Name: Ununterbrochener Thulium-Laser zum Erwärmen von kultivierten Zellen zur Untersuchung zellulärer thermischer Effekte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Lernen Sie die Methode zum präzisen Erwärmen kultivierter Zellen mit einem 1,94 µm Thulium-Laser für thermische Dosis-Wirkungs-Studien. Diese Technik ermöglicht reproduzierbare Untersuchungen zellulärer Hyperthermie-Antworten.

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Diese Arbeit wurde von einem Forschungsstipendium des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) (Zuschuss Nr. 13GW0043C) und einem Europäischen Amt für Luft- und Raumfahrtforschung und -entwicklung (EOARD, Grant # FA9550-15-1-0443) unterstützt.

1. RPE-Zellkultur <ol><li> Isolierung von RPE-Zellen aus Schweineaugen <ol><li> Erhalten Sie frisch entkernte Schweineaugen aus dem örtlichen Schlachthaus. Halten Sie sie kühl (4 ° C) und in einer dunklen Umgebung. </li><li> Entfernen Sie extrazelluläre Gewebe mit einer Schere und tränken Sie die Augen in einer antiseptischen Lösung für 5 min. </li><li> Legen Sie die Augen in sterilisiertem phosphatgepufferten Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium (PBS (-)) bis zur Verwendung. </li><li> Mit einem Skalpell, dringen Sie die Sklera bei etwa 5 mm hinter dem Hornhaut limbus. Resect den ganzen vorderen Teil des Auges durch Schneiden mit Schere den ganzen Weg durch, parallel zum Hornhaut limbus. </li><li> Entfernen Sie den vorderen Teil des Auges ( dh die Hornhaut und das Objektiv) und den Glaskörper. Füge 1 ml PBS (-) hinzu und neide die neurale Retina vorsichtig ab. HINWEIS: Diese "Augenschale", bestehend aus Sklera, Aderhaut und RPE, ist nun fertig. </li><li> Vorgewärmtes (37 ° C) 0,25% Trypsin in P hinzufügenBS (-) zur Augenschale. Stellen Sie das Volumen so ein, dass etwa 80% der Augenschale mit dieser Trypsinlösung gefüllt ist. </li><li> Inkubieren Sie die Augenschale mit der Trypsinlösung in einem 5% CO 2 -Inkubator bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Entfernen Sie die Augenschale vom Inkubator und ersetzen Sie die 0,25% Trypsinlösung durch eine PBS (-) - Lösung mit 0,05% Trypsin + 0,2% Ethylendiamintetraessigsäure Tetranatriumsalz (EDTA · 4N). Inkubieren Sie die Augenschale im Inkubator für 45 min. ANMERKUNG: Nach 45 min werden die RPE-Zellen entweder einfach lose an die Bruch-Membran gebunden oder bereits abgelöst und in der Trypsin-EDTA-Lösung schwimmen. </li><li> Sammle die RPE-Zellen durch sanftes Pipettieren. Sammeln Sie die Zellen und die Lösung in einem konischen Röhrchen, gefüllt mit 10 ml Kulturmedium (DMEM-Hochglukose mit L-Glutamin), einschließlich 10% Schweineserum, Antibiotikum / Antimykotikum und Natriumpyruvat (1 mM). HINWEIS: Das Serum kann die Wirkung von Trypsin neutralisieren. </li><li> Zentrifuge dieZellsuspension bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Den Überstand entfernen und 10 ml frisches Medium zugeben. Noch zweimal unter den gleichen Bedingungen zentrifugieren </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie ein neues Medium hinzu, so dass die Zellkonzentration 5 x 10 &amp; sup5; Zellen / ml ergibt (bestimmt durch Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers). Mischen Sie gut durch sanftes Pipettieren. </li><li> Verteilen Sie die Zellsuspension in Zellkulturschalen. Verwenden Sie 3 ml pro 60 mm Durchmesser Kulturschale. HINWEIS: Diese Kultur heißt Durchgangsnull (P0). </li><li> Halten Sie die Zellen in einem 5% CO 2 -Inkubator bei 37 ° C. Ändern Sie die Hälfte des konditionierten Mediums zu jedem zweiten Tag auf frisches Medium. </li><li> Subkultur (Schritt 1.2), wenn es konfluent wird. </li></ol></li><li> Subkultur der RPE-Zellkultur <ol><li> Das Kulturmedium entfernen und die Zellen zweimal mit PBS (-) spülen. </li><li> Inkubieren der Zellen mit PBS (-) - Lösung mit 0,05% Trypsin + 0,2% EDTA iNa 5% CO 2 -Inkubator bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Die RPE-Zellen werden durch sanftes Pipettieren abgetrennt und die Zellsuspension in einem konischen Röhrchen, gefüllt mit 10 ml Kulturmedium, einschließlich 10% Schweineserum, gesammelt. </li><li> Die Zellsuspension bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie ein neues Kulturmedium hinzu, wodurch die Zellkonzentration 5 x 10 5 Zellen / ml (bestimmt durch Zählen der Zellzahl mit einem Hämocytometer). Verteilen Sie die Zellen in neuen Kulturschalen von 60 mm Durchmesser, wie in Schritt 1.1.13 beschrieben. HINWEIS: Die Zellkultur ist nun Passage 1 (P1). </li><li> Nachdem die Konfluenz erreicht ist, subkultur die P1-Kultur zu P2, unter Verwendung des gleichen Verfahrens, wie in den Schritten 1.2.1-1.2.5 beschrieben. Aus der P2-Kultur werden die Zellen auf kleineren Kulturschalen (30 mm Innendurchmesser) anstelle von 60 mm Durchmesser Kulturschalen gesät. </li><li> Für die Experimente verwenden Sie P2- oder P3-Kulturen. </li></ol></li></ol> 2. ThulIum Laser Bestrahlung <ol><li> Aufbau der Bestrahlungsstation <ol><li> Verbinden Sie eine Thulium-Laservorrichtung (1,94 μm, Leistungsbereich: 0-20 W) mit einer 0,22-NA, 365 μm Kerndurchmesser-Faser. </li><li> Mechanische Befestigung der Faserspitze an dem Metallarm, der horizontal an der vertikalen Metallpfosten der Bestrahlungsstation befestigt ist. Setzen Sie den senkrechten Pfosten so ein, dass sich die Spitze der Laserfaser oberhalb der heißen Platte befindet, auf der die Zellkulturschale während der Bestrahlung platziert werden soll. </li><li> Legen Sie ein weißes Papier auf die heiße Platte und drehen Sie den Zielstrahl auf (λ = 635 nm, max = 1 mW, Durchmesser auf Papierniveau ≈ 30 mm). Markieren Sie den Umfang des Zielstrahls auf dem weißen Papier, so dass die Position, wo die Kulturschale während der Bestrahlung platziert werden soll, bekannt ist. HINWEIS: Die z-Ebene der Faserspitze kann veränderbar sein. Ohne jede zusätzliche Abbildungsoptik wurde der Laserfleckdurchmesser auf der Zellkulturebene, 12 cm unterhalb der Faserspitze, angeordnetS etwa 30 mm, was fast dem Innendurchmesser der Zellkulturschale entspricht. Eine schematische Darstellung des Aufbaus ist in Abbildung 1 dargestellt . </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Thulium-Laser-Bestrahlungsstation. Eine Kulturschale wird auf die Heizplatte gelegt. Die Zellen werden 12 cm unterhalb der Thulium-Laserfaserspitze platziert, so dass die Strahlgröße nahezu identisch mit dem Innendurchmesser der Kulturschale (ca. 30 mm) ist. Der Laserbestrahlungsvorgang wird durch eine zeitgesteuerte Routine der maßgeschneiderten Systemdesignplattform gesteuert. Die Leistungseinstellung muss vor dem Start des Bestrahlungsprogramms ermittelt werden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <olstart> Laserbestrahlung der Zellkultur <ol><li> 1 h vor der Bestrahlung, ersetzen Sie das Kulturmedium vollständig mit 1,2 mL frischem Medium. HINWEIS: Dies ist ein CRITICAL STEP und muss unbedingt eingehalten werden. </li><li> Legen Sie die Bestrahlungsstation ( dh die Heizplatte und den Pfosten, mit dem die Laserfaser fixiert werden soll) auf eine saubere Bank. </li><li> Entfernen Sie die Zellkulturschale aus dem Inkubator und legen Sie sie auf die markierte Position auf der Heizplatte (Schritt 2.1.3). </li><li> Schutzbrille tragen. Schalte den Thulium-Laser ein. Stellen Sie die Leistung wie gewünscht auf die Laservorrichtung ein (einstellbar von 0 - 20 W). Schalte die Emission ein. </li><li> Starten Sie eine System-Design-Plattform, die die Laser-Bestrahlung und Timing-Protokoll (ergänzende Datei) steuert. </li><li> Unmittelbar nach dem Auflegen der Kulturschale auf die Heizplatte klicken Sie auf die "Vorheizzeit", um den Timer für 140 s zu starten ("Vorheizzeit 1"); Dies wird die Kultur Mitteltemperatur bei 3 halten7 ° C vor der Bestrahlung HINWEIS: Nach 140 s schaltet sich ein Signalton ein, und der nächste Timer ("Vorheizzeit 2") startet automatisch 8 s. Während dieser 8 s kann der Prüfer die Kulturschale öffnen. Nach 148 s Vorheizen wird eine 10-s-lange Laserbestrahlung auf die Zellkultur automatisch durchgeführt. Im Notfall rüsten Sie das Lasergerät mit einer Kraft-Taste aus, um den Laser sofort zu stoppen. Dies ist ein KRITISCHER SCHRITT und muss unbedingt eingehalten werden. Ein besonderer Vorsicht ist die Öffnung der Abdeckung der Schale kurz vor der Bestrahlung, zu Beginn der 8-s-Vorheizzeit. Das Öffnen der Abdeckung kann die mittlere Oberfläche sehr schnell abkühlen. </li><li> Nach der Bestrahlung sofort die Deckel wieder auf die Kulturschale legen, die Kulturschale auf die Heizplatte für weitere 7 s ablassen und in den 5% CO 2 -Inkubator bei 37 ° C zurücklegen. </li></ol><li> Messung der Temperaturverteilung an derZellulärer Pegel (Temperaturkalibrierung) <ol><li> Machen Sie kleine Löcher (ca. 300 μm Durchmesser) in der Nähe des Bodens auf vier Seiten (alle 90 °) einer 30 mm Durchmesser Kulturschale (ohne Zellen); Benutzen Sie die Spitze einer Nadel (20G), die mit einem Bunsenbrenner erwärmt wird. Die Löcher mit dem elektrischen Isolationsband von außen abdichten und ein kleines Loch mit einer feinen Nadel herstellen, so dass nur ein feines Thermoelement (200 μm Durchmesser) durch dieses Loch unter wasserdichten Bedingungen eingeführt werden kann. </li><li> An der Außenseite des Kulturschalenbodens 2 senkrechte Durchmesser zeichnen und den Kreuzungspunkt ( dh die Mitte der Unterseite) als Koordinaten Null (0) einstellen. Markieren Sie alle 3 mm radial nach außen aus der Schale ( dh 0, 3, 6, 9, 12 und 15 mm) in jede Richtung entlang der Linien ( Abbildung 2 , blaue Punkte); Die Anzahl der Punkte sollte insgesamt 21 sein. </li><li> Füllen Sie die Zellkultur mit 1,2 ml neuem Kulturmedium. Lege die Kultur dAuf eine heiße Platte bei 37 ° C aufsetzen, ein feines Thermoelement (200 μm Durchmesser) in das Seitenloch einführen und die empfindliche Spitze auf eine markierte Position bringen, die gemessen werden soll. </li><li> Schutzbrille tragen. Schalte den Thulium-Laser ein und schalte manuell die Leistung ein (zwischen 0 und 20 W, in 0,1-W-Schritten) des Lasers. HINWEIS: Für die Temperaturkalibrierung sollten Messungen mit der Leistung in Schritten von 3 W ausreichen. </li><li> Schalten Sie die System-Design-Plattform ein und klicken Sie auf die Schaltfläche "Tempo erhöhen" (Zusatzdatei), um die Temperaturmessung zu starten. </li><li> Gleiches Vorgehen wie in Schritt 2.2.6 durchführen. HINWEIS: Das Steuerprogramm misst die Temperatur des eingesetzten Thermoelements alle 100 ms und zeigt den Temperaturverlauf während der Bestrahlung im GUI. </li><li> Führen Sie diese Verfahren für alle 21 Messpunkte und bei verschiedenen Leistungseinstellungen durch. Wiederholen Sie die ganze Prozedur dreimal für alle Punkte und für alle Macht einzahlenGs zuverlässige Daten zu erhalten. </li><li> Exportieren Sie die Temperaturdaten als CSV-Daten, die eventuell in eine Tabellenkalkulation konvertiert werden können. Durchschnitt die maximale Temperatur am Ende der Bestrahlung für die dreifachen Messungen an jedem Punkt. Durchschnitt die Werte aus den Punkten auf dem gleichen Kreis (insgesamt 4 Punkte, außer dem Mittelpunkt). </li><li> Zeichnen Sie die erhaltene durchschnittliche maximale Temperatur auf einem Graphen, so dass der Abstand von der Mitte der Schale (mm) als x-Achse und der Temperaturerhöhung (ΔT, ° C) als y-Achse. Verwenden Sie die Fit-Funktion eines mathematischen Software-Programms, um ein Gauß-Modell an die Rohdaten anzupassen. Erstellen Sie eine Gaußsche Anpassung der Temperaturverteilung. </li></ol></li><img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig2.jpg"> Abbildung 2: Die Punkte für die Temperaturkalibrierung in einer Zellkultur Dish. Die Temperaturdaten wurden in der Mitte und bei 5 gemessenRadiale Punkte über 4 verschiedene Winkel (blaue Punkte). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 3. Biologische Assessments für Zellreaktionen nach verschiedenen thermischen Bestrahlungen <ol><li> Beurteilung der Zelllebensfähigkeit ( dh leben, apoptotisch und tot) nach verschiedenen Leistungseinstellungen und der Bestimmung der Zelltodschwelle <ol><li> Zu den angegebenen Zeitpunkten ( dh 3, 24 und 48 h nach der Bestrahlung) werden die Zellen mit PBS (-) gewaschen und ein handelsübliches Kit zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit ( dh vital, apoptotisch, tot) nach dem Hersteller verwendet Protokoll. </li><li> Eine Färbelösung durch Zugabe von 5 μl Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -Lanxin V, 5 μl Ethidiumhomodimer III und 5 μl Hoechst 33342 auf 100 μl 1x Bindungspuffer (alle sind KitKomponenten). Bereiten Sie genug Färbe-Lösung vor, um die Zellen zu bedecken. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min. </li><li> Die Zellkultur zweimal mit dem Bindungspuffer waschen, den Bindungspuffer durch PBS (-) ersetzen und die Kultur auf die Stufe eines Fluoreszenzmikroskops stellen. </li><li> Schalten Sie den Lichtweg auf die Okularlinse, wählen Sie den 4 ', 6-Diamidin-2-Phenylindol (DAPI) -Filter, schalten Sie das Beleuchtungslicht ein und finden Sie die fokussierte Ebene mit dem 4x-Objektiv. </li><li> Ändern Sie den Lichtweg zur Kamera, finden Sie das Bild auf dem Computerbildschirm in der Mikroskop-Imaging-Software und stellen Sie den Fokus ein. </li><li> Verwenden Sie die Stichfunktion ( dh die Funktion, um mehrere Bilder über die Schale aufzuzeichnen und dann ein einzelnes, großes Bild zu erzeugen) der mikroskopspezifischen Software, um das Fluoreszenzbild der gesamten Zellkulturschale zu erhalten. Verwenden Sie 3 verschiedene Filter-Sets - DAPI, FITC und Tetramethylrhodamin (TRITC) - zum Bild Hoechst 33342-positive Zellen (alle Zellkerne), FITC-Annexin V-PositiVe-Zellen (apoptotisch) und Ethidium-Homodimer-III-positiven Zellen (tot). </li><li> Messen Sie den Radius (mm) der toten (Ethidium-Homodimer-III-positiven) Region und den äußeren / inneren Radius der apoptotischen (Annexin-V-positiven) Bandform-Region in den gefärbten Zellkulturen. Tragen Sie diese Radien auf die passende Gaußsche Funktion der Temperaturverteilung für die entsprechende Leistungseinstellung an. Berechnen Sie die genaue Temperatur am Rand des toten oder apoptotischen Bereichs, um die Schwellentemperaturen für den Zelltod und die apoptotische Veränderung zu klären. </li></ol></li></ol></olstart>

<ol><li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+efficacy+of+pure+yellow+%28577-nm%29+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+%28561-577-nm%29+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li>
<li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+retina+therapy+%28SRT%29+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li>
<li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219(2012).</li>
<li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li>
<li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li>
<li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li>
<li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li>
<li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li>
<li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li>
<li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Optics%22%5BJournal%5D)">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li>
<li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Bei der Erörterung von temperaturbedingten biologischen Zellreaktionen ist nicht nur die Temperatur, sondern auch die Zeitdauer der erhöhten Temperatur von Bedeutung, da die meisten biochemischen Prozesse zeitabhängig sind. Besonders auf dem Gebiet der laserinduzierten Hyperthermie in der Ophthalmologie ist es aufgrund des kurzen Zeitbereichs - von Millisekunden bis zu Sekunden - schwierig, zelluläre thermische Effekte mit präziser Temperaturkontrolle zu untersuchen. Daher ist ein Laserbestrahlungsaufbau, der für das Ze...

Das Verständnis der temperaturabhängigen zellbiologischen Reaktionen ist für erfolgreiche Hyperthermie-Behandlungen von großer Bedeutung. Retinale Laser-Photokoagulation mit einem thermischen Laser, in der Ophthalmologie verwendet, ist eine der etabliertesten Laser-Behandlungen in der Medizin. Sichtbares Licht, meist von grün bis gelb Wellenlängen, wird in der Netzhaut Laserbehandlung verwendet. Das Licht wird durch das Melanin in retinalen Pigment-Epithel- (RPE-) Zellen stark absorbiert, die die äußerste Zellmonoschicht der Retina bilden. Es gab jüngstes Interesse bei Ärzten und Forschern in einer sehr milden thermischen Bestrahlung (sub-sichtbare Photokoagulation) als neue therapeutische Strategie für verschiedene Arten von Netzhautstörungen 1 , 2 . Nach diesem Trend liegt unser Interesse an der sub-letalen Erwärmung von RPE-Zellen unter präziser Temperaturregelung, einer Technik namens temperaturgesteuerte photothermische Therapie (TC-PTT). Neueste optoAkustiktechnologie aus unserem Institut hat die Echtzeitmessung von Temperaturerhöhungen an bestrahlten Stellen in der Netzhaut ermöglicht. Dies ermöglicht die Kontrolle über die Temperaturerhöhung während der Bestrahlung 3 . Da jedoch eine sub-letale Hyperthermie auf der Netzhaut, die durch das Erhitzen von RPE-Zellen sub-lethally verursacht wurde, bisher aufgrund der Unmöglichkeit der Messung und Kontrolle der Temperatur nicht berücksichtigt wurde, haben die temperaturabhängigen Zellreaktionen von RPE-Zellen nach der thermischen Laserbestrahlung Wurde bislang sehr wenig studiert. Darüber hinaus wurde nicht nur die Temperaturdifferenz nicht im Detail diskutiert, sondern auch der Unterschied im Zellverhalten der überlebenden Zellen nach sub-letaler und tödlicher Bestrahlung. Um wissenschaftliche Erkenntnisse über TC-PTT-basierte Behandlungen zu sammeln, wollen wir die temperaturabhängigen biologischen Reaktionen der RPE-Zelle und ihre Mechanismen unter Verwendung von in vitro- Versuchsaufbauten erläutern. Für tSein Zweck ist es notwendig, einen Zelle-Heizungsaufbau herzustellen, der die folgenden Bedingungen erfüllt: 1) eine Möglichkeit für schnelle Temperaturerhöhungen, 2) eine präzise kontrollierte Zeit und Temperatur und 3) eine relativ hohe Anzahl von untersuchten Zellen für biologische Experimente . Hinsichtlich des Heizverfahrens ist ein klinischer Laser, wie ein frequenzverdoppelter Nd.YAG-Laser (532 nm), leider für die Zellkulturerwärmung ungeeignet. Dies liegt an der stark reduzierten Anzahl von Melanosomen in kultivierten RPE-Zellen. Die Laserlichtabsorption könnte inhomogen sein, und die Temperaturerhöhung auf zellulärer Ebene ist zwischen den Experimenten variabel, auch wenn sie mit derselben Strahlungsleistung bestrahlt wird. Mehrere frühere Studien berichteten über die Verwendung von schwarzem Papier unter dem Tellerboden während der Bestrahlung 4 oder die Verwendung von zusätzlichen Melanosomen, die vor den Experimenten 5 , 6 durch die Kulturzellen phagozytiert werden. Viele vonDie in vitro biologischen Studien zur Beurteilung von hyperthermieinduzierten Zellreaktionen wurden unter Verwendung einer Kochplatte, eines Wasserbades oder eines CO 2 -Inkubators mit einer Temperatureinstellung 7 durchgeführt . Diese Verfahren erfordern eine lange Heizperiode, da es einige Zeit dauert ( dh mehrere Minuten), um die gewünschte Temperatur zu erreichen. Weiterhin ist es mit diesen Verfahren schwierig, auf zellulärer Ebene eine detaillierte thermische Geschichte ( dh Temperatur multipliziert mit der Zeit) zu erhalten. Darüber hinaus kann sich die Temperatur unter den Zellen an verschiedenen Positionen in einer Kulturschale aufgrund der variablen Temperaturdiffusion unterscheiden. In den meisten Fällen wurde diese zeitliche und räumliche Temperaturinformation während der Hyperthermie bei biologischen Analysen nicht berücksichtigt, obwohl die biologische Zellreaktion durch die Temperatur und die Zeitdauer der erhöhten Temperatur kritisch beeinflusst werden kann. Um diese Probleme zu überwinden,Dünnwellen-Thulium-Laser wurde hier verwendet, um die Zellen zu erhitzen. Die Thulium-Laserstrahlung (λ = 1,94 μm) wird stark von Wasser 8 absorbiert und die Zellen am Boden der Kulturschale werden ausschließlich durch thermische Diffusion thermisch stimuliert. Die Laserfaser mit einem Durchmesser von 365 μm ist etwa 12 cm über der Kulturschale, ohne jegliche Optik. Der Laserstrahldurchmesser divergiert so, dass er nahezu dem Innendurchmesser der Kulturschale (30 mm) an der Oberfläche des Kulturmediums entspricht. Mit einer konsistenten Menge an Kulturmedium ist es möglich, die Zellen mit der Temperaturerhöhung zu bestrahlen Von hoher Wiederholbarkeit. Variable Leistungseinstellungen ermöglichen die Bestrahlung mit bis zu 20 W und die mittlere Temperatur auf zellulärer Ebene kann bis zu ΔT ≈ 26 ° C in 10 s erhöht werden. Durch Modifizieren der Bestrahlungsbedingungen ist es auch möglich, das Laserstrahlprofil zu ändern, um die Temperaturverteilung zu variierenIn einer Kulturschale. So ist es beispielsweise möglich, mit einer Gauß-artigen Temperaturverteilung wie in der aktuellen Studie oder mit einer homogenen Temperaturverteilung zu untersuchen. Letzteres kann für die Untersuchung der Effekte von temperaturabhängigen Zellreaktionen genauer für subtotale Temperaturerhöhungen, aber nicht für Zelltodstress oder Wundheilungsreaktionen vorteilhaft sein. Insgesamt kann die Thulium-Laser-Bestrahlung die Untersuchung verschiedener Arten von biologischen Faktoren wie Gen / Protein-Expression, Zelltodkinetik, Zellproliferation und Zellfunktionalität nach verschiedenen thermischen Expositionen ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s Modifizierter Adler" s Medium - hoher Glukosegehalt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>Vor Gebrauch (2)-(4) hinzufügen. Warm bei 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>Antibiotische Antimykotische Lösung (100 & mal;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td>Enthält 10.000 Einheiten Penicillin, 10 mg Streptomycin und 25 μ; g Amphotericin B in 1 ml. Vor Gebrauch 5,5 ml in eine mittlere 500-ml-Flasche (1) geben.</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td>Vor Gebrauch 5,5 mL in einer 500 mL Flasche Medium (1) zugeben (Endkonzentration: 1 mM)</td></tr><tr><td>Schweineserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C-500ML</td> Vor <td>Gebrauch 50 mL in 500 mL Medium Flasche (1) zugeben (Endgültig: 10%)</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td></td></tr><tr><td>Humanes VEGF Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D System</td><td>DVE00</td><td></td></tr><tr><td>Oxiselect Total Glutathion Assay Kit</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>STA-312</td><td></td></tr><tr><td>Apoptotisches/nekrotisches/gesundes Zellnachweis-Kit</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA707-30018</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thulium laser</td><td>Starmedtec GmbH</td><td>Prototyp</td><td>0-20 W</td></tr><tr><td>365 mm Kerndurchmesser Faser</td><td>LASER COMPONENTS Germany</td><td>CF01493-52</td><td></td></tr><tr><td>Thermoelement</td><td>Omega Engineering Inc</td><td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>MEDAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader ( Spektrofluorometer)</td><td>Molecular Device</td><td>Spectramax M4</td><td></td></tr><tr><td>Zellhomogenisator</td><td>QIAGEN</td><td>TissueLyser LT</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ti</td><td></td></tr><tr><td>mathematisches Softwareprogramm</td><td>The Mathworks. Inc</td>. <td>MATLAB Release 2015b</td><td></td></tr><tr><td>Systemdesign-Plattform</td><td>National Instrument</td><td>Labview</td><td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td></tr></tbody></table>

ununterbrochener thulium-laser zum erwärmen von kultivierten zellen zur untersuchung zellulärer thermischer effekte

Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

Ein originelles Verfahren zur Erwärmung von kultivierten Zellen mit einem 1,94 μm kontinuierlichen Thulium-Laser für die biologische Beurteilung wird hier vorgestellt. Die Thulium-Laserstrahlung wird stark von Wasser absorbiert und die Zellen am Boden der Kulturschale werden durch thermische Diffusion erwärmt. Eine Laserfaser mit einem Durchmesser von 365 μm wird etwa 12 cm oberhalb der Kulturschale ohne jegliche Optik eingestellt, so dass der Laserstrahldurchmesser nahezu dem Innendurchmesser der Kulturschale (30 mm) entspricht. Indem man in jedem Experiment eine konsistente Menge an Kulturmedium hält, ist es möglich, die Zellen mit einer hoch reproduzierbaren Temperaturerhöhung zu bestrahlen. Um die Temperaturerhöhung und ihre Verteilung in einer Zellkulturschale für jede Leistungseinstellung zu kalibrieren, wurde die Temperatur während 10 s der Bestrahlung an verschiedenen Positionen und auf zellulärer Ebene gemessen. Die Temperaturverteilung wurde mit einer mathematischen Grafiksoftware dargestelltProgramm, und sein Muster über die Kulturschale war in Gaußsche Form. Nach der Laserbestrahlung konnten verschiedene biologische Experimente durchgeführt werden, um temperaturabhängige Zellreaktionen zu bestimmen. In diesem Manuskript wird die Viabilitätsfärbung ( dh die Unterscheidung von lebenden, apoptotischen und toten Zellen) eingeführt, um die Schwellentemperaturen für die Zellapoptose und den Tod nach verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen. Die Vorteile dieser Methode sind die Präzision der Temperatur und die Zeit des Heizens sowie die hohe Effizienz bei Heizzellen in einer ganzen Zellkulturschale. Darüber hinaus ermöglicht es das Studium mit einer Vielzahl von Temperaturen und Zeitdauern, die durch ein computerisiertes Betriebssystem gut kontrolliert werden können.

Temperaturverteilung nach verschiedenen Leistungseinstellungen Alle Temperaturentwicklungen für jede einzelne Bestrahlung wurden bei der Temperaturkalibrierung überwacht. Aus diesen Daten wurde die maximale Temperatur am gemessenen Punkt erhalten und als T max (° C) definiert. Wie in Fig. 3A gezeigt , wurde das Programm zu dem Zeitpunkt ausgeführt, an dem die Kulturschale auf die Heizplatt...

Ein ursprünglicher experimenteller Aufbau zum Erwärmen von Zellen in einer Kulturschale unter Verwendung von 1,94 μm kontinuierlicher Laserstrahlung wird hier eingeführt. Mit dieser Methode können die biologischen Reaktionen von retinalen Pigmentepithel- (RPE) -Zellen nach unterschiedlichen thermischen Expositionen untersucht werden.

Ununterbrochener Thulium-Laser zum Erwärmen von kultivierten Zellen zur Untersuchung zellulärer thermischer Effekte

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, thermisch dosisabhängige zellbiologische Reaktionen in vitro zu untersuchen, indem kultivierte Zellen mit präziser Temperatur- und Zeitkontrolle erhitzt werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in Bereichen zu beantworten, die Zell- oder Gewebereaktionen auf Hyperthermie untersuchen, wie z. B. die Erforschung der retinalen Laserbehandlung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine schnelle Erwärmung der Zellen und eine präzise Kontrolle der Heizdauer, was eine hohe reproduzierbare thermische Belastung während der Experimente ermöglicht.Obwohl diese Methode einen Einblick in die Reaktionen von kultivierten retinalen Pigmentepithelzellen auf thermische Laserbestrahlung geben kann, kann sie auch auf andere Modelle wie Krebszellen angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir melaninhaltige Zellen mit sichtbarem Laserlicht erhitzten. Dies führte jedoch zu unterschiedlichen Temperaturprofilen aufgrund unterschiedlicher Pigmentierung.Um mit dem Verfahren zu beginnen, stellen Sie eine Heizplatte in einen verstellbaren Laborständer aus Metall auf eine saubere Bank. Stellen Sie die Kochplatte auf 39 Grad Cels

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir entwickelten neuartigen multifunktionalen Eigen nanovesicles porphysomes genannt, die strukturabhängigen Fluoreszenz Selbstlöschung und einzigartigen photothermischen Eigenschaften haben, so als potente photothermische Therapie Mittel. Wir formuliert porphysomes mit Hochdruckextrusion und untersucht ihre photothermische Therapie Wirksamkeit in einem Xenotransplantat-Tumor-Modell.

Eine Minute, Sub-One-Watt-Photothermische Tumor Ablation mit Porphysomes, Eigen Multifunktionale Nanovesicles

Ein MRI-kompatiblen maßgeschneiderten Laserbasis Heizvorrichtung wurde entwickelt, um eine lokale Erwärmung der subkutanen Tumoren um die Freisetzung von Wirkstoffen aus wärmeempfindlichen Liposomen gezielt an der Tumorregion aktivieren bereitzustellen.

Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung

Europium thenoyltrifluoroacetonate (EuTFC) eine optische lumineszenz Linie bei 612 nm, deren Aktivierungseffizienz sinkt stark mit der Temperatur. Wenn eine mit einem dünnen Film aus diesem Material beschichtete Probe Mikro abgebildet ist, kann die 612 nm lumineszenten Reaktionsintensität in eine direkte Karte von Probenoberflächentemperatur umgewandelt werden.

Hochauflösende Thermal Micro-Bildgebung Europiumchelatlösung Lumineszente Coatings

Diese Methode zielt darauf ab, vertikale Untergrunddefekte zu lokalisieren. Hier koppeln wir einen Laser mit einem räumlichen Lichtmodulator und lösen seinen Videoeingang aus, um eine Probenoberfläche deterministisch mit zwei anti-phased modulierten Linien zu erwärmen, während hochaufgelöste thermische Bilder aufgenommen werden. Die Fehlerposition wird von der Auswertung von thermischen Welleninterferenzminima abgerufen.

Untergrundfehler-Lokalisierung durch strukturierte Erwärmung mittels laserprojektierter photothermischer Thermografie

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Eisenoxid-Nanopartikel-Mikroblasen (NSMs) durch Selbstorganisation, synergisierende magnetische, akustische und optische Reaktionsfähigkeit in einer nanotherapeutischen Plattform für magnetische Hyperthermie und photothermische Kombinationskrebstherapie vorgestellt.

Magnetische, akustische und optische dreifach ansprechende Mikroblasen für magnetische Hyperthermie und pothotothermische Kombinationskrebstherapie

In dieser Studie wurden Er-, Cr:YSGG- und Diodenlaser separat auf die flache Oberfläche von insgesamt 96 speziell konstruierten Titanzylindern aufgebracht. Ein Thermoelement wurde auf die andere Oberfläche gelegt und die Temperatur gemessen. Analyse der Oberflächenrauheit mit Profilometer, REM und AFM.

In vitro Bewertung der Auswirkungen von Er-, Cr:YSGG- und Diodenlasern, die auf Titanzylinder verwendet werden

Dieses Protokoll stellt Techniken und Methoden vor, die für eine gezielte hyperthermische Therapie in soliden Tumormodellen erforderlich sind. Der Ansatz nutzt die photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumoral injizierte Goldnanostäbchen, um eine lokale Erwärmung innerhalb der Tumormikroumgebung zu induzieren.

Induktion gezielter milder Hyperthermie in murinen Tumormodellen durch photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumorale Gold-Nanostäbchen

Dieser Artikel stellt die Frequency Domain Thermoreflectance (FDTR)-Technik für lokale nichtdestruktive thermische Charakterisierung und Bildgebung vor.

Die Frequenzdomänen-Thermoreflexionstechnik für thermische Eigenschaftsmessungen

Die Wirkung von Substraten Steifigkeit auf die zelluläre Funktion modelliert werden...

Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

In diesem Video verwenden wir ein Adenovirus Durchführung der Cre-Rekombinase-Gen zur primären embryonalen Maus-Fibroblasten Tragen einer floxed Rac1 Allel zu infizieren.

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

Lernen Sie die Methode zum präzisen Erwärmen kultivierter Zellen mit einem 1,94 µm Thulium-Laser für thermische Dosis-Wirkungs-Studien. Diese Technik ermöglicht reproduzierbare Untersuchungen zellulärer Hyperthermie-Antworten.

Ununterbrochener Thulium-Laser zum Erwärmen von kultivierten Zellen zur Untersuchung zellulärer thermischer Effekte

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