Hochdurchsatz-Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Proteine in Trypansoma brucei in einer Hochdurchsatzmethode zu markieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Kinetoplsäure über die Lokalisierung und potenzielle Funktion großer Kohorten von Proteinen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von Proteinen schnell und einfach parallel markiert werden kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Lokalisation geben kann, können Wechselwirkungen großer Kohorten von Proteinen auch mit anderen Tags untersucht werden. Zum Beispiel das BirA-Tag für ein Bio-ID-Proximity-Mapping-Experiment. Das Verfahren wird von Ross Madden, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus unserem Labor, vorgeführt.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, frieren Sie einen 96-Well-PCR-Kühler im Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius vor. Bereiten Sie Master Mix A zu, indem Sie Folgendes in einer 10-Milliliter-Tube kombinieren. 2.100 Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser, 105 Mikroliter DMSO in PCR-Qualität, 105 Mikroliter 10 millimolare dNTPs und 105 Mikroliter pPOT-Template.

Gießen Sie Master Mix A in ein Reagenzreservoir und aliquotieren Sie 23 Mikroliter Master Mix A in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. Geben Sie mit einer P20 12-Kanal-Mehrkanalpipette zwei Mikroliter 100 Mikromolar gepoolte Primer in jede geladene Vertiefung. Versiegeln Sie die Platte mit Folie.

Legen Sie es auf den vorgekühlten PCR-Kühler und lassen Sie es mindestens 20 Minuten bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Das Einfrieren von PCR-Mastermix A ist entscheidend, um eine effiziente Heißstartreaktion zu gewährleisten, selbst wenn eine bestimmte Heißstartpolymerase verwendet wird. Dies führt zu einer reproduzierbaren und ertragreichen Amplifikation.

Während sich die PCR-Platte im Gefrierschrank befindet, bereiten Sie Master Mix B vor. Kombinieren Sie Folgendes in einem 10-Milliliter-Röhrchen: 2.048 Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser, 525 Mikroliter 10X-Puffer und 52,5 Mikroliter Polymerase für ein Gesamtvolumen von 2.626 Mikrolitern pro Platte. Nehmen Sie die PCR-Platte und den PCR-Kühler aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius.

Während sich die Platte noch auf dem PCR-Kühler befindet, fügen Sie schnell 25 Mikroliter Master Mix B auf den gefrorenen Master Mix A in jeder Vertiefung hinzu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 50 Mikrolitern zu erhalten. Dies ist zeitkritisch und sollte abgeschlossen sein, bevor Master Mix A auftauen kann. Versiegeln Sie die Platte mit Folie.

Stellen Sie den Thermocycler wie folgt ein: 94 Grad Celsius für 10 Minuten, dann 30 Zyklen von 94 Grad Celsius für 15 Sekunden, 65 Grad Celsius für 30 Sekunden und 72 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von einer abschließenden Verlängerungsphase von 72 Grad Celsius für sieben Minuten. Nachdem der Block 94 Grad Celsius erreicht hat, laden Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und starten Sie das Amplifikationsprogramm.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie ein großes 1%-Agarose-Gel in Trisacetat-EDTA- oder TAE-Laufpuffer mit vier Reihen von Vertiefungen vorbereiten. Laden Sie eine DNA-Leiter von einem KB in die erste und 28. Vertiefung jeder Reihe. Der nächste Schritt besteht darin, zwei Mikroliter PCR-Produkt direkt, ohne DNA-Ladepuffer, auf jede Spur des Gels zu übertragen, wobei das hier gezeigte Muster zu befolgen ist.

Zum Beispiel werden die PCR-Produkte aus den Reihen A und B der PCR-Platte in die ungeraden bzw. geraden Bahnen der ersten Reihe des Gels geladen. Um die Möglichkeit einer Kontamination der Amplikons zu verringern, laden Sie die PCR-Produkte aus Reihe A der PCR-Platte in die ungeraden Bahnen der ersten Reihe des Gels. Laden Sie dann die PCR-Produkte aus Reihe B der PCR-Platte in die geraden Bahnen der ersten Reihe des Gels.

Laden Sie die PCR-Produkte aus den Reihen C und D der PCR-Platte nach demselben Muster, wobei Reihe C in die ungeraden Bahnen und Reihe D in die geraden Bahnen der zweiten Reihe des Gels geladen wird. Setzen Sie dieses Lademuster fort, bis jede Vertiefung der PCR-Platte auf das Gel geladen ist. Geben Sie das Gel in den Lauftank und füllen Sie den Tank mit TAE-Laufpuffer, bis das Gel untergetaucht ist.

30 Minuten lang mit 100 Volt laufen lassen. Visualisieren Sie mit einem UV-Transilluminator. Hier ist ein repräsentatives 96-Well-PCR-Validierungs-Agarosegel zu sehen, bei dem 95 von 96 PCRs erfolgreich waren.

Bei der erfolglosen PCR handelte es sich um H11. Bei diesem Verfahren wird Trypansoma brucei, procyclische Form, Zelllinie SMOXP9 verwendet. Züchten Sie die Zellen auf die entsprechende Dichte, wie im Protokolltext beschrieben, und ernten Sie die erforderliche Anzahl von Zellen durch Zentrifugation bei 800 mal G für 10 Minuten.

Beginnen Sie mit der Einrichtung für die Elektroporation, während die Zellen zentrifugiert werden. Verbinden Sie den Plattenhandler mit dem Elektroporator. Stellen Sie an der Elektroporatoreinheit die Spannung auf 1.500 Volt, die Impulslänge auf 100 Mikrosekunden, die Anzahl der Impulse auf 12 und das Impulsintervall auf 500 Millisekunden ein.

Stellen Sie auf dem Plattenhandler die Impulsanzahl auf eins ein. Übertragen Sie die PCR-Reaktionen mit einer P200 12-Kanal-Mehrkanalpipette von der PCR-Platte auf eine 96-Well-Einweg-Elektroporationsplatte. Waschen Sie die Zellen in 10 Millilitern modifiziertem Cytomix und zentrifugieren Sie erneut bei 800-facher G für 10 Minuten.

Resuspendieren Sie die Zellen in 23 Millilitern modifiziertem Cytomix für eine Endkonzentration von fünfmal 10 bis den siebten Zellen pro Milliliter. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Reagenzreservoir. Pipettieren Sie 200 Mikroliter der Zelllösung in jede Vertiefung der Elektroporationsplatte und mischen Sie sie durch Pipettieren mit dem PCR-Produkt.

Verwenden Sie ein Taschentuch, um Tröpfchen von der Oberseite der Platte zu entfernen, um Kurzschlüsse zu vermeiden. Tragen Sie eine Siegelfolie auf die Oberseite der Elektroporationsplatte auf und positionieren Sie sie so, dass die Löcher für die Elektroden oben und unten an jeder Säule unbedeckt bleiben. Vermeiden Sie es, die erhabenen Punkte abzudecken, die zur Führung der Folie verwendet werden.

Legen Sie die Elektroporationsplatte in den Plattenhandler ein und schließen Sie den Deckel. Drücken Sie "Impuls" an der Elektroporatoreinheit. Nach der Elektroporation müssen die Zellen zur Wiederherstellung schnell auf vier 24-Well-Gewebekulturplatten überführt werden, die einen Milliliter SDM-79-Medium pro Well enthalten.

Verwenden Sie eine P200 12-Kanal-Mehrkanalpipette, bei der alle zweiten Spitzen fehlen, sodass die restlichen sechs Spitzen mit den sechs Reihen auf einer 24-Well-Gewebekulturplatte ausgerichtet sind. Nachdem die Zellen von der 96-Well-Platte auf die 24-Well-Platte übertragen wurden, waschen Sie die Wells in der 96-Well-Platte mit Medien aus den entsprechenden Wells in der 24-Well-Platte. Übertragen Sie dann die Wäsche zurück in die Vertiefungen in der 24-Well-Platte.

Übertragen Sie die elektroporierten Zellen von der 96-Well-Elektroporationsplatte auf die 24-Well-Gewebekulturplatten in dem hier gezeigten vordefinierten Muster. Zum Beispiel werden Zellen aus den ungeraden Vertiefungen von Reihe A der 96-Well-Platte in Reihe A von Platte A übertragen, während Zellen aus den geraden Wells von Reihe A von der 96-Well-Platte in die Reihe A von Platte C übertragen werden.Nach jeder Übertragung der Zellen von der 96-Well-Platte auf die 24-Well-Platte, Waschen Sie die Vertiefungen in der 96-Well-Platte mit Medium aus der entsprechenden Reihe der 24-Well-Platte. Übertragen Sie dann die Wäsche zurück auf die 24-Well-Platte.

Das Übertragen von Zellen auf die 24-Well-Platten ist verwirrend, aber Sie müssen in der Lage sein, die resultierenden Zelllinien auf das richtige Gen zu verfolgen, ID.It ist entscheidend, diesen Schritt schnell durchzuführen, um die Zellen gesund zu halten. Nachdem alle elektroporierten Zellen auf die vier 24-Well-Platten übertragen wurden, legen Sie die 24-Well-Platten in eine saubere Kunststoffbox mit einem Deckel, der einen dichten Verschluss bildet. Stellen Sie die Box in einen 28 Grad Celsius heißen Inkubator.

Geben Sie zwischen sechs und acht Stunden später in jede Vertiefung einen Milliliter SDM-79 mit 10 % FCS, das selektives Antibiotikum enthält. Inkubieren Sie neun bis 10 Tage lang bei 28 Grad Celsius, bis transgene Zelllinien sichtbar werden. Nach einer 96-Well-Transfektion zur Markierung von 96 verschiedenen Proteinen am Endterminus werden die Zellen zur Gewinnung und Selektion auf 24-Well-Gewebekulturplatten übertragen.

Jede Vertiefung wird dann bewertet, um festzustellen, ob sie gesunde, arzneimittelresistente Zellen enthält. Ein gesunder Brunnen enthält überwiegend hochaktive Zellen, die in der Phasenkontrastmikroskopie hell sind. In diesem Beispielschema stellt Grün eine Vertiefung mit erfolgreicher Transfektion dar, und Grau stellt eine Vertiefung dar, in der nur tote Zellen vorhanden sind.

88 von 96 oder 92 % der Vertiefungen enthalten nach 15 Tagen Selektion erfolgreich transfizierte Parasiten. Sobald die Zellen gemeistert sind, dauert es etwa eine Stunde von der Zählung der Zellen bis zu ihrer Beschichtung nach der Elektroporation. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die selektiven Medikamente sechs bis acht Stunden nach der Transfektion hinzuzufügen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man große Kohorten von Proteinen in Trypansoma brucei markiert.