Imaging Calcium in Drosophila Bei Eiaktivierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Kalzium während der Eiaktivierung in Drosophila melanogaster sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. was die Quelle, Dynamik und nachgeschaltete Rolle von Kalzium bei der Aktivierung der Eizelle ist. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, eine höhere räumliche Auflösung zu ermöglichen, die reife Eizelle vor der Aktivierung physisch zu manipulieren und die Rolle der Eiaktivierung ohne Befruchtung zu testen.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, die reifen Eizellen ohne Beschädigung zu isolieren und Aktivierungspuffer auf die reife Eizelle aufzutragen, ohne die Probe zu verlieren. Um diesen Vorgang zu starten, stellen Sie die Vergrößerung des Präpariermikroskops auf 4X ein. Trennen Sie auf dem ersten Deckglas die beiden Eierstöcke, indem Sie den Eileiter mit einer geschlossenen Pinzette und einer Präpariersonde abreißen und darauf achten, dass keine Eikammern durchstochen werden.

Führen Sie als Nächstes eine Standard-Präpariersonde in die Mitte des Eierstocks neben der geschlossenen Pinzette ein. Ziehen Sie die Präpariersonde vorsichtig durch den Eierstock in Richtung des hinteren Pols, wo sich die reifen Eizellen befinden. Sobald die reifen Eier auf dem Deckglas außerhalb des Eierstocks sichtbar sind, manövrieren Sie drei bis fünf von ihnen in einer Linie in der Mitte.

Entfernen Sie als Nächstes den Rest des Eierstockgewebes, indem Sie es von den ausgerichteten Eizellen wegziehen. Entfernen Sie dann überschüssiges Öl, indem Sie es mit der Ecke eines medizinischen Tuchs abtupfen. Zeichnen Sie mit einem Marker ein Fadenkreuz auf das Deckglas, um die Probe unter dem Mikroskop zu lokalisieren.

Lassen Sie danach die vorbereiteten Eierkammern auf dem Deckglas fünf bis 10 Minuten ruhen, damit sich die Eier im Öl absetzen können. Bringen Sie die vorbereiteten Deckgläser, den Aktivierungspuffer bei Raumtemperatur und die Glaspipetten in die Bildgebungsanlage. Wählen Sie ein Objektiv, das für die Abbildung der gesamten reifen Eizelle geeignet ist.

Montieren Sie dann das erste vorbereitete Deckglas auf den Mikroskoptisch. Wählen Sie als Nächstes das Sichtfeld einer reifen Eikammer für die Aktivierung aus. Stellen Sie die Bildgebungsparameter für die Standard-GFP-Anregung und -Emission ein.

Richten Sie danach eine Hellfeldansicht ein, um das reife Ei und das verdrängte Öl zu visualisieren und zu orientieren. Wählen Sie nun die unterste Z-Ebene aus, in der die reifen Eizellen sichtbar sind. Und stellen Sie einen vollen Z-Stack ein, der für 40 Mikrometer mit zwei Mikrometern pro Schritt aufgenommen wird.

Legen Sie dann die Zeitreihe so fest, dass die Bilder 30 Minuten lang aufgenommen werden. Starten Sie in diesem Verfahren die Bildaufnahme, und erfassen Sie ein bis zwei vollständige Z-Stapel, um das reife Ei vor der Aktivierung anzuzeigen. Als nächstes ziehen Sie etwa 300 Mikroliter Aktivierungspuffer in eine Glaspipette ab.

Positionieren Sie die Spitze der Glaspipette mit dem Aktivierungspuffer in einem 45-Grad-Winkel über dem Deckglas und bewegen Sie die Pipette langsam in den Strahlengang, bis sie sich direkt über dem reifen Ei befindet, das abgebildet wird. Fügen Sie in weniger als fünf Sekunden ein bis zwei Tropfen Aktivierungspuffer hinzu, um das Öl zu verdrängen. Die Zugabe von ein bis zwei Tropfen Aktivierungspuffer muss im richtigen Winkel, sanft und schnell erfolgen.

Überprüfen Sie beim Hinzufügen eines Aktivierungspuffers während der Bildaufnahme den Hellfeldkanal, um sicherzustellen, dass das Öl verdrängt wurde. Sobald das Öl erfolgreich verdrängt wurde, lassen Sie die Zeitreihe bis zum Abschluss laufen. Um eine Projektion der erfassten Daten zu erstellen, wählen Sie eine Start-Z-Slice und eine Stopp-Z-Slice für den gesamten Schnitt aus.

Wählen Sie anschließend einen Projektionstyp aus, z. B. maximale Intensität. Aktivieren Sie anschließend das Kontrollkästchen Alle Zeitrahmen, um die ausgewählten Einstellungen auf die gesamte Serie anzuwenden. Um die Helligkeit und den Kontrast des Bildes anzupassen, wählen Sie Bild, dann Anpassen und dann Helligkeit/Kontrast.

Um die Zeitreihe als Film zu exportieren, wählen Sie "Datei", dann "Speichern unter" und dann "AVI". Wählen Sie dann die Bildrate aus. Hier ist die Zeitreihe eines ex vivo reifen Drosophila-Eies gezeigt, das nach Zugabe von Aktivierungspuffer einen genetisch kodierten Kalziumindikator exprimiert.

Der Anstieg des zytoplasmatischen Kalziums beginnt am hinteren Pol und breitet sich dann mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von etwa 1,5 Mikrometern pro Sekunde aus. Die Einleitung der Welle wird typischerweise innerhalb von drei Minuten nach der Zugabe von Aktivierungspuffer beobachtet. Nach der Aktivierung erholt sich der intrazelluläre Kalziumspiegel der reifen Eizelle.

In Drosophila kann mit diesem ex vivo Aktivierungsassay eine Co-Visualisierung der Kalziumwelle und des Aktin-Zytoskeletts erreicht werden. Aktin scheint sich im Laufe der Zeit zu verändern, wie die weißen Pfeilspitzen zeigen. Die fehlende Erkennung von Kalziumsignalen in der Mitte des reifen Eies ist auf die Bewegung der Probe während der Bildaufnahme zurückzuführen.

Einmal gemeistert, kann diese gesamte Technik in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sich Zeit zu nehmen, wenn Sie die Eikammern manövrieren und die Parameter für die Erfassung einstellen. Dieses Verfahren kann angepasst werden, um andere fluoreszenzmarkierte Proteine, Organellen oder Kalziumindikatoren bei der Eiaktivierung sichtbar zu machen.

Dies kann helfen, Fragen zur Quelle von Kalzium und den nachgelagerten Auswirkungen zu beantworten.