Name: Hochdurchsatz-Gene Tagging in Trypanosoma brucei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Lernen Sie ein Hochdurchsatz-Verfahren zum endogenen Protein-Tagging in Trypanosoma brucei. Diese Methode ermöglicht die parallele Markierung hunderter Proteine für Lokalisations- und Funktionsstudien in Kinetoplastiden.

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SD wurde durch ein Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z] unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Wellcome Trust Grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] an Professor Keith Gull finanziert. Wir danken Professor Keith Gull für hilfreiche Gespräche und Einblicke.

1. 96-Well-Lange Primer PCR <ol><li> Pre-freeze 96-Well PCR-Kühler in -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> In einem 10 - ml - Tube, Vorbereitung Master Mix A: 2.100 ul ddH 2 O, 105 &amp; mgr; l PCR - Klasse DMSO, 105 &amp; mgr; l 10 mM dNTPs, 105 &amp; mgr; l pPot - Vorlage (25 ng / ul) 9, für ein Gesamtvolumen von 2.415 ul pro Platte . </li><li> Aliquot 23 ul in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. </li><li> In 2 ul 100 uM gepoolt Primer an jeder geladen und ein P20 12-Kanal Mehrkanal-Pipette. Dichtung mit Film, Platz Platte auf der vorgekühlte PCR-Kühler und lassen für mindestens 20 min bei -80 ° C einzufrieren. </li><li> In einem 10 - ml - Tube, Vorbereitung Master Mix B: 2.048 ul ddH 2 O, 525 ul 10x - Puffer, 52,5 ul Polymerase für ein Gesamtvolumen von 2.626 ul pro Platte. </li><li> Entfernen Sie Platte und PCR-Kühler von -80 ° C-Gefrierschrank. </li><li> Mit der Platte noch auf dem PCR-Kühler, fügen Sie 25 ul Master Mix B auf der Oberseite des gefrorn Master Mix A für eine Gesamtreaktionsvolumen von 50 &amp; mgr; l. Dies ist zeitkritisch und sollte abgeschlossen sein, bevor Mix A auftauen kann. Dichtungsplatte mit Folie. </li><li> Eingestellt Thermocycler wie folgt: 94 ° C für 10 min, dann 30 Zyklen von 94 ° C für 15 sec, 65 ° C für 30 sec, 72 ° C für 2 min, gefolgt von einem letzten Verlängerungszeitraum von 72 ° C für 7 min . </li><li> Laden Sie die PCR-Platte, nachdem der Block 94 ° C erreicht hat. </li></ol> 2. Validierung von 96-Well-Lang Primer PCR <ol><li> Guss eine große 1% (w / v) Agarosegel in Tris-Acetat-EDTA (TAE) Laufpuffer mit 4 x 28-well Kämme ein Gel mit 4 Reihen von Vertiefungen zu geben. Richten abwechselnde Zähne des Kamms mit den Spitzen eines 12-Kanal-Mehrkanalpipette. versenken Sie vorsichtig das Gel in TAE-Puffer laufen, nachdem die Bahnen geladen werden. </li><li> Last 1 kb DNA - Leiter in der 1. und 28. Vertiefung jeder Reihe. </li><li> Unter Verwendung eines P20 12-Kanal Mehrkanal-Pipette 2 ul PCR-Produkt direkt auf jede Spur des Gels (1A). Tun Sie dies schnell die Möglichkeit einer Verunreinigung der Amplikons zu reduzieren. <ol><li> Laden Sie die PCR-Produkte aus der Zeile A der PCR-Platte in die ungeraden Bahnen der ersten Reihe des Gels (A1 - Spur 3, A2 - Bahn 5 ...... A11 - Spur 23, A12 - Spur 25) und laden Sie die PCR-Produkte von Zeile B der PCR - Platte in den geradzahligen Spuren der 1. Zeile des Gels (B1 - Spur 4, A2 - Spur 6 ...... B11 - Spur 24, B12 - Spur 26). </li><li> Laden Sie die PCR-Produkte von Zeile C und D der PCR-Platte das gleiche Muster wie oben beschrieben, mit der Zeile C in die ungeraden Bahnen und Reihe D in den geradzahligen Spuren. Wiederholen Sie diesen Lademuster, bis jede Vertiefung der PCR-Platte auf das Gel geladen wird. DNA-Ladepuffer ist nicht erforderlich, um dieses Gel zu laden. </li></ol></li><li> Legen Sie das Gel in den Lauftank und füllen Sie den Tank mit TAE-Laufpuffer, bis das Gel eingetaucht ist. Laufen bei 100 V für 30 min undunter Verwendung eines UV-Transilluminator sichtbar zu machen. Siehe 1B für ein Beispiel - Gel. Hinweis: Die PCR-Produkte können bei -20 ° C für mehrere Wochen vor der Transfektion gelagert werden </li></ol> 3. 96-Well-Transfection <ol><li> Verwenden Sie die T. brucei prozyklischen Form Zelllinie SMOXP9 10 für dieses Verfahren und wachsen in SDM-79 - Medium , das 10% FCS 10. </li><li> Verwenden 1 x 10 7 Zellen pro Transfektion (insgesamt 1,1 x 10 9 Zellen) , wenn auf dem N - Terminus des Proteins und 2 x 10 7 Zellen pro Transfektion (insgesamt 2,2 × 10 9 Zellen) etikettieren , wenn am C - Terminus Tagging von das Protein. Aufrechterhaltung der Zellen in mid-log (1,2 x 10 &amp; sup6 ; -1 · 10 &amp; sup7 ; Zellen / ml) für einige Tage vor der Transfektion geerntet und die Zellen für die Transfektion in einer Dichte von 5-8 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Erlauben frozen PCR-Produkte für die Transfektion bei Raumtemperatur auftauen. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämocytometer oder automatische Zellzähler. </li><li> Pellet erforderliche Anzahl von Zellen in mehrere 50 ml-Röhrchen bei 800 xg für 10 min. </li><li> Nach Zentrifugation discard Überstand und Resuspendieren der Zellen in 10 ml modifizierte cytomix (0,8 mM EGTA, 24 mM KCl, 0,15 mM CaCl 2, 10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM MgCl 2, 0,5% (w / v) Glucose, 100 ug / ml BSA, 1 mM Hypoxanthin, 144 mM Saccharose) pro Röhrchen. Übertragen Sie alle Zellenlösungen zu einem einzigen Rohr und drehen wieder bei 800 × g für 10 min. </li><li> Nach dem Zentrifugieren der Überstand verwerfen und die Zellen in 23 ml modifizierter cytomix für eine Endkonzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml resuspendieren. </li><li> Während Zellen drehen, 1 ml SDM-79-Medium zu jeder Vertiefung von 4 x 24-well Gewebekulturplatten. Beschriften Sie die Platten AD und zeichnen einen Ring um gut A1 auf jeder Platte in Permanentmarker Plattenorientierung zu helfen. </li><li> Schließen Sie den Plattenhandhabungs zum -Elektroporator. Auf der electroporator Einheit eingestellt, die Spannung auf 1500 V, bis 500 msec die Impulslänge auf 100 &amp; mgr; s und die Anzahl der Impulse bis 12 und des Impulsintervalls. Auf der Platte Handler, stellen Sie die Pulszahl auf 1. Dadurch wird sichergestellt, dass die -Elektroporator einen einzigen Impuls zu jeder der 12 Spalten der Elektroporation Platte gelten. </li><li> Unter Verwendung eines P200 12-Kanal-Mehrkanalpipette, übertragen Sie die PCR-Reaktionen aus der PCR-Platte auf den 96-Loch-Einweg-Elektroporation Platten, 4 mm Spalt. </li><li> Wenn die Zellen versponnen und werden bis zu einer Endkonzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml (Schritt 3.7) resuspendiert, Transfer in ein Reaktionsmittelreservoir. Je 200 ul der Zelllösung in jede Vertiefung der Elektroporation Platte mit einer P200 12-Kanal-Multikanal-Pipette, mit PCR-Produkt durch Pipettieren mischen. </li><li> Mit Gewebe entfernen Sie alle Tröpfchen von der Oberseite der Platte um Kurzschlüsse zu vermeiden. </li><li> Tragen Sie die Dichtungsfolie in der Platte Verpackung an die Spitze der Elektroporation Platte, pos bereitgestelltitioning es, um die Löcher für die Elektroden an der Oberseite und Unterseite jeder Spalte freigelegt zu lassen. Vermeiden Sie die angesprochenen Punkte Abdeckung verwendet, um den Film zu führen. </li><li> Legen Sie die Elektroporation Platte in den Plattenhandhabungs und den Deckel schließen. Drücken Sie &#39;Pulse&#39; auf der -Elektroporator Einheit. </li><li> Nach der Elektroporation übertragen schnell die Zellen von der 96-Well-Platte Elektroporation auf die 4 x 24-well Gewebekulturplatten. Um die Zellen zu übertragen, verwenden Sie einen P200 12-Kanal-Mehrkanalpipette mit jeder anderen Spitze fehlt, so dass die restlichen 6 Tipps Linie mit den sechs Reihen auf einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Übertragen Sie die elektroporierten Zellen in den 96-Well - Platten electroporations in vordefinierten Muster auf die 24-Well - Gewebekulturplatten (2A). </li><li> Bereiten Sie die P200 Pipettenspitzen - für jede 96-Well-Transfektion 2 Boxen mit 96 Spitzen mit jeder anderen Spalte entfernt vorzubereiten. <ol><li> Transfer Brunnen A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 auf der 96-Loch-Elektroporation PlatteEine Reihe A der 24-Well-Gewebekulturplatten Platte, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 in Reihe B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 in Reihe C und D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 in Reihe D. nach der Übertragung eines jeden Satzes von 6 Vertiefungen von der 96-Well-Platte mit der 24-Well-Platte werden die Vertiefungen in der 96-Well-Platte dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der 24- gewaschen Well-Platte und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li><li> Transfer Brunnen E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 auf der 96-Loch-Elektroporation Platte bis 24-Well-Platte B Reihe A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 in Reihe B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 in Zeile C und H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 in Reihe D. nach der Übertragung eines jeden Satzes von 6 Vertiefungen von der 96-Well-Platte mit der 24-Well-Platte, die Vertiefungen in der 96 -Wanne Platte werden dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen gewaschen und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li><li> Transfer Brunnen A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 auf der 96-Loch-Elektroporation Platte bis 24-Well-Platte C Reihe A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 in Reihe B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 in Reihe C und D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 in Reihe D. Nach der Übertragung eines jeden Satzes von sechs Brunnen aus dem 96 -Wanne Platte an der 24-Well-Platte, die Vertiefungen in der Platte mit 96 Vertiefungen werden dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen gewaschen und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li><li> Transfer Brunnen E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 auf der 96-Loch-Elektroporation Platte bis 24-Well-Platte D Reihe A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 in Reihe B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 in Reihe C und H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 in Reihe D. nach der Übertragung eines jeden Satzes von 6 Vertiefungen von der 96-Well-Platte mit der 24-Well-Platte, die Vertiefungen in der 96 -Wanne Platte werden dann mit Medien aus den entsprechenden Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen gewaschen und die Waschlösung wird dann zurück in die Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen überführt. </li></ol></li><li> Unter Verwendung eines invertierten Phasenkontrastmikroskop untersuchen 1 gut aus jeder Spalte, die Zellen zu überprüfen. Es wird mit einem eine Mischung aus lebenden und toten Zellen seinbeträchtliche Menge an Zelltrümmern. Lebende Zellen können von toten Zellen unterschieden werden, weil sie unter dem Phasenkontrastmikroskopie hell sein wird und sich bewegen. </li><li> Legen Sie die 24-Well-Platten in einem sauberen, Kunststoff-Box mit einem Deckel, der eine dichte Abdichtung bildet. Legen Sie die Box in einem 28 ° C Inkubator. </li><li> Zwischen 6-8 Stunden später 1 ml SDM-79 mit FCS 10% gut 2x selektive Antibiotikum jeweils. In unserer Erfahrung, wo Zellinien die Gene am N-Terminus markiert sind, sind widerstandsfähig gegen höhere Konzentrationen des selektiven Arzneimittels. Daher erfordert / ml auf eine Endkonzentration von 20 ug verwendet Blasticidin als Beispiel am N-Terminus Tagging am C-Terminus Blasticidin und Etikettieren in einer Endkonzentration von 10 ug erfordert / ml Blasticidin. Hinweis: Transgene Zelllinien 9-10 Tage nach der Transfektion sichtbar werden. </li><li> Passage mindestens zweimal in frischem Arzneimittel- und Medien vor der Analyse. 2B zeigt die Ergebnisse aus einem typischen 96-well transfection für 96 verschiedene Proteine ​​am N-Terminus etikettieren. Beurteilen Sie jede Vertiefung durch Phasenkontrastmikroskopie zu bestimmen, ob es gesund enthält, arzneimittelresistenten Zellen. Eine gesunde und enthält überwiegend (&lt;95%) hochaktive Zellen, die in der Phase Vertrag Mikroskopie hell sind. Anschließende Analyse durch Epifluoreszenzmikroskopie oder Western-Blot ist erforderlich, um festzustellen, ob das Protein erfolgreich markiert ist. </li></ol>

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<li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+meth%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
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<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dramatische Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Proteomik und Transkriptomik Methoden in den letzten 5-10 Jahren auf Tausenden von Genen und ihren Produkten wertvolle Daten zur Verfügung gestellt. Allerdings sind die Werkzeuge die Funktion dieser Proteine ​​Adresse haben nicht Schritt gehalten. Tagging ein Protein erleichtert zahlreiche Versuche, seine Funktion zu bestimmen. Zum Beispiel kann ein Protein in einer Vielzahl von verschiedenen Farben zu einem fluoreszierenden Protein fusioniert werden Studien Lokalisation und Co-Lokalisierung zu erleichtern. Stichworte für die Elektronenmikroskopie entwickelt, wie APEX2 oder miniSOG 11,12 erlauben ultrastrukturelle Lokalisierung des markierten Proteins. Tags für die Biochemie, wie dem TAP - Tag und ProtC-TEV-ProtA (PTP) -Tag 7,13 Reinigung von Komplexen ermöglichen , mit dem Protein zur Identifizierung von Bindungspartnern oder in vitro biochemische Assays verbunden. Die spezifischen Schritte, die für den Erfolg der Protoc kritischol, sind: der Einbau von DMSO in die PCR Master Mix 1, Gefrieren des PCR Master Mix 1 vor der Zugabe des Master Mix 2, die Verwendung des handelsüblichen Polymerase in Master Mix 2 und der Modifikation des cytomix Elektroporationspuffer. Nach unserer Erfahrung ist es notwendig, die doppelte Anzahl von Zellen für die C-terminalen Markierungs Transfektionen wie für N-Terminal-Tagging Transfektionen verwendet werden, um einen ähnlichen Anteil an positiven Vertiefungen zu erreichen. Daher sollten alle Schritte wie beschrieben durchgeführt. Diese Technik ist wahrscheinlich nur erfolgreich sein, wenn das Insekt prozyklischen Form Trypanosomen transfizieren. Blutstrom Formen haben eine geringere Transfektionseffizienz 14, zudem sind sie wahrscheinlich aufgrund von Dichteabhängigen Toxizität bei der Auswahl zu sterben, die mit dem selektiven Medikament nicht in Beziehung steht. Daher stellt unsere bisherigen Protokoll die aktuelle beste Technologie für 9 von Blutformen Trypanosomen - Tagging. Es ist auch wahrscheinlich, dass die transfection Effizienz hängt von der spezifischen Trypanosomen-Isolat variieren. Dieses Protokoll wurde mit 927 SMOX prozyklischen Formen optimiert - andere Stämme zusätzliche Optimierung erfordern. Maßnahmen, welche die Erfolgswahrscheinlichkeit erhöhen können, umfassen: die Menge des PCR-Amplikons, Erhöhung der Anzahl von Zellen in der Transfektionseffizienz eingeschlossen. Wir stellen eine Methode, in der Hunderte von Proteinen können parallel markiert werden. Dies wird, groß angelegte Studien über die Lokalisierung und Interaktion zu erleichtern, die Ergänzung bestehender großer Datensätze und wertvolle Informationen für die Allgemeinheit erbringen. Primer-Vorlagen sind auf Anfrage erhältlich und eine Liste von Plasmiden Vorlagen finden Sie unter: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei ist ein einzelliger Parasit, der bei Rindern menschlichen afrikanischen trypanosomasis und Nagana verursacht. T. brucei ist ein idealer Organismus für die Analyse von Proteinfunktion aufgrund der Kombination von hoher Qualität Genoms, zahlreiche Proteomik und Transkriptomik Datensätze und gut entwickelte molekulare Werkzeuge 1-3. Die Fortschritte in der Proteomik und Sequenzierung haben in großen Datensätzen geführt , die potentiell interessante Gene 4-6 hervorzuheben; Allerdings haben viele Gene minimale Informationen mit ihnen in den vorhandenen Datenbanken verbunden. Es besteht daher ein Bedarf für ein Hochdurchsatzverfahren Protein funktionelle Charakterisierung zu unterstützen. Expression eines markierten Proteins kann eine Vielzahl von Einsichten in ein Protein der Funktion geben. Zum Beispiel ist ein Protein mit einem fluoreszierenden Protein oder epitopmarkiert kann durch Fluoreszenzmikroskopie lokalisiert werden, die Informationen darüber, wo die prot gibtein könnte seine biologische Wirkung werden ausübt. Alternativ kann ein Protein mit einer TAP getaggt 7, HaloTag 8 oder His - Tag kann für biochemische Assays und Identifizierung seiner Interaktionspartner , gereinigt werden. Wir entwickelten kürzlich eine robuste Tagging Methodik für T. brucei 9. Benutzten langen Primer PCR die DNA für die Transfektion zu erzeugen und das Tagging von Dutzenden von Proteinen in parallel erlaubt - eine wesentliche Verbesserung bestehender Protokolle. Wir haben nun die Skalierbarkeit dieses Protokolls in prozyklischen Formen durch eine Größenordnung verbessert. Hier stellen wir unsere Methode, wo wir die PCR und Transfektion in 96-Well-Platten durchzuführen, wobei die Rückgewinnung und Auswahl auftretenden in Platten mit 24 Vertiefungen. Wie Hunderte von Proteinen können nun parallel markiert bietet dieses Verfahren eine kostengünstige und praktikable Methode für die gesamte Trypanosomen Genom-Tagging.

<table><tbody><tr><td>Oligonukleotid</td><td>Lebenstechnologien</td><td>nur</td><td>entsalzen (keine zusätzliche Aufreinigung verwenden)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Im Lieferumfang der Expand HiFi-Packung</td><td>enthalten Muss</td></tr><tr><td>PCR-Qualität dNTP</td><td>sein, eine seriöse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand-HiFi-Polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 Plattenhandler</td><td>Harvard Apparatur</td><td>HT-200</td><td>Verarbeitet die 96-Well-Elektroplatten</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatur</td><td>45-0452</td><td>Galvanische Platte für die 96-Well-Elektroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochlorid</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC-Kolben, schräger Hals, Phenolkappe</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Kulturplatten</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&reg; PCR-Kühler, eisloses Kühllagersystem für 96-Well-Platten und PCR-Röhrchen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Multiplikation PCR-Platte mit seitlichem Rand</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-gene tagging in<em&gt; trypanosoma brucei</em

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Verbesserungen in der Massenspektrometrie, Sequenzierung und Bioinformatik haben große Datensätze potenziell interessanter Gene generiert. Die Markierung dieser Proteine kann Einblicke in ihre Funktion geben, indem sie ihre Lokalisation innerhalb der Zelle bestimmt und die Identifizierung von Interaktionspartnern ermöglicht. Wir haben kürzlich eine schnelle und skalierbare Methode zur Generierung von Trypanosoma brucei-Zelllinien veröffentlicht, die ein markiertes Protein aus dem endogenen Locus exprimieren. Die Methode basierte auf einem von uns erzeugten Plasmid, das in Verbindung mit einer langen Primer-PCR verwendet werden kann, um ein Gen so zu modifizieren, dass es für ein Protein kodiert, das an einem der beiden Enden markiert ist. Dies ermöglicht die parallele Markierung von Dutzenden von Trypanosomenproteinen und erleichtert so die großflächige Validierung von Kandidatengenen von Interesse. Dieses System kann verwendet werden, um Proteine für die Lokalisierung (unter Verwendung eines fluoreszierenden Proteins, eines Epitop-Tags oder eines Elektronenmikroskopie-Tags) oder der Biochemie (unter Verwendung von Tags für die Aufreinigung, wie z. B. dem TAP-Tag (Tandem Affinity Purification)) zu markieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Durchführung der Long-Primer-PCR und der Elektroporation in 96-Well-Platten, wobei die Rückgewinnung und Selektion transgener Trypanosomen in 24-Well-Platten erfolgt. Mit diesem Workflow können Hunderte von Proteinen parallel markiert werden; Dies ist eine Verbesserung um eine Größenordnung gegenüber unserem vorherigen Protokoll, und das Tagging auf Genomebene ist nun möglich.

In dieser repräsentativen Transfektion wurden die Primer mit der TagIt Perl - Skript 9 und synthetisiert kommerziell entwickelt. Die 96-Well - PCR wurde wie beschrieben (1A) durchgeführt und validiert; in diesem Beispiel 95/96 PCRs erfolgreich waren (1B). Nach unserer Erfahrung Wiederholen fehlgeschlagen Reaktionen entweder mit den ursprünglichen Primern oder neu synthetisierten Primer nicht in erfolgreicher PCR führt. Die Amplikons wurden in 96-well Platten transferiert Elektroporation zur Elektroporation (2A) und dann in 24-Well - Kulturplatten zur Gewinnung und Selektion transferiert. Nach ausreichender Zeit die Auswahl stattfinden zu lassen, wurden die Vertiefungen für das Überleben vor der weiteren Analyse erzielt. In diesem Beispiel 88/96 Brunnen (92%) waren nach 15 Tagen Selektion positiv. <img alt = &quot;1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1: Validierung von langer Primer PCR (A) Muster für die Übertragung von PCR - Produkte von 96-Well - PCR - Platte auf dem Agarose - Gel für die Validierung von PCR.. (B) Ein repräsentativer 96-Well - PCR - Validierung Gel für 95 Gene auf dem N - Terminus - Tagging und 1 Amplikon keine 5 &#39;Targeting Homologie enthalten , als negative Kontrolle in die Transfektionseffizienz zu wirken. Die Proben werden geladen auf ein 1% (w / v) Agarose - Gel und für 30 Minuten bei 100 V aufgelöst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Abbildung 2: 96-Well - Elektroporation und Selektion (A) Muster für elektroporierten Zellen von 96-Well - Elektroporation plat übertragen.E 24-Well-Gewebekulturplatten. (B) Ein Schema , das eine typische Live / Dead - Scoring nach 15 Tagen Selektion in 24-Well - Platten zeigt. Grün steht für eine erfolgreiche Transfektion, grau stellt ein gut mit nur tote Zellen. In diesem Beispiel 88/96 (92%) von Wells enthielten erfolgreich transfizierten Parasiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Das Hinzufügen eines Tags zu einem Protein ist eine mächtige Möglichkeit, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Hunderte von Trypanosoma brucei-Proteinen parallel endogen zu markieren, so dass eine Markierung im Genommaßstab möglich ist.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Proteine in Trypansoma brucei hochdurchsatzfähig zu markieren. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Kinetoplastida bezüglich der Lokalisation und potenziellen Funktion großer Protein-Kohorten zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass große Mengen an Proteinen parallel schnell und einfach markiert werden können.Obwohl diese Methode Einblicke in die Lokalisation ermöglicht, können auch Wechselwirkungen großer Protein-Kohorten mithilfe anderer Tags untersucht werden. Zum Beispiel das BirA-Tag für ein Bio-ID-Näherungskartierungsexperiment. Den Ablauf wird Ross Madden, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus unserem Labor, demonstrieren.Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, kühlen Sie einen 96-Loch-PCR-Kühler im Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank vor. Bereiten Sie den Master-Mix A vor, indem Sie die folgenden Komponenten in einem 10-Milliliter-Röhrchen kombinieren: 2, 100 Mikroliter destilliertes, deionisiertes Wasser, 105 Mikroliter PCR-gradigen DMSO, 105 Mikroliter 10-Millimolar-dNTPs und 105 Mikroliter pPOT-Vorlage.Geben Sie Master-Mix A in ein Reagenzienreservoir und portionieren Sie 23 Mikroliter von Master-Mix A in jede Vertiefung einer 96-Loch-PCR-Platte. Fügen Sie mit einer P20 12-Kanal-Mehrkanalpipette zwei Mikroliter eines 100 Mikromolar-Pool-Primers zu jeder beladenen Vertiefung hinzu. Versiegeln Sie die Platte mit einer Folie. Platzieren Sie es auf den vorgekühlten PCR-Kühler und lassen Sie es mindestens 20 Minuten bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Das Einfrieren der PCR-Master-Mix-A ist entscheidend, um eine effiziente Hot-Start-Reaktion sicherzustellen, auch bei Verwendung einer spezifischen Hot-Start-Polymerase. Dies führt zu einer reproduzierbaren und ertragreichen Amplifikation.Während sich die PCR-Platte im Gefrierschrank befindet, bereiten Sie Master-Mix B vor. Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in einem 10-Milliliter-Röhrchen: 2.048 Mikroliter destilliertes, deionisiertes Wasser, 525 Mikroliter 10X-Puffer und 52,5 Mikroliter Polymerase, insgesamt 2.626 Mikroliter pro Platte. Entnehmen Sie die PCR-Platte und den PCR-Kühler aus dem Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank.Während sich die Platte noch auf dem PCR-Kühler befindet, sofort 25 µL der Master-Mix-B-Lösung auf den gefrorenen Master Mix A in jedes Well pipettieren, sodass sich ein Gesamtvolumen von 50 µL pro Ansatz ergibt. Dieser Schritt ist zeitempfindlich und muss abgeschlossen sein, bevor sich Master Mix A auftauen kann. Die Platte mit einer Folie versiegeln.Stellen Sie den Thermocycler wie folgt ein: 94 °C für 10 Minuten, dann 30 Zyklen mit 94 °C für 15 Sekunden, 65 °C für 30 Sekunden und 72 °C für zwei Minuten, gefolgt von einer abschließenden Verlängerungsphase von 72 °C für sieben Minuten. Sobald der Block 94 °C erreicht hat, laden Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und starten das Amplifikationsprogramm.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung eines großen 1 %igen Agarosegels im Tris-Acetat-EDTA- oder TAE-Laufpuffer mit vier Reihen von Vertiefungen. Geben Sie eine 1-kb-DNA-Leiter in die erste und 28. Vertiefung jeder Reihe. Als nächster Schritt wird 2 µL PCR-Produkt direkt, ohne DNA-Ladepuffer, in jede Gelelektrophorese-Spur gemäß dem hier gezeigten Muster überführt.Beispielsweise werden die PCR-Produkte aus den Reihen A und B der PCR-Platte jeweils in die ungeraden und geraden Gellöcher der ersten Gelreihe geladen. Um die Gefahr einer Kontamination der Amplikone zu verringern, werden die PCR-Produkte aus Reihe A der PCR-Platte schnell in die ungeraden Gellöcher der ersten Gelreihe pipettiert. Anschließend werden die PCR-Produkte aus Reihe B der PCR-Platte in die geraden Gellöcher der ersten Gelreihe geladen.Laden Sie die PCR-Produkte aus den Reihen C und D der PCR-Platte in diesem gleichen Muster auf, wobei Reihe C in die ungeradzahligen Gelen und Reihe D in die geradzahligen Gelen der zweiten Reihe des Gels pipettiert wird. Setzen Sie dieses Belademuster fort, bis jede Vertiefung der PCR-Platte auf das Gel aufgetragen wurde. Platzieren Sie das Gel in den Elektrophoresekammer und füllen Sie die Kammer mit TAE-Laufpuffer, bis das Gel vollständig bedeckt ist.30 Minuten bei 100 Volt laufen lassen. Mit einem UV-Durchlichttisch sichtbar machen. Gezeigt ist ein repräsentativer Agarosegel für die PCR-Validierung in einer 96-Loch-Platte, bei dem 95 von 96 PCR-Reaktionen erfolgreich waren.Die erfolglose PCR war H11. Dieses Verfahren verwendet Trypanosoma brucei, procyclische Form, Zelllinie SMOXP9. Kultivieren Sie die Zellen bis zur geeigneten Dichte, wie im Protokolltext beschrieben, und gewinnen Sie die erforderliche Anzahl an Zellen durch Zentrifugation bei 800 × g für 10 Minuten.Beginnen Sie mit den Vorbereitungen für die Elektroporation, während die Zellen zentrifugiert werden. Schließen Sie den Plattenhandler an das Elektroporationsgerät an. Stellen Sie am Elektroporationsgerät die Spannung auf 1.500 Volt, die Pulslänge auf 100 Mikrosekunden, die Anzahl der Pulse auf 12 und das Pulsintervall auf 500 Millisekunden ein.Stellen Sie am Plattenwechsler die Impulsanzahl auf eins ein. Übertragen Sie mit einer 12-Kanal-Mehrfachpipette (P200) die PCR-Reaktionen von der PCR-Platte in eine 96-Well-Disposable-Elektroporationsplatte. Waschen Sie die Zellen in 10 Milliliter modifiziertem Cytomix und zentrifugieren Sie erneut bei 800 × g für 10 Minuten.Resuspendieren Sie die Zellen in 23 Milliliter modifiziertem Cytomix, um eine Endkonzentration von fünf mal 10 hoch 7 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Überführen Sie die Zellsuspension in ein Reagenzienreservoir. Pipettieren Sie 200 Mikroliter der Zelllösung in jedes Loch der Elektroporationsplatte und mischen Sie mit dem PCR-Produkt durch Pipettieren.Entfernen Sie mit einem Tuch eventuelle Tropfen von der Oberseite der Platte, um Kurzschlüsse zu vermeiden. Bringen Sie eine Versiegelungsfolie auf der Oberseite der Elektroporationsplatte an, und positionieren Sie sie so, dass die Löcher für die Elektroden an der Ober- und Unterseite jeder Spalte frei bleiben. Vermeiden Sie es, die Erhebungen abzudecken, die zum Ausrichten der Folie dienen.Laden Sie die Elektroporationsplatte in den Plattenhandler ein und schließen Sie die Abdeckung. Drücken Sie „Puls“ am Elektroporationsgerät. Nach der Elektroporation müssen die Zellen schnell auf vier 24-Loch-Zellkulturplatten übertragen werden, die je ein Milliliter SDM-79-Medium pro Loch zur Erholung enthalten.Verwenden Sie eine P200 12-Kanal-Mehrfachpipette, bei der jede zweite Pipettierspitze fehlt, sodass die verbleibenden sechs Spitzen mit den sechs Reihen einer 24-Loch-Zellkulturplatte übereinstimmen. Nachdem die Zellen von der 96-Loch-Platte in die 24-Loch-Platte übertragen wurden, spülen Sie die Vertiefungen der 96-Loch-Platte mit Medium aus den entsprechenden Vertiefungen der 24-Loch-Platte. Übertragen Sie dann den Spülansatz zurück in die Vertiefungen der 24-Loch-Platte.Übertragen Sie die elektroporierten Zellen von der 96-Loch-Elektroporationsplatte auf die 24-Loch-Zellkulturplatten nach dem hier gezeigten vordefinierten Muster. Beispielsweise werden Zellen aus den ungeradzahligen Vertiefungen von Reihe A der 96-Loch-Platte in Reihe A von Platte A übertragen, während Zellen aus den geradzahligen Vertiefungen von Reihe A der 96-Loch-Platte in Reihe A von Platte C übertragen werden. Nach jeder Übertragung der Zellen von der 96-Loch-Platte auf die 24-Loch-Platte spülen Sie die Vertiefungen der 96-Loch-Platte mit Medium aus der entsprechenden Reihe der 24-Loch-Platte aus. Anschließend übertragen Sie die Spülflüssigkeit zurück auf die 24-Loch-Platte.Das Übertragen der Zellen in die 24-Loch-Platten ist verwirrend, aber Sie müssen in der Lage sein, die resultierenden Zelllinien der korrekten Gen-ID zuzuordnen. Es ist entscheidend, diesen Schritt schnell durchzuführen, um die Zellen gesund zu halten. Nachdem alle elektroporierten Zellen auf die vier 24-Loch-Platten übertragen wurden, stellen Sie die 24-Loch-Platten in eine saubere Kunststoffbox mit einem dicht abschließenden Deckel. Stellen Sie die Box in einen Inkubator bei 28 Grad Celsius.Sechs bis acht Stunden später je ein Milliliter SDM-79 mit 10 % FCS, das das selektive Antibiotikum enth&auml;lt, in jede Vertiefung geben. Bei 28 Grad Celsius f&uuml;r neun bis zehn Tage inkubieren, bis transgene Zelllinien sichtbar werden. Nach einer 96-Loch-Transfektion zur Markierung von 96 verschiedenen Proteinen am Endterminus werden die Zellen zur Erholung und Selektion in 24-Loch-Gewebekulturplatten &uuml;berf&uuml;hrt.Jedes Well wird anschließend daraufhin überprüft, ob es gesunde, arzneimittelresistente Zellen enthält. Ein gesundes Well enthält überwiegend hochaktive Zellen, die in der Phasenkontrastmikroskopie hell erscheinen. In diesem schematischen Beispiel steht grün für ein Well mit erfolgreicher Transfektion und grau für ein Well, das nur tote Zellen enthält.88 von 96, also 92 % der Vertiefungen, enthalten nach 15 Tagen Selektion erfolgreich transfizierte Parasiten. Wenn man den Vorgang einmal beherrscht, dauert es ungefähr eine Stunde, von der Zählung der Zellen bis zur Ausplattierung nach der Elektroporation. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die selektiven Wirkstoffe sechs bis acht Stunden nach der Transfektion hinzuzufügen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man große Protein-Kohorten in Trypansoma brucei markiert.

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Research

Forschung

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