Ununterbrochener Thulium-Laser zum Erwärmen von kultivierten Zellen zur Untersuchung zellulärer thermischer Effekte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, thermisch dosisabhängige zellbiologische Reaktionen in vitro zu untersuchen, indem kultivierte Zellen mit präziser Temperatur- und Zeitkontrolle erhitzt werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in Bereichen zu beantworten, die Zell- oder Gewebereaktionen auf Hyperthermie untersuchen, wie z. B. die Erforschung der retinalen Laserbehandlung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine schnelle Erwärmung der Zellen und eine präzise Kontrolle der Heizdauer, was eine hohe reproduzierbare thermische Belastung während der Experimente ermöglicht.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Reaktionen von kultivierten retinalen Pigmentepithelzellen auf thermische Laserbestrahlung geben kann, kann sie auch auf andere Modelle wie Krebszellen angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir melaninhaltige Zellen mit sichtbarem Laserlicht erhitzten. Dies führte jedoch zu unterschiedlichen Temperaturprofilen aufgrund unterschiedlicher Pigmentierung.

Um mit dem Verfahren zu beginnen, stellen Sie eine Heizplatte in einen verstellbaren Laborständer aus Metall auf eine saubere Bank. Stellen Sie die Kochplatte auf 39 Grad Celsius ein. Befestigen Sie eine 0,22 NA-Faser mit einem Kerndurchmesser von 365 Mikrometern am horizontalen Arm des Ständers.

Positionieren Sie den Metallarm über der Kochplatte und stellen Sie den Ständer so ein, dass sich die Faserspitze 12 Zentimeter über der Kochplatte befindet. Verbinden Sie einen 1,94 Mikrometer großen 20-Watt-Thulium-Laser mit einem 365-Nanometer-Zielstrahl mit einem Milliwatt-Ziel an der Faserspitze. Stellen Sie eine Kulturschale mit einem Durchmesser von 30 Millimetern auf die Herdplatte.

Zeichnen Sie vorsichtig den Umfang der Schüssel auf der Herdoberfläche nach und nehmen Sie dann die Schüssel heraus. Schalten Sie den Zielstrahl ein und stellen Sie den Ständer so ein, dass die Mitte des Strahlpunkts auf der Heizplatte mit dem nachgezeichneten Kreis übereinstimmt. Schalten Sie dann den Zielstrahl aus.

Um mit der Temperaturkalibrierung zu beginnen, erhitzen Sie die Spitze einer 20-Gauge-Nadel mit einem Bunsenbrenner. Durchstechen Sie mit der erhitzten Nadelspitze die Kulturschale mit einem Durchmesser von 30 Millimetern nahe dem Boden an vier Punkten im Abstand von 90 Grad, um Löcher mit einem Durchmesser von etwa 300 Mikrometern zu bohren. Lege Isolierband über die Löcher.

Stanzen Sie mit einer feinen Nadel ein Loch mit einem Durchmesser von etwa 200 Mikrometern durch das Klebeband, das jedes Loch abdeckt. Zeichne auf der Unterseite der Kulturschale eine Linie zwischen jedem Lochpaar im Abstand von 180 Grad. Beginnend am Schnittpunkt der Linien markieren Sie alle drei Millimeter radial entlang jeder Linie, um die 21 Messpunkte zu kennzeichnen.

Gib dann genau 1,2 Milliliter frisches, auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes Nährmedium in die Schale. Decken Sie die Form ab und stellen Sie die Form in den nachgezeichneten Kreis auf die Herdplatte. Schließen Sie ein Thermoelement mit einem Durchmesser von 200 Mikrometern an den Lasersteuerrechner an und öffnen Sie das Temperaturkalibrierprotokoll.

Führen Sie das Thermoelement in eines der Löcher in der Schale ein, so dass sich die Spitze an einer der Stellen der Markierung auf dem Boden der Schale befindet. Es ist sehr wichtig zu überprüfen, ob die Spitze des Thermoelements den Boden der Schüssel mit der gemessenen Präzision berührt, da die Temperatur je nach Tiefe variieren kann. Warten Sie, bis sich das Nährmedium bei 37 Grad Celsius stabilisiert hat.

Schalten Sie dann den Thulium-Laser ein und stellen Sie die Laserleistung auf das gewünschte Startniveau ein. Stellen Sie sicher, dass die Vorwärmdauer auf 140 und acht Sekunden eingestellt ist, und starten Sie dann die Vorwärmbestrahlungssequenz. Entfernen Sie nach 140 Sekunden, die durch einen hörbaren Piepton signalisiert werden, sofort den Deckel der Kulturschale.

Warten Sie, bis das Vorheizen abgeschlossen ist und die 10-Sekunden-Bestrahlung erfolgt. Dann sofort die Schüssel abdecken. Messen Sie auf diese Weise die Temperatur an den 21 markierten Stellen.

Führen Sie diesen Vorgang dreimal in Intervallen von jeweils drei Watt Leistung durch, die sich über den Laserleistungsbereich erstrecken. Wenn Sie fertig sind, schalten Sie den Thulium-Laser aus. Exportieren und analysieren Sie die Temperaturdaten.

Vor dem Experiment wurden Pigmentepithelzellen in Kulturschalen mit einem Durchmesser von 30 Jahren kultiviert. Halten Sie die Zellkulturen bei 37 Grad Celsius in einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre und überprüfen Sie sie mit einem Lebendzell-Bildgebungssystem. Ersetzen Sie eine Stunde vor der Bestrahlung das Nährmedium in jeder Schale durch genau 1,2 Milliliter frisches Nährmedium.

Bringen Sie die Kulturen wieder in den Inkubator. Vergewissern Sie sich, dass die Bestrahlungsstation bereit ist und die Heizplatte auf 39 Grad Celsius eingestellt ist. Wenn Sie bereit sind, mit der Bestrahlung zu beginnen, starten Sie den Thuliumlaser mit der gewünschten Leistung.

Öffnen Sie das Versuchsprotokoll, und stellen Sie sicher, dass die Vorheizdauer auf 140 und acht Sekunden eingestellt ist. Stellen Sie eine RPE-Zellkultur in einer geschlossenen Schale auf die markierte Position auf der Heizplatte und starten Sie sofort die 140- und achtsekündige Vorheizbestrahlungssequenz. Entfernen Sie den Schalendeckel nach 140 Sekunden Vorheizen.

Warten Sie, bis das Vorheizen abgeschlossen ist und die 10-Sekunden-Bestrahlung erfolgt. Decken Sie die Schale sofort ab, warten Sie sieben Sekunden und stellen Sie die Schale dann wieder in den Inkubator. Bestrahlen Sie zusätzliche Proben mit steigender Laserleistung.

Wenn Sie fertig sind, schalten Sie den Thuliumlaser aus. Um mit der Beurteilung der Zellviabilität zu beginnen, waschen Sie die bestrahlten Zellen mit PBS. Holen Sie sich ein Kit, das in der Lage ist, lebende apoptotische und nekrotische Zellen zu unterscheiden.

Kombinieren Sie dann bei schwachem Licht 500 Mikroliter Bindungspuffer mit 25 Mikrolitern Ethidium-Homodimer-3, FITC-Annexin und Hoechst 33342. Inkubieren Sie die Zellen in dieser Färbelösung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Zellen zweimal mit 1X Bindungspuffer.

Ersetzen Sie den Bindungspuffer durch PBS und stellen Sie die Zelle auf den Tisch eines Fluoreszenzmikroskops mit DAPI-, FITC- und TRITC-Filtern. Stellen Sie den Mikroskop-Strahlengang auf die Okularlinse ein und wählen Sie den DAPI-Filter aus. Schalten Sie das Beleuchtungslicht ein und suchen Sie die Fokusebene mit einem 4-fach-Objektiv.

Stellen Sie den Strahlengang auf die Mikroskopkamera ein. Verwenden Sie die Mikroskop-Bildgebungssoftware, um das Bild zu zentrieren und zu fokussieren. Definieren Sie die Parameter für die Bilderfassung mit dem DAPI-Filter.

Wiederholen Sie den Fokussierungsprozess und die Bildaufnahmeeinrichtung mit den FITC- und TRITC-Filtern. Verwenden Sie dann die Bildgebungssoftware, um mehrere Bilder mit drei Filtersätzen über die gesamte Schale zu erfassen und sie zu einem einzigen Bild der gesamten Kulturschale zu kombinieren. Verwenden Sie Analysesoftware, um die Temperaturschwellenwerte für Apoptose und Zelltod zu bestimmen.

Das proportionale Verhältnis zwischen dem maximalen Temperaturanstieg im Zentrum einer Zellkulturschale und der Laserleistung wurde durch das beschriebene thermische Kalibrierverfahren bestimmt. Die maximale Temperaturverteilung über die Zellkulturschale wurde dann an eine Gaußsche Funktion angepasst. Nach der Bestrahlung wurden drei Färbemuster beobachtet.

In Kulturen, die Temperaturen von 43 Grad Celsius oder weniger ausgesetzt waren, wurde keine Veränderung der Lebensfähigkeit beobachtet. Die Apoptose wurde erstmals drei Stunden nach der Bestrahlung bei 47 Grad Celsius beobachtet. Der Zelltod wurde später als drei Stunden nach 51 Grad Celsius und höher beobachtet.

Die mittleren Schwellentemperaturen für Apoptose und Zelltod wurden dann bestimmt, indem der Durchschnitt der gemessenen Radien der toten und apoptotischen Bereiche auf die Gaußsche Funktion angewendet wurde, die die Temperaturverteilung beschreibt. Nach diesem Verfahren können Bestrahlungen unter vielen verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden, z. B. unter unterschiedlichen Laserprofilen, Spotgrößen und Bestrahlungszeiten. Dies kann helfen, Fragen im Zusammenhang mit individuellen zeitgesteuerten Temperaturursachen auf zellulärer Ebene zu verstehen und zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Zellkultur mit einer guten Kontrolle über Temperatur und Zeit erhitzen können. Dies könnte auf den Möglichkeiten zur Untersuchung biologischer Reaktionen auf unterschiedliche Bedingungen der thermischen Strahlung beruhen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern sehr gefährlich für Ihre Augen und Ihre Haut sein kann.

Bleiben Sie über Sicherheitsschulungen für Laserbestrahlung auf dem Laufenden. Tragen Sie bei diesem Verfahren immer eine geeignete Schutzbrille, einen Laborkittel und Handschuhe.