Name: In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Untersuchung der kornealen Endothel-Mesenchym-Transition mit in-vitro- und in-vivo-Modellen. Diese Methode nutzt bovine Zellkulturen und Ratten-Kryoverletzungsmodelle zur Erforschung regenerativer Therapien.

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Wir danken den Mitarbeitern des Second Core Lab, Department of Medical Research, National Taiwan University Hospital für ihre technische Unterstützung.

Alle folgten die Verfahren in dieser Studie mit der Association for Research gewährt in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der National Taiwan University Hospital genehmigt. 1. Isolierung, Primärkultur Vorbereitung, und Immunfärbung von Bovine MEL <ol><li> Erwerben Sie frische Rinderaugen von einem lokalen Schlachthof. </li><li> Desinfizieren der Augen in einer 10% w / v Povidon-Iod-Lösung für 3 min. Wasche sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Lösung. </li><li> Ernten Sie die Hornhaut-Taste mit einem Skalpell und Schere unter sterilen Bedingungen. Ziehen Sie die Descemet-Membran mit einer Pinzette unter einem Binokular (beachten Sie, dass in dieser Studie wurden die Rinderaugen von einem örtlichen Schlachthof entkernte, daher ist die erste Studie Verfahren war die Desinfektion der preenucleated Augen im Labor). </li><li> Inkubieren der Membran Descemet in 1 ml tryPSIN bei 37 ° C für 30 min. Sammeln Sie die Rinder MEL durch Zentrifugation bei 112 × g für 5 min. Resuspendieren der Zellen in 1 ml supplementiert hormonellen epithelial Medium (SHEM) gleiche Volumina von HEPES-gepufferter Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium und Ham-F12-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 0,5% Dimethylsulfoxid, 2 ng / ml des humanen epidermalen Wachstumsfaktor, 5 mg / ml Insulin, 5 mg / ml Transferrin, 5 ng / ml Selen, 1 nmol / l des Choleratoxins, 50 mg / ml Gentamicin und 1,25 mg / ml Amphotericin B. </li><li> Seed die Zellen (etwa 1 x 10 5 Zellen pro Auge) in eine 6 cm Schale. Kultur sie in der SHEM. Inkubiere die Schale bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 in Luft. Ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage. </li><li> Wenn die Zellen Konfluenz erreichen, waschen Sie sie in PBS und Inkubation sie in 1 ml Trypsin bei 37 ° C für 5 min. Sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 112 × g für 5 min. Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml des SHEM. <ol&gt; <li> Zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer. Seed die Zellen auf Deckgläser mit einer Dichte von 1 x 10 4 pro Well in einer 24-Well - Platte und Kultur die Zellen in der SHEM. die ENMT Unterdrückungseffekt von Marimastat zur Untersuchung, inkubiere die Zellen in SHEM mit 10 uM Marimastat in das Kulturmedium gegeben, und das Kulturmedium alle 3 Tage. </li></ol></li><li> Fixieren Sie die Zellen in einem angegebenen Zeitpunkt mit 250 ul 4% Paraformaldehyd, pH 7,4, für 30 min bei Raumtemperatur. Permeabilisieren mit 250 ul 0,5% Triton X-100 5 min. Block mit 10% Rinderserumalbumin für 30 min. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern gegen aktive Beta-Catenin (ABC), Schnecke und Schnecke über Nacht bei 4 ° C. Die Verdünnung der primären Antikörpern verwendet wird, ist 1: 200. Die Antikörper werden in Antikörperverdünnungslösung, bestehend aus 10 mM PBS, 1% w / v Rinderserumalbumin und 0,09% w / v Natriumazid verdünnt. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für 15 min und Inkubation derm mit dem Alexa Fluor-konjugiertem sekundärem Antikörper (1: 100 in Antikörperverdünnungsmittel) bei Raumtemperatur für 1 Std. </li><li> Counterstain den Zellkern, indem die Zellen mit 2 &amp; mgr; g / ml 4 abdeckt &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für 15 Minuten, und montieren sie mit Anti-Fading-Montagelösung. </li><li> Erhalten Immunofluoreszenz Bilder bei den Anregungswellenlängen von 405 und 488 nm durch ein Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop mit 20X Objektivvergrößerung verwendet. </li></ol> 2. Rat Korneaendothelium cryoinjury Modell und intrakamerale Injection <ol><li> Anästhesieren 12 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley Ratten mit intramuskulären Injektionen von 2% Xylazin (5,6 mg / kg) und Tiletamin und Zolazepam (18 mg / kg). kneifen sanft die Haut der Tiere geeignete Anästhesie in Abwesenheit von Haut Zucken zu bestätigen. </li><li> Flößen Sie einen Tropfen von 0,5% Proparacainhydrochlorid dem rechten Auge jeder Ratte Augenschmerzen und Blinzelreflex zu minimieren. einflößenTetracyclin-Salbe auf das linke Auge kornealen Trockenheit zu verhindern. </li><li> Kühlen Sie eine Sonde aus rostfreiem Stahl (Durchmesser = 3 mm) in flüssigem Stickstoff. Tragen Sie die Sonde aus rostfreiem Stahl an die zentrale Hornhaut des rechten Auges für 30 Sekunden. Häufig PBS für das rechte Auge während des Verfahrens zu vermitteln kornealen Trockenheit zu verhindern. </li><li> Instill 0,1% Atropin und 0,3% Gentamicinsulfat unmittelbar nach cryoinjury und einmal täglich Augenschmerzen zu lindern von Ziliarspasmus ergeb und Infektion zu verhindern. <ol><li> Nach dem Eingriff halten die Ratten mit einer Heizlampe erwärmen und ihre Genesung alle 15 Minuten nach der Narkose zu beobachten, bis sie Motor wieder die Kontrolle. Zusätzlich Tetracyclin-Salbe auf das rechte Auge gelten für Hornhauttrockenheit während der Erholungsphase zu verhindern. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Hornhaut cryoinjury für 3 aufeinander folgenden Tagen. </li><li> Für die Bereitstellung von Marimastat oder bFGF in die vordere Kammer des Rattenaugen, anästhesieren die Ratten, wie vorher beschrieben. Flößen Sie einen Tropfenvon 0,5% Proparacainhydrochlorid in das rechte Auge Augenschmerzen und Blinzelreflex zu minimieren. </li><li> Spülen Sie die Augenoberfläche mit sterilem PBS. Führen Vorderkammer Parazentese unter einem Operationsmikroskop mit einer 30 G-Nadel in eine 1 ml Spritze am paralimbal klare Hornhaut in einer Ebene oberhalb und parallel zu der Iris befestigt Einsetzen. </li><li> Drehen Sie die Nadel Schräge nach oben, und drücken Sie leicht die Hornhautwunde etwas wässrigen Humor und reduzieren den intraokularen Druck abzulassen. Injizieren 0,02 ml des intrakameral Droge. Vorsichtig komprimieren während der Nadel Rückzug der Nadel-Darm-Trakt mit einem Wattestäbchen. </li><li> Fotografieren Sie das äußere Auge bei einer angegebenen Zeitpunkt unter dem Operationsmikroskop. </li></ol> 3. Ernten der Ratte Corneal Knopf und Immunostaining <ol><li> Um die Ratten einschläfern, legen Sie sie in einer Euthanasie Kammer und ziehen lassen 100% CO 2 bei einer Füllrate von 10 bis 30% des Kammervolumens pro Minute. Pflegen CO 2 Infusion für eineweitere Minute nach mangelnder Atmung und verblasste Augenfarbe. </li><li> Dringen die Ratte Auge am Limbus mit einer scharfen Klinge. Schneiden Sie die Hornhaut mit Hornhaut-Schere entlang des Limbus. Flatten die Cornea auf einer Folie. Nehmen Sie zusätzliche radiale Einschnitte, wenn die Cornea einrollen. </li><li> Fix die Cornea mit 250 ul 4% Paraformaldehyd, pH 7,4, für 30 min bei Raumtemperatur. Permeabilisieren mit 250 ul 0,5% Triton X-100 für 5 min, und der Block mit 10% Rinderserumalbumin für 30 min. </li><li> Inkubieren der Kornea mit primären Antikörpern gegen ABC über Nacht bei 4 ° C mit einer Verdünnung von 1: 200 in Antikörperverdünnungsmittel. Waschen Sie die Cornea zweimal mit PBS für 15 min, und inkubieren sie mit dem sekundären Antikörper (1: 100 in Antikörperverdünnungsmittel) bei Raumtemperatur für 1 Std. Counterstain den Zellkern, indem die Zellen mit 2 &amp; mgr; g / ml 4 abdeckt &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol und die Zellen zweimal waschen mit PBS für 15 min. </li><li> Montieren Sie die Cornea in der Anti-Fading-Montagelösung. ObTain die Immunfluoreszenz-Bilder bei Anregungswellenlängen von 405 und 561 nm mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop bei 20facher Objektivvergrößerung. </li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen zu deklarieren.

CECs sind für ihre Neigung bekannt ENMT während der Zellproliferation zu unterziehen. Entwicklung von Strategien zur Unterdrückung des ENMT Prozess zu therapeutischen Zwecken, ein gründliches Verständnis der ENMT Mechanismus notwendig. Wir 2 beschriebenen Modelle ENMT, nämlich die Rinder-CEC in - vitro - Kulturmodell und Ratte Korneaendothelium cryoinjury Modell zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten die ENMT Prozess in beiden Modellen. Darüber hinaus wurde die ENMT Unterdrückungseffekt von Marimast...

Hornhaut-Endothelzellen (CECs) spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Klarheit der Hornhaut und damit der Sehschärfe, indem sie den Hydratationsstatus des Hornhautstromas durch aktives Pumpen regulieren1. Aufgrund des begrenzten proliferativen Potenzials menschlicher CECs nimmt die Zellzahl mit zunehmendem Alter ab, und die Reparatur von Hornhautendothelwunden nach einer Verletzung wird in der Regel durch Zellvergrößerung und -migration und nicht durch Zellmitose erreicht2. Wenn die CEC-Zahl unter einen Schwellenwert von etwa 500 Zellen/mmsinkt 2, kann der Dehydratisierungsstatus des Hornhautstromas nicht aufrechterhalten werden, was zu einer bullösen Keratopathie und einer Beeinträchtigung des Sehvermögens führt3,4.
Das begrenzte proliferative Potenzial menschlicher CECs wurde auf mehrere Faktoren zurückgeführt, einschließlich der verminderten Expression des epidermalen Wachstumsfaktors und seines Rezeptors in alternden Zellen5, des antiproliferativen TGFβ2 im Kammerwasser6 und der Kontakthemmung2,7. Obwohl einige Wachstumsfaktoren, wie z. B. der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), die Proliferation in einem kultivierten menschlichen Hornhautendothel erhöhen können, bleibt die Kultureffizienz begrenzt8,9. Darüber hinaus können CECs während der ex vivo-Expansion eine phänotypische Veränderung erfahren, die der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) ähnelt10-13. Die endothelial-mesenchymale Transition (EnMT) ist gekennzeichnet durch die Destabilisierung der Zellübergänge, den Verlust der apikal-basalen Polarität, die Umlagerung des Zytoskeletts, die Expression von Alpha-Aktinen der glatten Muskulatur und die Kollagensekretion vom Typ I14. All diese Merkmale können die normale Funktion von KEK beeinträchtigen und die Verwendung von ex vivo kultivierten KEK in der Gewebezüchtung behindern. Darüber hinaus wurde EnMT mit der Pathogenese mehrerer Hornhautendothelerkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich der Fuchs-Endotheldystrophie und der retrokornealen Membranbildung15,16. Daher kann das Verständnis des Mechanismus von EnMT bei der Manipulation des EnMT-Prozesses helfen und die Regeneration von CECs erleichtern, um eine kompetente Funktion zu ermöglichen. 
In dieser Studie haben wir eine Methode zur Isolierung von Rinder-CECs aus dem Hornhautknopf beschrieben. In der Primärkultur in vitro wurde der EnMT-Prozess, einschließlich einer phänotypischen Veränderung, der nukleären Translokation von β-Catenin und der EMT-Regulatoren Schnecke und Schnecke, beobachtet. Des Weiteren haben wir eine Methode zum Nachweis von EnMT in vivo unter Verwendung eines Kryoverletzungsmodells für Hornhautendothel bei Ratten beschrieben. Anhand dieser 2 Modelle konnten wir zeigen, dass Marimastat, ein Breitspektrum-Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Inhibitor, den EnMT-Prozess unterdrücken kann. Die beschriebenen Protokolle erleichtern die detaillierte Analyse des EnMT-Mechanismus und die Entwicklung von Strategien zur Manipulation des EnMT-Prozesses für die weitere klinische Anwendung.

<table><tbody><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifiziertes Eagle-Medium und Ham's F12-Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>humaner epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, Transferrin, Selen & nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Choleratoxin</td><td>Sigma</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>111219</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr>, <tr><td>Marimastat</td><td>Sigma</td><td>M2699-25MG</td><td></td></tr><tr><td>antiaktiver Beta-Catenin-Antikörper</td><td>Millpore</td><td>05-665</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Schnecken-Antikörper</td><td>Santa cruz</td><td>sc28199</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Schnecken-Antikörper</td><td>Santa cruz</td><td>sc15391</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) sekundär Antikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>für die Färbung von ABC von Rindern,</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L), Sekundärantikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11003</td><td>für die Färbung von ABC von Ratten, Hornhautendothel</td></tr><tr><td>, Ziege Anti-Kaninchen-IgG (H+L), Sekundärantikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>für die Färbung von Schnecken und Nacktschnecken von Rindern, CECs,</td></tr><tr><td>Antikörperverdünnungsmittel</td><td>Genemed Biotechnologies</td><td>10-0001</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Einbettmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin &</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tiletamin plus Zolazepam</td><td>Virbac</td><td>N/A</td><td>Tierarzneimittel</td></tr><tr><td>Proparacainhydrochlorid ophthalmische Lösung</td><td>Alcon</td><td>N/A</td><td>Tierarzneimittel</td></tr><tr><td>0,1% Atropin</td><td>Wu-Fu Laboratories Co., Ltd</td><td>N/A</td><td>klinisches Medikament&nbsp;</td></tr><tr><td>0,3% Gentamicinsulfat</td><td>Sinphar Group</td><td>N/A</td><td>klinisches Medikament&nbsp;</td></tr><tr><td>basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>klinisches Medikament&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro und in vivo modelle corneal endothelial-mesenchymale transition zu studieren

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Hornhaut-Endothelzellen (CECs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Klarheit der Hornhaut durch aktives Pumpen. Eine verminderte KEK-Zahl kann zu Hornhautödemen und verminderter Sehschärfe führen. Humane KEK sind jedoch anfällig für ein beeinträchtigtes proliferatives Potenzial. Darüber hinaus wird die Stimulation des Zellwachstums oft durch einen allmählichen endothelial-mesenchymalen Übergang (EnMT) erschwert. Daher ist das Verständnis des Mechanismus von EnMT notwendig, um die Regeneration von CECs mit kompetenter Funktion zu erleichtern. In dieser Studie stellten wir eine Primärkultur von Rinder-CECs her, indem wir die CECs mit Descemet-Membran vom Hornhautknopf schälten und zeigten, dass bovine CECs in der In-vitro-Kultur den EnMT-Prozess zeigten, einschließlich phänotypischer Veränderung, nukleärer Translokation von β-Catenin und EMT-Regulatoren Schnecke und Schnecke. Darüber hinaus verwendeten wir ein Kryoverletzungsmodell für Hornhautendothel von Ratten, um den EnMT-Prozess in vivo zu demonstrieren. Insgesamt bietet die in vitro Primärkultur von Rinder-CECs und in vivo Kryoverletzungsmodelle für das Hornhautendothel von Ratten nützliche Plattformen für die Untersuchung des Mechanismus von EnMT.

Nach der Isolierung von Rinder-MEL wurden die Zellen in vitro kultiviert. Abbildung 1 zeigt die Phasenkontrastbilder der Rinder-MEL. Die hexagonale Form der Zellen bei Konfluenz angedeutet , dass die Zellen durch Fibroblasten während der Zellisolierung Hornhaut Stroma nicht kontaminiert wurden. Abbildung 2 zeigt die Immunfärbung , die Antikörper gegen ABC, Schnecke und Schnecke mit in einem angegebenen Zeitpunkt durchgeführt wurde. Abgesehen von...

Eine Primärkultur von Rinder Endothelzellen wurde verwendet, um den Mechanismus der Cornea-Endothelzellen-mesenchymale Transition zu untersuchen. Weiterhin wurde eine Ratte Hornhautendothel cryoinjury Modell kornealen Endothel-mesenchymale Transition in vivo zu demonstrieren.

In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Mechanismus der kornealen endothelialen-mesenchymalen Transition in vitro und in vivo zu untersuchen. Diese Methode kann dabei helfen, Fragen zur kornealen endothelialen-mesenchymalen Transition im Bereich der Regeneration des kornealen Endothels zu beantworten. Der Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie sowohl auf in-vitro- als auch auf in-vivo-Modellen angewendet werden kann.Und ist leicht zu manipulieren. Die Bedeutung dieser Technik liegt in der Therapie von Erkrankungen, die mit der kornealen endothelialen mesenchymalen Transition assoziiert sind. Beispielsweise die Entstehung solcher Erkrankungen, da die Modelle genutzt werden können, um Substanzen auszuwählen, die den Prozess der kornealen endothelialen mesenchymalen Transition hemmen.Das Verfahren wird von Jung-Shen Chang, einem Techniker aus einem Labor, durchgeführt. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie frische Rinder-Augen drei Minuten lang in einer 10 %iger (Gewicht pro Volumen) Povidone-Jod-Lösung desinfizieren. Anschließend spülen Sie sie mit PBS ab.Entnehmen Sie die Hornhautscheibe mit einem Skalpell und einer Schere und waschen Sie sie mit PBS. Unter einem Stereomikroskop lösen Sie die Descemet-Membran mit einer Pinzette ab. Anschließend inkubieren Sie die Descemet-Membran in einem Milliliter Trypsin bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Danach gewinnen Sie die bovinen CECs durch Zentrifugation bei 112 × g für fünf Minuten.Nach der Zentrifugation die Zellen in einem Milliliter SHEM erneut suspendieren. Die Zellen in einer 6 cm-Dish ansäen und in SHEM kultivieren. Anschließend die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 inkubieren und das Kulturmedium alle drei Tage wechseln.Wenn die Zellen Konfluenz erreicht haben, waschen Sie sie mit PBS. Anschließend inkubieren Sie sie in einem Millimeter Trypsin bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 112 × g für fünf Minuten.Nach fünf Minuten das Zellpellet in einem Milliliter SHEM erneut suspendieren. Anschließend die Zellen in einem Hämozytometer zählen. Danach die Zellen auf Deckgläsern in einer 24-Loch-Platte aussäen und in SHEM kultivieren.Um den ENMT-supprimierenden Effekt von Maramastat zu untersuchen, inkubieren Sie die Zellen in SHEM mit 10 µM Maramastat im Kulturmedium und wechseln Sie das Kulturmedium alle drei Tage. Fixieren Sie anschließend die Zellen zu einem angegebenen Zeitpunkt mit 250 µL 4 % Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Danach permeabilisieren Sie sie mit 250 µL 0,5 % Triton X-100 für fünf Minuten.Und blockieren Sie sie mit 10 % BSA für 30 Minuten. Anschließend inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius mit primären Antikörpern gegen ABC, Snail und Slug. Am nächsten Tag waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, jeweils 15 Minuten lang.Und inkubieren Sie sie mit dem Alexa Fluor-konjugierten sekundären Antikörper eine Stunde bei Raumtemperatur. Danach färben Sie den Zellkern durch Zugabe von DAPI (zwei Mikrogramm pro Milliliter) als Gegenfärbung. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, jeweils 15 Minuten.Und montieren Sie sie mit einer Anti-Fade-Montierlösung, bevor Sie die immunfluoreszenten Bilder aufnehmen. Nachdem Sie eine 12 Wochen alten männlichen SD-Ratte anästhesiert haben, ziehen Sie vorsichtig an der Haut des Tieres, um die korrekte Anästhesie bei fehlendem Hautzucken zu bestätigen. Anschließend geben Sie einen Tropfen 0,5 %iges Proparakain-Hydrochlorid auf das rechte Auge der Ratte, um Schmerzen und den Lidschlagreflex zu minimieren.Anschließend Tetracyclin-Salbe auf das linke Auge auftragen, um eine Hornhauttrockenheit zu verhindern. Danach eine Edelstahlsonde in flüssigem Stickstoff abkühlen. Die Edelstahlsonde 30 Sekunden lang auf die zentrale Hornhaut des rechten Auges auflegen.Während des Eingriffs PBS mehrmals in das rechte Auge einträufeln, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern, und unmittelbar nach der Kryoverletzung einmal täglich 0,1 % Atropin und 0,3 % Gentamicinsulfat applizieren, um ocularer Schmerzen infolge eines Ziliarspasmus entgegenzuwirken und Infektionen vorzubeugen. Nach dem Eingriff die Ratte mit einer Wärmelampe warm halten und die Erholung beobachten, bis die motorische Kontrolle wiederhergestellt ist. Tetracylin-Salbe auf das rechte Auge auftragen, um eine Austrocknung der Hornhaut während der Erholungsphase zu verhindern, und die Hornhaut-Kryoverletzung an drei aufeinanderfolgenden Tagen wiederholen.Um Maramastat oder basisches FGF in die vordere Augenkammer von Rattenaugen zu applizieren, geben Sie einen Tropfen 0,5 %iges Proparakain-Hydrochlorid auf das rechte Auge der anästhesierten Ratte, um Schmerzen und den Lidschlagreflex zu minimieren. Spülen Sie anschließend die okulare Oberfläche mit steriler PBS-Lösung aus. Führen Sie unter einem Operationsmikroskop eine Parazentese der vorderen Kammer durch, indem Sie eine 30-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, in der paralimbischen klaren Hornhaut in einer Ebene oberhalb und parallel zur Iris einführen. Drehen Sie dann die Nadel so, dass die Schräge nach oben zeigt, und drücken Sie leicht auf die Hornhautwunde, um etwas Kammerwasser abfließen zu lassen und den intraokularen Druck zu senken.Injizieren Sie 0,02 Milliliter des Wirkstoffs intrakamerell und drücken Sie vorsichtig die Nadelbahn mit einem Wattestäbchen ab, während die Nadel zurückgezogen wird. Diese Abbildung zeigt die Phasenkontrastbilder der bovinen CECs und Kulturen. Die hexagonale Form der Zellen bei Confluenz zeigt an, dass die Zellen während der Zellisolierung nicht mit kornealen Stromafibroblasten verunreinigt wurden.Während der In-vitro-Kultur von bovinen CECs wurde die nukleäre Translokation von ABC, Snail und Slug bis zum Tag 14 nachgewiesen. Diese Abbildung veranschaulicht die Wirkung von Maramastat, einem MMP-Inhibitor mit breitem Wirkungsspektrum, auf den ENMT-Prozess der in vitro kultivierten bovinen CECs. Dargestellt sind hier die Fotos des äußeren Auges von Ratten nach einer Kryoverletzung, gefolgt von einer intrakameralen Injektion.Die Aufnahmen zeigen eine verminderte Hornhautödembildung nach Injektion von basischem FGF. Maramastat verringerte die Hornhautödembildung im Vergleich zum alleinigen basischen FGF noch weiter. Diese Abbildung zeigt die Immunfärbung der raten Hornhautscheibe mit einem Antikörper gegen ABC nach Kryoverletzung, gefolgt von einer intrakameralen Injektion.Die nukleäre Translokation von ABC wird in der PBS-Gruppe beobachtet und ist in der basischen FGF-Gruppe signifikant erhöht, was auf eine Aktivierung der Wnt-Beta-Catenin-Signalgebung und des ENMT-Prozesses hinweist. Nach intrakammeraler Injektion von basischem FGF gefolgt von Maramastat ist die nukleäre Färbung von ABC vermindert, was auf die ENMT-hemmende Wirkung von Maramastat schließen lässt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Hornhautendothel-Mesenchymal-Transition in vitro und in vivo.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bovine Hornhautendothelzellen isoliert sowie eine Hornhaut-Kryoverletzung und eine intrakamerale Injektion durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Das Protokoll beschreibt die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt.

Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen

Mäuse wurden als Modell für die Untersuchung vieler Formen der Transplantation verwendet, einschließlich der Hornhauttransplantation.  In diesem Bericht beschreiben wir ein Mausmodell sowohl für die akute als auch für die späte Hornhauttransplantation.

Murine Hornhauttransplantation: Ein Modell, das die häufigste Form der Organtransplantation Studieren

Der Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT) ermöglicht es Krebserkrankungen, invasiv zu werden. Zur Untersuchung der EMT wird ein auf neuralen Stammzellen (NSC) basierendes In-vitro-Modell beschrieben, das frei von Serum und Enzymen ist. Dieses standardisierte System ermöglicht die quantitative und qualitative Bewertung der Zellmigration, der Gen- und Proteinexpression. Das Modell eignet sich für die Wirkstoffforschung.

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige dreidimensionale in-vitro- Modell, wo Stromazellen Hornhautzellen und differenzierten neuronalen Zellen zusammen kultiviert werden, bei der Untersuchung und das Verständnis der Wechselwirkungen der beiden Zelltypen zu unterstützen.

Hornhautgewebe Engineering: Eine In-vitro- Modell der Stromazellen Nerv Interaktionen der menschlichen Hornhaut

Ein Protokoll für in-vitro- Induktion von endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT), die nützlich für die Untersuchung von zelluläre Signalwege an EndMT beteiligt ist, wird beschrieben. In diesem experimentellen Modell ist EndMT durch Behandlung mit TGF-β in MS-1 Endothelzellen induziert.

Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung

Ein Protokoll für eine Ex Vivo Hornhaut Orgel Kulturmodells nützlich für Wundheilung Studien beschrieben wird. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Agenten, regenerative Heilung zu fördern oder Medikamententoxizität in einer organisierten mehrzelligen 3D-Umgebung.

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung und Kultivierung von Schweinespaltenhornknöpfen vorgestellt. Da dieses organotypisch kultivierte Organkulturmodell innerhalb von 15 Tagen Zellsterblichkeitsraten zeigt, vergleichbar mit menschlichen Spenderhornhäuten, stellt es das erste Modell dar, das eine langfristige Kultivierung nichtmenschlicher Hornhäuten ohne Zugabe von giftigem Dextran ermöglicht.

Ein Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Modell mit Split Corneal Buttons

Hier stellen wir ein Protokoll zur Ablösung von hornhauten Endothelzellen (CEC) von Descemets Membran (DM) unter Verwendung eines Neodym:YAG (Nd:YAG) Lasers als Ex-vivo-Krankheitsmodell für bullöse Keratopathie (BK) vor.

Entwicklung eines nichtinvasiven, laserunterstützten Versuchsmodells des cornealen Endotheliaalzellverlustes

Dieses Protokoll beschreibt die kritischen Schritte, die erforderlich sind, um hornhaut-Endothelzellkulturen aus Expflanzen von menschlichem oder Schafgewebe zu etablieren und zu züchten. Ein Verfahren zur Subkulierung von kornealen Endothelzellen auf membranösen Biomaterialien wird ebenfalls vorgestellt.

Wachstum von Human- und Schafhornhaut-Endothelzellschichten auf Biomaterialmembranen

Wir beschreiben Methoden zur Untersuchung von TGF-β2-induzierter EndMT in Endothelzellen, indem wir Veränderungen der Zellmorphologie beobachten und die Expression EndMT-bedingte Markerveränderungen mittels Immunfluoreszenzfärbung untersuchen. CrispR/Cas9-Gen-Editing wurde beschrieben und verwendet, um das Gen zu erschöpfen, das für Snail kodiert, um seine Rolle bei TGF-β2-induzierter EndMT zu untersuchen.

TGF-β-vermittelter endothelialer zu mesenchymaler Übergang (EndMT) und die funktionelle Bewertung von EndMT-Effektoren mittels CRISPR/Cas9-Gen-Editing

Hier werden Tiermodelle auf der Basis von Maus und Kaninchen für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels entwickelt, um neue Therapeutika und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen.

Ex vivo und in vivo Tiermodelle für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels

Erfahren Sie die Untersuchung der kornealen Endothel-Mesenchym-Transition mit in-vitro- und in-vivo-Modellen. Diese Methode nutzt bovine Zellkulturen und Ratten-Kryoverletzungsmodelle zur Erforschung regenerativer Therapien.

In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

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