Name: Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Krebszellen in Kollagen einbetten und in Fibrin-Gel einschließen, um Invasivität und Satellitentumorbildung in 3D zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht realistische Krebsforschung.

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Die Arbeit wurde teilweise von Prostate Cancer Canada (Zuschuss # D2014-4 an SG und CJD) und den Canadian Institutes of Health Research (Zuschuss # MOP-111069 an SG) finanziert. Wir danken Dr. Richard Poulin für die redaktionelle Unterstützung und Frau Chanel Dupont für die technische Unterstützung.

HINWEIS: Keine Ethik Betracht, da tierische und menschliche Krebszellen erworben wurden oder uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt. 1. Erstellen Collagen Stecker (Pseudo-Primärtumor) <ol><li> Bereiten Sie eine Kollagen-Dispersion. Typ I aus Rattenschwanzsehnen (RTT) Kollagen kann entweder extrahiert und sterilisiert werden , wie zuvor 17 berichtet, oder gekauft haben . Disperse gefriergetrocknet RTT Kollagen (3,25-3,50 mg / ml in 0,02 N Essigsäure) mit einem Mixer (High-Speed-Einstellung, fünf 2 min läuft) für eine gleichmäßige Durchmischung. </li><li> Harvest (Trypsin-EDTA, in der Regel) und verwenden Trypanblau-Ausschluss für das Zählen lebender Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Stellen Sie die gewünschte Zelldichte (5 x 10 4 Zellen pro Stecker). </li><li> Bereiten Sie alle Lösungen (NaOH, fötale Rinderserum, DMEM 5x, NaHCO 3) getrennt (Tabelle 1) unter sterilen Bedingungen und gekühlt auf Eis halten. Anmerkung: Die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Lösungen wichtig ist osmotischen Schocks oder saure in Zellen zu verhindern. </li><li> Führen Zelldispersion (1,25 x 10 &amp; sup6 ; Zellen) in die endgültige Kollagenlösung (5 ml) so schnell wie möglich. Gut mischen (durch Pipettieren oben und unten), während Luftblasen zu vermeiden, und dann verteilen schnell 200 ul der ready-to-use-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. schlagen Sie vorsichtig die Multi-Well-Platte auf der Arbeitsfläche Oberfläche der Zellkultur Haube Luftblasen zu entfernen und die Lösung gleichmäßig in den Vertiefungen zu verbreiten. </li><li> Nach dem Befüllen alle Vertiefungen (dieser Schritt dauert etwa 15-20 Minuten pro 96-Well-Platte), bewahren Sie sie in den Inkubator. </li><li> Die Platte bei 37 ° C von 2 h bis über Nacht. Collagen Gelierung (dh Fibrillogenese) tritt innerhalb von 30 min. Hinzufügen Kulturmedium (100 &amp; mgr; l / Vertiefung) zu der Kultur einer Inkubation über Nacht durchzuführen. </li></ol> 2. Erste Schicht von Fibringelstruktur <ol><li> Fibrinogenlösung Vorbereitung. HINWEIS: Die gleiche Charge von Fibrin-Gel sollte idealerweise für reproduzierbarer Resul verwendet werdents, wie Fibrin-Gel-Bildung zwischen verschiedenen Chargen von kommerziellen gefriergetrocknetem Fibrinogen kann variieren. <ol><li> Verwenden Sie immer eine frisch zubereitete Fibrinogen-Lösung. Bringen Sie die gefriergetrockneten Fibrinogen auf Raumtemperatur vor dem Öffnen der Flasche Hydrat eine Kristallbildung zu vermeiden. </li><li> Progressiv das Fibrinogen in vorgewärmten (37 ° C) Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) auflösen mit Ca 2+ / Mg 2+ bei einer Arbeitskonzentration von 3 mg / ml (erwägen , einen 15% Überschuß des Mindest Endvolumen erforderliche Vorbereitung : zB 17.25 mg in 5,75 ml einer 5 ml - Lösung). <ol><li> In vorgewärmten HBSS tropfenweise auf den ersten Fibrinogenfragmenten löslich zu machen. Break down größere Fragmente mit einem Spatel in den Becher. Agitieren den Becher von Zeit zu Zeit das Mischen zu erleichtern. Verwenden Sie keine Rührerplatte während des Verfahrens verwendet werden. Man löst das verbleibende Pulver durch Pipettieren der Suspension auf und ab. </li></ol></li><li> Halten Sie die Fibrinogenlösung lauwarm während steriLIZING die Lösung, indem sie durch ein 0,22 um-Filter geleitet. Hinweis: Wenn die HBSS nicht warm genug ist oder das Fibrinogen nicht vollständig gelöst ist, kann die Lösung den Filter verstopfen. Setzen Sie gegebenenfalls Filter ein- oder zweimal, was die Fibrinogenkonzentration verringern kann und damit Fibringerinnsels Steifigkeit. </li><li> Suspend die Zellen von Interesse (zB Endothelzellen) in ready-to-use Fibrinogen - Lösung , während seine endgültige Einstellen der Lautstärke, als alternatives Verfahren. </li></ol></li><li> Vorbereiten der Thrombin-Lösungen. <ol><li> Bereiten Sie eine Stammlösung in ddH 2 O (50 NIH - Einheiten / ml), dann sterilisieren es einen 0,22 &amp; mgr; m - Filter. </li><li> Verwenden Sie ein Fibrinogen / Thrombin-Verhältnis ≥1: 0,0075 (v / v), um das Fibrin-Gel zu erzeugen. </li></ol></li><li> Die Erzeugung des Fibringelstruktur. <ol><li> Halten Sie das sterile Fibrinogen und Thrombin-Stammlösungen auf Eis während all den nächsten Schritten. Die Fibringele können in Platten mit 24 Vertiefungen zu bilden. </li><li> Unverzüglich Overlay the Oberfläche jeder Vertiefung mit der Fibrinogen-Lösung (200 &amp; mgr; l / Well) während der Luftblasenbildung zu vermeiden. Verfahren 6 Vertiefungen zu einer Zeit. </li><li> Sobald vollständig die Fibrinogenlösung, die Oberfläche der Vertiefungen bedeckt, in einem 45 ° -Winkel der Platte kippen und 1,5 ul Thrombinlösung in die erste Vertiefung mit Hilfe des Thrombins in der Mitte des Bohrlochs fallen und dann auf die Platte leicht geschwenkt horizontal 1-2 sec. <ol><li> Lassen Sie die Platte in einer stabilen Position unter der Laminar - Flow - Haube (5-10 min) , bis die Gelierung / Gerinnungsprozess abgeschlossen ist (NB: Polymerisation darf nicht gestört werden, zum Beispiel indem man die Platte in den Inkubator zu transportieren). </li></ol></li><li> Sobald die ersten sechs Bohrungen polymerisiert haben, wiederholen Sie die gleiche Sequenz (dh die drei vorhergehenden Schritte) für die nächsten sechs Brunnen , bis alle Vertiefungen verarbeitet wurden. </li></ol></li></ol> 3. Zweite Schicht von Fibringelstruktur und Sandwiched Collagen Stecker <ol><li> OptionA: (Mit Hilfe des Collagen-Plug sofort). <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die erste Schicht aus Fibrin-Gel in allen Vertiefungen zart polymerisiert wurde von der Platte zu kippen. Legen Sie die 96-Well-Platte das Kollagen Gelpfropfen Seite an Seite mit der 24-Well-Platte (mit den Fibringelen), die Übertragung der Kollagen-Stecker zu erleichtern. </li><li> Geben Sie einen Tropfen HBSS in jede Vertiefung der Platte, die die Kollagen-Stecker enthalten. </li><li> Entfernen Sie jede Kollagen Stecker aus dem Bohrloch mit einer dünnen Nadel an einer Spritze befestigt (als Griff verwendet wird) oder mit einem Mikro-Löffel (siehe Video). Bringen Sie jede Kollagen-Stecker auf die erste Fibringelstruktur Schicht mit einem oder zwei Mikrolöffel, gleichzeitig aber dafür sorgen, dass das Kollagen Stecker gut in das Bohrloch zentriert ist und dass die Sterilität ist sehr gepflegt. </li><li> Überlagern, die zuvor gebildete Fibrin-Gel mit der zweiten Schicht von Fibrinogen-Lösung (300 ul / Vertiefung) und die Einführung des Thrombins wie in 2.3 beschrieben, wird ein minimal 1 zu halten. 0,0075 Verhältnis und eine Sequenz von sechs Vertiefungen in einer Zeit &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Option B (Beschichtung der Collagen-Stecker mit einer dünnen Schicht von Wachstumsfaktor-reduziert Basalmembran (GFRBM)). <ol><li> Kühle alle hergestellten Lösungen und Instrumente vorher und halten sie bei 4 ° C oder auf Eis (zB Pipetten, Spitzen, Reagenzgläser) während seit gefrorenen Aliquoten GFRBM Handhabung sind sehr empfindlich gegen zu hohe Erwärmungsrate während des Auftauens (folgen Sie den Anweisungen des Herstellers) . </li><li> Nach der Entfernung von den Plattenvertiefungen, tränken jedes Kollagen Stecker für 2 Minuten in einer 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis, die 100 &amp; mgr; l einer reinen GRFBM Lösung. </li><li> Übertragen jeder beschichteten Stecker auf die erste Fibrinschicht, während es gewährleistet ist gut zentriert ist, wie oben beschrieben. Inkubieren der Steck enthaltenden Platten bei 37 ° C für 5 min die GRFBM zu ermöglichen, ein Gel zu bilden. Fügen Sie die zweite Fibrinschicht, wie in Schritt 3.1.4. </li></ol></li></ol> 4. Zellkulturmedium Bedingungen <ol><li> Füllen Sie jede Vertiefung mit Kulturmedium (400 ul). Die Kulturmedien und Ergänzungen werden auf der Grundlage der Zelllinie und Versuchsbedingungen gewählt werden. </li><li> Hinzufügen Aprotinin, ein Antifibrinolytikum, um Kulturmedium in einer Endkonzentration von 100 Kallikrein-Inhibitor-Einheiten (KIE) / ml. HINWEIS: Bewahren Sie die Platten in einer Zellkultur-Inkubator unter den Bedingungen für die Zelllinie getestet verwendet. </li><li> Füllt Kulturen mit frischem Medium jeden zweiten Tag oder nach dem Versuchsplan, und fügen Sie Aprotinin. Vor Zugabe von frischem Medium, kippen leicht die Platte (bei 30-35 ° Winkel) und neigen die Pipette gegen die Seite des Bohrlochs während sorgfältig das konditionierte Medium unter ständiger Beobachtung Absaugen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegung.

Als wichtige technische Fußnote ist es wesentlich, dass kein Spalt an der Grenzfläche zwischen dem zentralen vorhanden ist, und die peripheren Gelen. Andernfalls könnte es die Fähigkeit der Zellen zu reduzieren, um das Fibrin-Gel wandern / eindringen. Ein Raum zwischen dem Kollagen und Fibrin-Gelen kann während der ersten 24 Stunden der Kultur bilden, wenn Thrombin wurde nicht in geeigneter Weise verdünnt worden ist. Es ist auch möglich, dass die Zelllinie in Kultur getestet könnte das Kollagengel führen, zu kontrahiere...

Die grundlegenden und biomedizinischen Eigenschaften der Invasion von Krebszellen / Migration und anschließende Metastasierung Einrichtung zu untersuchen , ist Gegenstand einer intensiven Forschung 1,2. Metastasierung ist die letzte Stufe der Krebs und seine klinische Management bleibt schwer zu fassen. Ein besseres Verständnis der Metastasierung auf zellulärer und molekularer Ebene wird die Entwicklung effizienterer Therapien 3 ermöglichen. Mehrere Eigenschaften von metastatischen Zellen können in vitro 4 einschließlich ihrer stemness und potentielle einen Übergangszustand (beispielsweise epithelioid-mesenchymale Transition) zu migrieren und dringen in und aus dem Primärtumor 5 zu erwerben , untersucht werden. Allerdings hat die in - vitro - Beurteilung der Invasion / Metastasierung Prozesse eine Herausforderung , da sie praktisch den Beitrag des Blut / lymphatischen Kreislauf schließt. Organotypischen Kulturen, die Tumorfragmente in Collagengele einbetten haben früschlauen verwendet worden, um Krebs Aggressivität zu überwachen. Obwohl die Komplexität von Tumoren erhalten wird (beispielsweise das Vorhandensein von Nicht-Krebszellen) werden Tumorfragmente des begrenzten Diffusionsmedium ausgesetzt wird , um Stichprobenvariation und zu einem übermäßigen Wachstum von Stromazellen 6. Ein alternatives Verfahren besteht in Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) in Krebszellen wachsen, die die dreidimensionale (3D) Zellumgebung imitiert. Die Proliferation von Brustkrebszelllinien in einem Kollagen-Gel und / oder einer Basalmembran-Matrix abgeleitet ist unter den besten charakterisierten Beispiele von 3D-Zellkultur. Durch die Verwendung von bestimmten 3D - Zellkulturumgebungen, die desorganisierte Anordnung für Brustkrebszellen beobachtet unter Standardbedingungen gezüchtet kann 7-10 zur spontanen Bildung von Brust Acini und röhrenförmige Strukturen umgekehrt werden. Darüber hinaus sammelten die Bildung von vielzelligen Tumorsphäroide abgeleitet von einem Adenokarzinom Krebszellen mit verschiedenen Techniken (zB hängende Tropfen, schwimmend Sphäroiden, Agar Einbettungs) jetzt die am häufigsten verwendeten 3D - Zellkulturtest 11-13 darstellt. Jedoch ist dieser Test durch den eingeschränkten Satz von Krebszelllinien begrenzt, die Sphäroide und durch den kurzen Zeitraum zur Verfügung zu studieren Zellen unter diesen Bedingungen bilden kann. In dieser visualisierten Technik stellen wir hier ein anspruchsvolles 3D - Zellkulturassay , wo Krebszellen von Interesse in einem Kollagengel eingebettet sind , die in vitro Bildung eines pseudo-primären Tumors zu ermöglichen , die mit einer Basalmembran stammenden Matrix beschichtet werden alternativ kann. Einmal gebildet, wird die pseudo-primären Tumors dann in einer azellulären Matrix (Fibrin - Gel im vorliegenden Fall) sandwichartig angeordnet, die die Krebszellen ermöglicht die Schnittstelle zwischen den beiden Abteilen Matrix kreuzen (siehe Abbildung 1). Interessanterweise sekundäre tumorartige Strukturen aus dem Pseudo-Primärtumor erscheinen zusammen mit aggressiven Krebszellen mit Ursprung in derFibrin-Gel. Eine solche 3D - Kultursystem bietet die Flexibilität , beispielsweise zu untersuchen, erforderlich, Antikrebsmittel, die Genexpression und die Zell-Zell- und / oder Zell-ECM - Wechselwirkungen 14-16. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54322/54322fig1.jpg" /> Abbildung 1:.. Überblick über die Methode Schematische Zusammenfassung der Methode der 3D - Zellkultursystem als Modell für Krebsstudien zu generieren <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Gefriergetrocknetes Kollagen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7661</td><td>aus Rattenschwanzsehne (lösliche Dispersion) oder selbst hergestellt (siehe Rajan et al., Ref.#14)</td></tr><tr><td>Fibrinogen (gefriergetrocknet)</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>F8630</td><td>Typ I-S, 65 - 85 % Protein mit > 75 % Protein ist gerinnbar</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>605157</td><td>&nbsp; Gibbstown, NJ; NIH-Einheiten/mg Trockengewicht&nbsp;</td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Zuvor von BD Biosciences</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279&nbsp;</td><td>&nbsp; Lösung bei 5 - 10 T I.E./ml (Trypsin-Inhibitor-Einheit) &nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mikrolöffel</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td>Fisherbrand Handi-Hold Microspatula</td></tr><tr><td>96 Well Platte, runder Boden</td><td>Sarstedt</td><td>3925500</td><td></td></tr><tr><td>24 Well Platte</td><td>Sarstedt</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifizierte Eagle's Medium</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>D5546</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>VWR</td><td>CAA15-701</td><td>FBS, kanadischer Ursprung.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma Chemical, Co. KG</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Ausgewogene Salzlösung&nbsp;</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>H8264</td><td>HBSS</td></tr></tbody></table>

dreidimensionale kulturtest auf krebszelle invasivität und satelliten tumorbildung erkunden

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Säugerzellkultur in Monolayern wird weithin verwendet, um verschiedene physiologische und molekulare Prozesse zu untersuchen. dieser Ansatz jedoch zu wachsenden Zellen studieren erzeugt oft unerwünschte Artefakte. Daher Zellkultur in einem dreidimensionalen (3D) Umgebung, die oft extrazelluläre Matrixkomponenten verwenden, erwies sich als eine interessante Alternative wegen seiner Ähnlichkeit mit dem nativen in vivo Gewebe oder Organ. Wir entwickelten ein Kultursystem 3D - Zelle zwei Abteilen unter Verwendung, nämlich (i) eine zentrale Kammer Krebszellen enthält , in einem Kollagengel wirkenden eingebettet als pseudo-primäre macrospherical Tumors und (ii) einem peripheren zellfreien Kammer aus einem Fibrin - Gel, dh eine extrazelluläre Matrixkomponente , die sich von der in der Mitte verwendet werden, in denen Krebszellen (invasion vorne) wandern und / oder mikrosphärischen Tumoren bilden darstellt sekundäre oder Satelliten Tumoren. Die Bildung von Satelliten-Tumoren im peripheres Kompartiment istbemerkenswert korreliert mit der bekannten Aggressivität oder metastasiertem Ursprung der nativen Tumorzellen, die diese 3D-Kultursystem einzigartig macht. Dieser Zellkulturansatz könnte als Krebszelle Invasivität und Motilität, Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen und als ein Verfahren zur Beurteilung anti-Krebs-Medikament Eigenschaften zu bewerten.

Wie bereits erwähnt, ist ein interessantes Merkmal dieser 3D - Zellkulturassay , daß Krebszellen nicht nur aus dem Kollagenstopfen zum benachbarten Fibringel wandern kann, sondern auch sekundäre Tumoren (beispielsweise Satelliten - tumorartige Strukturen) herzustellen. Diese können direkt mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop bei niedrigen und hohen Vergrßerungen durch das Gel Dicke beobachtet, insbesondere mit einem großen Arbeitsabstand Kondensor (Abbildung 2)...

Krebszellen werden in ein Kollagengel eingebettet und dann in ein azelluläres Fibringel eingebettet, um ein 3D-Kultursystem zu erzeugen, in dem die Invasivität und Bildung von Satellitentumoren überwacht werden kann.

Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, kollageneingebettete Krebszellen zwischen einer Fibrin-Gel-Schicht einzuschließen, um ein 3D-Kultursystem zur Beobachtung der Invasivität und Bildung von Satellitentumoren zu erzeugen. Unser 3D-Bildsystem kann neue Ansätze zur Untersuchung verschiedener Zellen und zahlreicher wichtiger Varianten während der Apoptose oder Migration von Krebszellen bieten oder zur Bewertung der Wirksamkeit von Maßnahmen gegen den Verlust von Krebszellen dienen. Eine attraktive Eigenschaft dieses 3D-Zellkultursystems ist die Möglichkeit, die Konzentration der extrazellulären Matrix zu verändern oder eine alternative extrazelluläre Matrix für die Herstellung des 3D-Systems zu verwenden.Den Ablauf wird Marie-France Cote demonstrieren, wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor, und Audrey Turcotte, eine Doktorandin unter meiner Betreuung. Beginnen Sie damit, lyophilisierte Typ-I-Kollagen aus Rattenschwanzsehne durch fünf zweiminütige Mischvorgänge auf höchster Stufe zu homogenisieren, um das Kollagen gleichmäßig zu verteilen.Während die Kollageneinlagerung erfolgt, gewinnen Sie die gewünschten Tumorzellen mit der geeigneten enzymatischen Ablösungslösung. Anschließend erfolgt die Zählung mittels Trypanblau-Ausschluss. Verdünnen Sie die dissoziierten Zellen auf eine Konzentration von 50.000 Zellen pro Probe in DMEM.Wenn das Kollagen bereit ist, pipettieren Sie schnell 1.250.000 Zellen zur Kollagenlösung, um die Zellen homogen zu verteilen. Geben Sie unverzüglich 200 Mikroliter der Einzelzell-Suspension in jedes Loch einer 96-Loch-Platte. Klopfen Sie nach jeder Zugabe vorsichtig auf die Platte an der Arbeitsfläche, um Luftblasen zu entfernen und die Lösung gleichmäßig in den Löchern zu verteilen.Nachdem alle Zellen hinzugefügt wurden, das Plättchen für mindestens zwei Stunden in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen, wobei nach den ersten zwei Stunden 100 Mikroliter Kulturmedium pro Mulde zugegeben werden, falls die Zellen über Nacht kultiviert werden sollen. Um die erste Fibrin-Gel-Schicht vorzubereiten, das gefriergetrocknete Fibrinogen vor dem Öffnen des Fläschchens auf Raumtemperatur bringen, um die Bildung von Hydratkristallen zu vermeiden. Danach das Fibrinogen in einen Glasbecher überführen und 37 Grad Celsius warmes HBSS tropfenweise zum Pulver geben, um die Fibrinogen-Fragmente aufzulösen.Verwenden Sie anschließend einen Spatel, um die größeren Proteinstücke zu zerkleinern, und schütteln Sie das Becherglas gelegentlich leicht, um die Vermischung zu erleichtern. Pipettieren Sie die Suspension mehrmals, um das verbleibende Protein aufzulösen, und filtrieren Sie die Lösung steril durch einen 22-Mikron-Filter. Überlagern Sie dann unverzüglich die Oberfläche jedes Wells einer 24-Well-Platte mit 200 Mikrolitern Fibrinogen, wobei Sie darauf achten sollten, Luftblasen zu vermeiden.Nachdem alle Vertiefungen gründlich beschichtet wurden, neigen Sie die Platte um 45 Grad, geben dann 1,5 Mikroliter Thrombinlösung in die Mitte einer Vertiefung und schwenken die Platte vorsichtig horizontal für eine bis zwei Sekunden. Nachdem fünf weitere Vertiefungen auf dieselbe Weise mit Thrombin behandelt wurden, stellen Sie die Platte fünf bis zehn Minuten lang in stabiler horizontaler Position unter einer laminaren Flussabsaugung ab, bis die Lösungen zu einem Gel polymerisieren. Um den Kollagenpfropfen unmittelbar einzusetzen, neigen Sie die Platte vorsichtig, um zu überprüfen, ob die Fibringele vollständig polymerisiert sind.Danach die 96-Loch-Platte mit Kollagen-Gel-Plug auf die 24-Loch-Platte mit Fibrin-Gelen stellen und einen Tropfen HBSS in jedes Kollagen-Plug-Loch geben. Anschließend mit einem Mikrolöffel jeweils einen einzelnen Kollagen-Plug in die Mitte jeder der ersten Fibrin-Gel-Schichten in der 24-Loch-Platte übertragen. Sobald alle Plugs übertragen wurden, 300 µL Fibrinogen-Lösung in jedes Loch geben, gefolgt von der Zugabe von 2,25 µL Thrombin, wie gerade gezeigt.Um die Kollagenstopfen vor dem Einsetzen mit einer dünnen Schicht wachstumsfaktorreduzierten Basalmembranmaterials zu beschichten, überführen Sie jeden Stopfen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifuenröhrchen auf Eis, das 100 Mikroliter reines wachstumsfaktorreduziertes Basalmembranmaterial enthält. Nach zweiminütigem Einweichen übertragen Sie einen einzelnen beschichteten Kollagenstopfen in die Mitte jeder Fibrinschicht und inkubieren die Stopfen zur Verfestigung des wachstumsfaktorreduzierten Basalmembranmaterials fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Anschließend fügen Sie die zweite Fibrinschicht wie zuvor gezeigt hinzu.Wenn die Gele vollständig polymerisiert sind, füllen Sie jedes Loch mit 400 Mikrolitern des geeigneten Kulturmediums und den entsprechenden Zusätzen. Fügen Sie anschließend einen Antifibrinolytikum den Löchern hinzu. Inkubieren Sie die 3D-Kulturen unter den geeigneten Bedingungen für die zu testende Tumorzelllinie.An den entsprechenden Tagen zur Zellversorgung neigen Sie die Platte um einen Winkel von 30 bis 35 Grad und lehnen Sie eine Pipette gegen die Wand jeder Vertiefung, um das Medium zu aspirieren, ohne die Gele zu stören. Geben Sie anschließend 400 Mikroliter frisches Zellkulturmedium und Antifibrinolytikum zu jeder Gelkultur hinzu. Dieser 3D-Zellkultur-Assay ermöglicht eine direkte Visualisierung der Migration von Krebszellen aus dem Kollagenpfropfen in das angrenzende Fibrin-Gel zur Bildung sekundärer Tumore und erlaubt somit einen Vergleich des Verhaltens bekannter metastatischer Zellen mit dem von nicht oder schwach metastatischen Zellen.Beispielsweise treten in diesem Experiment zahlreiche Satellittumore zufällig verteilt im Fibrin-Gel auf, das die metastasierende Zelllinie B16 F10 enthält, während für die schwach metastasierende Zelllinie B16 F0 keine Satellittumore beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu bilden diese murinen Mammakarzinomzellen, die schlecht metastasieren, aber lokal stark invasiv sind, eine Migrationsfront, die sich radial in das Fibrin-Gel hinein erstreckt. Nach 14-tägiger Kultur lösen sich die Mammakarzinomzellen von der Migrationsfront ab und bilden sternförmige Strukturen, die eng an Mammadrüsenstrukturen erinnern.Chemotherapeutische Wirkstoffe können an den eingebetteten Krebszellen getestet werden, wie in diesem repräsentativen Experiment, bei dem eine zunehmende DNA-Fragmentierung gleichzeitig mit der erhöhten Häufigkeit der durch das chemotherapeutische Mittel ausgelösten Apoptose von Krebszellen beobachtet wurde. Wenn die Methode beherrscht ist, kann sie in etwa sechs Stunden abgeschlossen oder auf zwei Tage verteilt werden, abhängig von der anfänglichen Inkubationszeit des Kollagen-Plug.Während ich dieses Verfahren durchführe, ist es wichtig, die Bildung von Lücken an der Grenzfläche zwischen dem zentralen und dem peripheren Gel zu verhindern, da diese die Fähigkeit der Krebszellen, in das Fibrin-Gel einzudringen, beeinträchtigen können. Nach Durchführung dieses Verfahrens können metallografische oder proteomische Analysen in den Satellitenkolonien, den Kollagenstopfen oder den Krebszellen durchgeführt werden, um die differenzielle Expression von Genen und Proteinen von Interesse zu identifizieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Krebsbiologie den Weg, die Migration, Apoptose, metastasensuppressive Genexpression sowie die Angiogenese in einer Vielzahl von Krebszelllinien zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Krebszellen in ein Kollagen-Gel einbettet und sie zwischen ein Fibrin-Gel „sandwichartig“ einschließt, um die Invasivität und die Bildung von Satellitentumoren zu beobachten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Ein Test zur quantitativen Messung Transforming Growth Factor (TGF)-β-induzierte Invasion im 3-dimensionalen Kollagen-Gelen beschrieben. Dieser Assay nutzt die MCF10A Reihe von Zelllinien, die verschiedenen Stadien der Entwicklung von Brustkrebs darstellen. Diese Methode kann angenommen, um mit anderen Zelllinien verwendet werden und könnte verwendet werden, um andere potenzielle Aktivatoren oder Inhibitoren der Invasion zu untersuchen sein.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

Dieses Video bietet eine detaillierte Methodik zur Züchtung von Brustkrebszellen in einer 3D-Basalmembran-Proteinmatrix, die das Potenzial der 3D-Kultur bei der Beurteilung der Zellinvasion in die Umgebung veranschaulicht.

3D-Kultur-Basalmembran-Assay: Kultivierung von Krebszellen auf einer 3D-Basalmembran-Proteinmatrix zur Untersuchung der Zellinvasion

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Etablierung einer dreidimensionalen Co-Kultur von Tumor-Sphäroid und T-Zell. Es wird ein Agarose-Abguss mit Mikrovertiefungen hergestellt, die Tumor-Sphäroide enthalten, gefolgt von der Zugabe von T-Zellen. Nach der Inkubation ermöglicht dieser Aufbau die Untersuchung der Interaktion von T-Zellen mit Tumorsphäroiden in einer kontrollierten dreidimensionalen Umgebung.

Ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell der Infiltration von T-Zellen in Tumor-Sphäroiden

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Dreidimensional Kulturen: Ein Werkzeug, um Architektur zu studieren Normale acinar gegen maligne Transformation von Brustzellen

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden für die Verwendung von dreidimensionalen (3D-) Assays auf Brustkrebszellinvasion zu quantifizieren. Insbesondere diskutieren wir die Verfahren erforderlich, um solche Tests einrichten, Quantifizierung und Datenanalyse, sowie Methoden, um den Verlust der Membranintegrität, die bei Zellen eindringen tritt zu untersuchen.

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Co-Kultur in drei Dimensionen, das nützlich ist, um multizelluläre Interaktionen und extrazelluläre Matrix-abhängige Modulation des Verhaltens von Krebszellen zu untersuchen. In diesem experimentellen Modell werden Krebszellen auf Kollagengelen kultiviert, die in humane krebsassoziierte Fibroblasten eingebettet sind.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix.  Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht.  Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Die Prozesse für die Blase Krebs Invasion darstellen Biomarker und therapeutische Entwicklungsmöglichkeiten. Hier präsentieren wir eine Blase Krebs Invasion Modell mit 3-d-Kultur der Tumor Sphäroide, Time-Lapse Bildgebung und konfokalen Mikroskopie. Diese Technik ist nützlich für die Definition der Merkmale des invasiven Verfahrens und für das screening von Therapeutika.

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Der vorgestellte Ansatz bewertet gleichzeitig die Krebszellinvasion in 3D-Sphäroid-Assays und t-Zell-Zytotoxizität. Sphäroide werden in einem gerüstfreien Agarose-Multi-Mikrowell-Guss erzeugt. Co-Kultur und Einbettung in Typ I Kollagenmatrix werden innerhalb des gleichen Geräts durchgeführt, das Krebszellinvasion und T-Zell vermittelte Zytotoxizität zu überwachen ermöglicht.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Erfahren Sie, wie Sie Krebszellen in Kollagen einbetten und in Fibrin-Gel einschließen, um Invasivität und Satellitentumorbildung in 3D zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht realistische Krebsforschung.

Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden

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