungs 10 ug / ml Cytochalasin D Endkonzentration (AH) enthält. Während der Ca 2+ Welle am hinteren Pol (A) eingeleitet wird, beeinträchtigt wird , und erreicht nicht die anteriore des Eies (F) (weiße Pfeilspitzen bezeichnen die Vorderseite der Welle). Keine weiteren Änderungen Ca 2+ wurden über 30 min beobachtet). Siehe ergänzende Film 2 (Gesamtzeit 30 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die gleichzeitige Visualisierung von Actin und Ca 2+ bei Egg Aktivierung in Drosophila. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 (Cyan) und UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) nach Zugabe von Aktivierungspuffer (AH). Die Ca 2+ Welle von dem hinteren Pol initiiert und stellt , wie in Fig . 1 erscheint Actin im Laufe der Zeit zu ändern, weiße Pfeilspitzen (A vs H). Der Mangel an Ca 2+ Signaldetektion in der Mitte des reifen Eizelle ist auf die Bewegung der Probe während der Bildaufnahme durch. Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Dieser Artikel beschreibt ein anpassungs ex vivo - Protokoll zur Visualisierung von Ca 2+ während Eiaktivierung in Drosophila.

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Kalzium während der Eiaktivierung in Drosophila melanogaster sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise nach der Quelle, den Dynamiken und den nachgeschalteten Funktionen von Kalzium bei der Eiaktivierung. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen in der Möglichkeit einer höheren räumlichen Auflösung, der physikalischen Manipulation des reifen Eies vor der Aktivierung sowie der Untersuchung der Rolle der Eiaktivierung unabhängig von der Befruchtung.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, die reifen Eier schonend zu isolieren, und den Aktivierungspuffer auf das reife Ei aufzutragen, ohne die Probe zu verlieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, stellen Sie die Vergrößerung des Stereomikroskops auf 4X ein. Auf dem ersten Deckglas trennen Sie die beiden Ovarien, indem Sie mit einer geschlossenen Pinzette und einer Präpariernadel den Eileiter einreißen, wobei darauf geachtet werden muss, keine Eikammern zu durchstechen.Als Nächstes führen Sie eine Standard-Präpariernadel in die Mitte des Ovars ein, neben die geschlossene Pinzette. Ziehen Sie die Präpariernadel vorsichtig durch das Ovar in Richtung der hinteren Pole, wo sich die reifen Eier befinden. Sobald die reifen Eier außerhalb des Ovars auf dem Deckglas sichtbar sind, positionieren Sie drei bis fünf davon in einer Linie in der Mitte.Entfernen Sie anschließend den restlichen Eierstockgewebe, indem Sie ihn von den ausgerichteten Eiern wegzogen. Danach entfernen Sie überschüssiges Öl, indem Sie es mit der Ecke eines medizinischen Wischtuchs abtupfen. Zeichnen Sie mit einem Stift ein Fadenkreuz auf die Deckglasoberfläche, um die Probe unter dem Mikroskop zu lokalisieren.Danach die vorbereiteten Eikammern auf der Deckglasunterlage fünf bis zehn Minuten ruhen lassen, damit sich die Eier im Öl absetzen können. Die vorbereiteten Deckgläser, Aktivierungspuffer bei Raumtemperatur und Glaspipetten zur Bildgebungseinrichtung bringen. Ein Objektiv auswählen, das geeignet ist, um das gesamte reife Ei abzubilden.Danach montieren Sie die erste vorbereitete Deckglasprobe auf die Mikroskopbühne. Wählen Sie als Nächstes ein Sichtfeld einer reifen Eikammer zur Aktivierung aus. Stellen Sie die Bildaufnahmeparameter für die Standardanregung und -emission von GFP ein.Danach richten Sie eine Hellfeldansicht ein, um das reife Ei und das verdrängte Öl sichtbar zu machen und zu orientieren. Wählen Sie nun die niedrigste Z-Ebene aus, in der die reifen Eier sichtbar sind, und legen Sie einen vollständigen Z-Stack über 40 Mikrometer mit einer Schrittweite von zwei Mikrometern fest.Danach die Zeitschleife so einstellen, dass die Bilder 30 Minuten lang aufgenommen werden. In diesem Verfahren zunächst die Bildaufnahme starten und ein bis zwei vollständige Z-Stapel aufnehmen, um das reife Ei vor der Aktivierung darzustellen. Anschließend etwa 300 Mikroliter Aktivierungspuffer in eine Glaspipette aufziehen.Platzieren Sie die Spitze der Glaspipette, die Aktivierungspuffer enthält, in einem Winkel von 45 Grad über der Deckglasoberfläche, und bewegen Sie die Pipette langsam in den Strahlengang, bis sie sich direkt über dem beobachteten reifen Ei befindet. Geben Sie ein bis zwei Tropfen Aktivierungspuffer innerhalb von weniger als fünf Sekunden zu, um das Öl zu verdrängen. Das Hinzufügen von ein bis zwei Tropfen Aktivierungspuffer muss unter dem richtigen Winkel, vorsichtig und schnell erfolgen.Während des Hinzufügens des Aktivierungs-Puffers während der Bildaufnahme überprüfen Sie den Hellfeldkanal, um sicherzustellen, dass das Öl verdrängt wurde. Sobald das Öl erfolgreich verdrängt ist, lassen Sie die Zeitreihe bis zum Abschluss laufen. Um eine Projektion der erfassten Daten zu erstellen, wählen Sie eine Start-Z-Schicht und eine Stopp-Z-Schicht für den gesamten Bereich aus.Wählen Sie anschließend einen Projektionstyp, zum Beispiel maximale Intensität. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen Alle Zeitpunkte, um die ausgewählten Einstellungen auf die gesamte Serie anzuwenden. Um Helligkeit und Kontrast des Bildes anzupassen, wählen Sie Bild, dann Anpassen und anschließend Helligkeit/Kontrast.Um die Zeitreihe als Film zu exportieren, wählen Sie Datei, dann Speichern unter und anschließend AVI. Danach wählen Sie die Bildrate. Gezeigt ist hier die Zeitreihe eines ex vivo gereiften Drosophila-Eis, das einen genetisch kodierten Kalziumindikator exprimiert, nach Zugabe von Aktivierungspuffer.Der Anstieg des zytoplasmatischen Kalziums beginnt am hinteren Pol und breitet sich dann mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von etwa 1,5 Mikrometern pro Sekunde aus. Das Einsetzen der Welle wird typischerweise innerhalb von drei Minuten nach Zugabe des Aktivierungspuffers beobachtet. Nach der Aktivierung normalisieren sich die intrazellulären Kalziumspiegel des reifen Eies wieder. Bei Drosophila kann die gleichzeitige Visualisierung der Kalziumwelle und des Aktin-Zytoskeletts mithilfe dieses ex vivo-Aktivierungsassays erreicht werden. Das Aktin verändert sich über die Zeit, wie durch die weißen Pfeilspitzen angezeigt. Das Fehlen eines Kalziumsignals in der Mitte des reifen Eies beruht auf einer Bewegung der Probe während der Bildaufnahme.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann das gesamte Verfahren bei korrekter Durchführung in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen, wenn man die Eikammern bewegt und wenn man die Parameter für die Aufnahme einstellt. Dieses Verfahren kann angepasst werden, um andere fluoreszenzmarkierte Proteine, Organellen oder Kalziumindikatoren bei der Eiaktivierung sichtbar zu machen.Dies kann helfen, Fragen bezüglich der Quelle des Kalziums und der downstream-Effekte zu klären.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

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Imaging Calcium in

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