Name: Competitive Transplantationen Blutstammzell-Fitness zur Bewertung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie die kompetitive Knochenmarktransplantation zur Bewertung der Stammzell-Fitness in vivo bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht Einblicke in Selbsterneuerungsmechanismen ohne Zellsortierung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir sind dankbar, dass Roxann Hétu-Arbour für die Unterstützung bei der Abbildung Design und Demonstration der Verfahren. Die Forschung im Labor durch eine Transition Award von der Cole-Stiftung unterstützt wurde, gewähren Discovery-Nr. 419226-2012 aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (NSERC) und der Canada Foundation for Innovation (CFI Leaders Fund nicht gewähren. 31377). KMH ist ein Chercheur-Boursier Junior für den Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden von der institutionellen Tierethikkommission und folgen dem Canadian Council on Animal Care-Richtlinien zugelassen. Hinweis: Um steril / specific pathogen freien Gehäuse Bedingungen aufrechtzuerhalten, führen alle Verfahren im Zusammenhang mit Direkt Umgang mit lebenden Mäusen in einem biologischen Sicherheitsschrank oder einem Laminar-Flow-Haube. Reinigen oder sterilisieren Käfige, Haltevorrichtungen, Gehäusematerialien, Futter und Wasser zu den in geeigneter Tiere zur Verfügung gestellt. Verwenden Sie nur sterile Einweg-Nadeln für die Injektionen und zur Blutentnahme. Aseptische Technik ist bei der Herstellung des Transplantats von entscheidender Bedeutung. 1. Herstellung der Empfängermäuse <ol><li> Identifizieren Empfängermäuse mit Ohr Kerben (oder einer anderen von der örtlichen Tierethikkommission genehmigten Methode 8) individuelle Follow - up von Rekonstitution peripheren Blut und Knochenmark im Laufe der Zeit zu ermöglichen. Wiegen Sie die Mäuse für die Zeit nach der Transplantation Follow-up. Unse Empfängermäuse, die zwischen 7 und 12 Wochen alt (weniger als 25 g) sind. Hinweis: In der mitgelieferten Beispiel CD45.1 + CD45.2 + Empfängermäuse wurden im Haus gezüchtet von C57Bl / 6 - Mäuse mit congenic B6.SJL Mäusen kreuzen. </li><li> Empfängermäuse mit zwei Dosen von 450 rad bestrahlen hämatopoetischen Aktivität zu zerstören. Geben Sie die erste Dosis am Tag vor der Transplantation und die zweite 1-2 Stunden vor der Transplantation. Hinweis: Röntgen- oder Gammastrahlen beide verwendet, abhängig von der Verfügbarkeit von geeigneten Einrichtungen werden kann. </li></ol> 2. Herstellung von Donor und Competitor Knochenmarkzellen <ol><li> Euthanize Spender (Test und Kontrolle; CD45.2 +) und Wettbewerber (CD45.1 +; B6.SJL) Mäuse durch CO 2 Ersticken gefolgt durch Genickbruch oder unter Verwendung von Methoden , die von der lokalen Tierethikkommission genehmigt. </li><li> Legen Mäuse auf dem Rücken, die Beine weit geöffnet, in eine leere Petrischale oder auf einer sterilen Gaze (zu halten die Arbeitsfläche sauber) inside einem biologischen Sicherheitsschrank. Befeuchten Sie die Haut und das Fell mit 70% Ethanol / 30% H 2 O (v / v). </li><li> Schneiden Sie den Fuß mit einem Skalpell oder einer scharfen Schere ab. Schneiden Sie öffnen die Haut am Bein und ziehen weg, die Haut mit gezackten Pinzette. Schneiden Sie überschüssige Muskel weg. </li><li> Verrenken Femur auf dem Beinknochen ziehen und mit Scherenblätter gegen den Beckenknochen als Gegenkraft. Nehmen Sie Tibia und Femur von der Kniescheibe und entfernen verbleibenden Bits von Muskeln und Sehnen. Platzieren Sie die Knochen in 2-3 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einer 6-Well-Gewebekulturplatte. </li><li> Sammeln Knochenmarkszellen durch die Knochen mit 5 ml sterilem PBS gespült. <ol><li> Halten Sie die Knochen vorsichtig mit einer Pinzette und legen Sie eine 25 G-Nadel zu einem gefüllten 1-ml-Spritze an einem Ende des Knochens. Drücken Sie den Kolben und sammeln Sie die Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Bei Bedarf wiederholen, bis die Mitte des Knochen weiß ist. </li></ol></li><li> Distanzieren Sie die Zellen durch wiederholtes durch die Nadel vorbei aneine Einzelzellsuspension zu erhalten. Vermeiden Sie Blasen und überschüssige Kraft. Hinweis: Verwenden Sie eine etwas größere Nadel (22 G) die Lebensfähigkeit der Zellen in diesem Schritt zu verbessern. </li><li> Führen Sie die Zellen durch ein 70 &amp; mgr; m Nylon-Sieb einheitliche Zellsuspension, um sicherzustellen, und Ablagerungen und Klumpen zu entfernen. </li><li> Entfernen eines aliquoten zur Zellzählung unter Verwendung eines Hämozytometers. Zentrifugieren Sie die verbleibende Zellsuspension bei 200 × g für 5 Minuten bei 4 ° C. Nachjustieren Zelldichte erforderlich , wie in sterile PBS (10 &amp; sup8 ; Zellen / ml). Halten Sie die Zellen auf Eis. </li></ol> 3. Aufbau Spenderzelle HSC Equivalents <ol><li> Übertragen , das Äquivalent von 3 x 10 6 Zellen (30 &amp; mgr; l) werden in einen 5 ml Rundbodenpolystyrolröhrchen für die Durchflusszytometrie Färbung. Ein gleiches Volumen an nicht-markiertem Antikörper gegen CD16 / CD32 unspezifische Färbung zu blockieren (verdünnt in Färbepuffer (PBS, ergänzt mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) und 1 mM EDTA) für eine Endkonzentration von 2,5 &amp; mgr; g / ml). Inkubiere 5 min bei RT. </li><li> In 90 ul Fluorochrom konjugierte Antikörper Master-Mix hergestellt in Färbepuffers: biotinylierten Lineage-Cocktail (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. Inkubieren auf Eis für 30 min, vor Licht geschützt. Hinweis: Geeignete Verdünnungen sollte für jede Charge von Antikörper bestimmt werden. Siehe Tabelle der Materialien für Verdünnungen in dieser Studie verwendet. </li><li> 2 ml Färbepuffer zu den Zellen, Vortexen und Zentrifugieren bei 200 xg für 5 min bei 4 ° C um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Dekantieren Überstand und Pellet durch schnippen. </li><li> In 10 ul fluorochromkonjugierten Streptavidin in Färbepuffers verdünnt (siehe Materialien Tabelle). Inkubieren auf Eis für 20 min, vor Licht geschützt. Waschen wie in Schritt 3.3, um ungebundene Streptavidin entfernen. </li><li> Erwerben Sie die Zellproben ein Durchflusszytometer mit mindestens sechs Detektoren 9. Bestimmen Sie die Häufigkeit der Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 <sup&gt; + Zellen (geschätzt HSCs) in jeder Probe die Analyse Vorlage in 2 dargestellt und wie zuvor 10,11 gemeldet. Hinweis: Die Häufigkeit funktioneller HSCs innerhalb dieser Population kann zwischen 1/3 und 1/5 2,12 geschätzt werden. </li><li> Stellen geschätzten HSC - Äquivalente für alle Proben 11, unter Verwendung einer Probe ( in der Regel der Wettbewerber, B6.SJL CD45.1 + in diesem Beispiel) als Basislinie wie unten und in Abbildung 2. <ol><li> Berechnen Sie die Anzahl von Zellen unter Verwendung der folgenden Formeln erforderlich: #transplanted HSCs / Empfänger = 5 x 10 5 Zellen x geschätzten HSC Frequenz (wie für Ausgangsprobe bestimmt; diese Zahl ist in der Regel zwischen 75 und 125 für den Wildtyp C57BL / 6 - Mäuse) 10-12. Anmerkung: In 2 für Probe A, das Ergebnis 139 HSCs ist. Gesamt # Zellen transplantiert (für andere Proben, zB Probe B in Abbildung 2) = # transgepflanzt HSZ / HSC-Frequenz. Anmerkung: In 2 für Probe B ist das Ergebnis 197.826 (oder etwa 2 x 10 5) Gesamtknochenmarkszellen. </li></ol></li><li> Berechne die Gesamtzahl der pro Transplantatempfänger für jede Probe benötigt Zellen unter Verwendung der oben erhaltenen Ergebnisse. Hinweis: Diese Zahl sollte 5 x 10 5 für die Basisprobe sein (Wettbewerber). <ol><li> Multiplizieren Sie die aus Schritt Nummer 3.7 durch die Anzahl der Empfängermäuse und fügen Sie genügend Zellen für mindestens zwei weitere Mäuse für das Totvolumen in der Spritze zu kompensieren. </li></ol></li><li> Mischungs Kompetitor (zB CD45.1 +) und die Testzellen (CD45.2 +) in 1: 1 - HSC - Äquivalentverhältnis, berechnet in Schritt 3.6 und stellen das Endvolumen 200 &amp; mgr; l pro Injektion mit steriler PBS. Hinweis: Eine Gruppe von fünf Empfängermäuse die vorgeschlagene Volumen wäre also mindestens 1,4 ml, enthaltend 3,5 x 10 6 Kompetitor Knochenmarkszellen (bzw.973 geschätzt HSCs für Probe A in 2), und die entsprechende Anzahl von Testzellen (in Figur 2 würde das Äquivalent für Probe B 197.826 x 7 = 1.384.782 Knochenmarkzellen) sein. </li></ol> 4. Knochenmarktransplantationen <ol><li> Warm up die Empfängermäuse bestrahlt in Schritt 1.2 mit einem roten Wärmelampe Erweiterung der Blutgefäße, um sicherzustellen, und die seitlichen Schwanzvenen besser sichtbar zu machen. </li><li> Bereiten Sie eine 1 ml Tuberculinspritze ausgestattet mit einer 27 G-Nadel (oder kleiner). Absaugen etwa 750 &amp; mgr; l der hergestellten Zellsuspension (für 3 Empfängermäuse). Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Spritze sind. </li><li> Legen Sie die Maus in eine Haltevorrichtung. Untersuchen Sie den Schwanz und suchen Sie nach den seitlichen Schwanzvenen, die auf beiden Seiten des Schwanzes deutlich sichtbar sein sollte. Wischen Sie die Injektionsstelle mit Ethanol. Führen Sie die Nadel Schräge nach oben, parallel zur Haut und den Kolben vorsichtig drücken. Die Injektion sollte einfach sein. Wenn Kraft rebenötigt, ist die Nadel nicht in die Vene. Hinweis: Ältere Mäuse dickere Haut haben, die die Vene erschweren kann zu finden. Wenn die Nadel nicht in der Vene ist, legen die Nadel proximal der anfänglichen Injektionsstelle. </li><li> Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie die Injektionsstelle mit steriler Gaze für einige Sekunden die Blutung zu stoppen. Übertragen Sie die Maus in einen sauberen Käfig. Hinweis: Verwenden Sie die gleiche Spritze und Nadel für drei Injektionen, wonach die Nadel zu langweilig werden kann. </li><li> Für nach der Transplantation, Follow-up, injizieren 1 ml sterile PBS subkutan die Mäuse für die ersten fünf Tagen zu rehydrieren. Fügen Sie Antibiotika im Trinkwasser Infektionen zu verhindern (falls erforderlich; optional). Wiegen Mäuse alle zwei bis drei Tage für die ersten drei Wochen und einschläfern Mäuse, die mehr als 15-20% ihrer vor der Transplantation Körpergewicht verloren haben (oder wie von der örtlichen Tierethikkommission bestimmt). </li></ol> 5. Analyse von peripherem Blut <ol><li> Sammeln Sie einen Tropfen Blut (approx. 50-100 &amp; mgr; l) in EDTA-Röhrchen. <ol><li> Um Blut aus der Vene des Unterkiefers zu sammeln, verwenden Sie eine Lanzette oder eine 22 - G - Nadel die Gesichtshaut in der Nähe der haarlos Stelle zu stechen unter den Kieferknochen befindet und legen Sie das Sammelrohr den Blutstropfen 13 zu empfangen. Sammeln Blut bei 4, 8, 12 und 16 Wochen nach der Transplantation Mehr lineage Rekonstitution zu folgen. </li></ol></li><li> 1 ml frisch hergestellt RT roten Blutkörperchen Lysepuffer (9 Teile 0,16 M NH 4 Cl + 1 Teil 0,17 M Tris-HCl pH 7,65) mit dem Blutstropfen in Schritt 5.1.1 gesammelt. Mix and Transfer Probe auf eine 5-ml-Rundboden-Polystyrolrohr geeignet für die Durchflusszytometrie. Lassen Sie für 4 min bei RT stehen. </li><li> In 4 Volumina eiskaltem PBS. Mischen Sie durch Drehen End-to-End-und Transfer sofort auf Eis. Zentrifuge 10 min bei 200 × g bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren Überstand und Pellet durch schnippen. Der Überstand sollte klar und rot sein. 2 ml Färbepuffers und Wirbel kurz. Zentrifuge 5 min bei 200 xgat 4 ° C. </li><li> Dekantieren Überstand und Pellet durch schnippen. </li><li> Fahren Sie mit der Durchflusszytometrie Färbung der allgemeinen Protokoll in den Schritten 3.1 bis 3.3 und den folgenden Antikörpern für den Master-Mix detailliert mit: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1. </li><li> Erwerben Sie die Zellproben ein Durchflusszytometer mit mindestens sechs Detektoren 9. Bestimmung der Häufigkeit der Spender abgeleiteten Zellen für jede Linie (CD19 + B - Lymphozyten, CD3e + T - Lymphozyten, Granulozyten GR1 hell) in jeder Probe die Analyse Vorlage bereitgestellt in Figur 3 und als 10,11 veröffentlicht. </li></ol> 6. Analyse der Knochenmark-Rekonstitution <ol><li> Sammeln Knochenmarkzellen wie in Abschnitt 2. Färben der Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse die allgemeine Protokoll detailliert in den Schritten 3.1 bis 3.3 und die folgenden Antikörper für den Master-Mix: Lineage-Cocktail, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. Detect lineage Cocktail unter Verwendung von Antikörpern fluorochromkonjugierten Streptavidin als 3,4 in Schritt beschrieben. </li><li> Erwerben Zellproben ein Durchflusszytometer mit mindestens acht Detektoren 9. Wenn nur sechs zur Verfügung stehen, fügen Sie CD135 auf den gleichen Kanal wie Lineage - Panel als CD135 + Zellen werden ausgeschlossen. Bestimmen Sie die Häufigkeit der Spender abgeleiteten Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + HSZ in jeder Probe die Analyse Vorlage zur Verfügung gestellt in Abbildung 4 und als 10 veröffentlicht. </li></ol>

<ol><li>Li, H. W., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+haematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation.</a> Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+fetal+liver+hematopoietic+stem+cells+using+SLAM+family+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors.</a> Blood. 108 (2), 737-744 (2006).</li>
<li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li>
<li>Rossi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+Is+More%3A+Unveiling+the+Functional+Core+of+Hematopoietic+Stem+Cells+through+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).</li>
<li>Till, J. E., McCulloch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+measurement+of+the+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells.</a> Radiat Res. 14, 213-222 (1961).</li>
<li>Shen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Ly-5+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning of Ly-5 cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+GM+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Identification of GM mice.</a> Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).</li>
<li>Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+determination+of+rare+populations+by+flow+cytometry%3A+A+hematopoietic+stem+cell+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective.</a> Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).</li>
<li>Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled-6+Regulates+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cell+Survival+and+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal.</a> J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).</li>
<li>Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+enhances+murine+hematopoietic+progenitor+cell+expansion+through+a+planar+cell+polarity-like+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway.</a> PLoS One. 6 (4), e19279(2011).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Santaguida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JunB+protects+against+myeloid+malignancies+by+limiting+hematopoietic+stem+cell+proliferation+and+differentiation+without+affecting+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal.</a> Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).</li>
<li>Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transplantation+via+antibody-based+clearance+of+hematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches.</a> Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).</li>
<li>Zhang, C. C., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hematopoietic+stem+cells+change+their+surface+phenotype+during+ex+vivo+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion.</a> Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).</li>
<li>Benveniste, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate-Term+Hematopoietic+Stem+Cells+with+Extended+but+Time-Limited+Reconstitution+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).</li>
<li>Fazekasde St Groth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+limiting+dilution+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The evaluation of limiting dilution assays.</a> J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).</li>
<li>Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+protein+Wnt4+enhances+thymopoiesis+and+expands+multipotent+hematopoietic+progenitors+through+beta-catenin-independent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling.</a> Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Benz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Stem+Cell+Subtypes+Expand+Differentially+during+Development+and+Display+Distinct+Lymphopoietic+Programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).</li>
<li>Eppert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+gene+expression+programs+influence+clinical+outcome+in+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia.</a> Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2rgamma-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die relative Eignung der Spender (Test) HSZ gegen bekannte Wettbewerber HSZ zu bewerten. Die Konkurrenzsituation erhöht die relative Empfindlichkeit des Assays (eher moderate Abnahme der Stammzell Fitness zu erkennen), und stellt eine interne technischen Kontrolle für die Wirksamkeit der Bestrahlung und Injektion. Es sollte jedoch nicht als absolutes Maß für HSC Fitness verwendet werden; nicht gut in der Abwesenheit von Konkurrenz eine Abnahme der Wettbewerbs Rekonsti...

Hämatopoese ist ein regenerativer Prozess, der das Auffüllen von Blutzellen gewährleistet, dass durch Verletzungen, Strahlung und Zelltod verloren. Dieser Prozess wird von hämatopoetischen Stammzellen (HSC) gewährleistet, die im erwachsenen Knochenmark weitgehend befinden. Zusätzlich können hämatopoetische Stammzellen für therapeutische Zwecke in Autoimmunerkrankungen, hämatologischen Malignitäten und Immundefizienz 1 verwendet werden. Es besteht somit ein Bedarf nach besser, die Mechanismen zu verstehen, die HSC-Funktion regulieren, einschließlich ihrer proliferative Expansion und ihre Fähigkeit, den Empfängerknochenmark nach der Transplantation zu erreichen und engraft. Obwohl neuere Studien mehrere Zelloberflächenmarker berichtet haben, einschließlich der SLAM Familienmitglieder CD150 und CD48, prospektiv erwachsenen HSZ und fetale HSZ auf ca. 50% Reinheit 2-4, der Goldstandard Maß für die funktionelle HSZ bleibt ein in vivo repopulating Test bereichern bestimmen ihre Fähigkeit, den Blut c wieder herzustellenell Produktion in einem bestrahlten Host 5. Die in vivo klonalen repopulating Test wurde zunächst von Till und McCulloch 6 entwickelt und verfeinert und erweitert seitdem. Wie ursprünglich definiert, sorgen HSZ lebenslangen Blutkörperchen durch Selbsterneuerung und Differenzierung. Die Übertragung von HSCs in eine bestrahlte Empfänger ermöglicht uns so beurteilen zu: ihre Fähigkeit, durch die Analyse der verschiedenen Blutzelllinien (T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten) und ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung durch serielle Transplantation zu differenzieren. Der Assay würde beinhalten in der Regel den Vergleich der Funktionalität und / oder der Menge der zwei Populationen von HSCs, beispielsweise Zellen von zwei Mäusen verschiedener Genotypen oder Zellen kommen , die mit verschiedenen Faktoren behandelt oder unbehandelt sind, die die Wartung oder Expansion von HSCs beeinflussen könnten in Kultur. Spenderchimerismus oder der Beitrag der übertragenen Spender HSZ to Blutzellproduktion kann dann mittels Durchflusszytometrie Analyse im peripheren Blut und Knochenmark unter Verwendung von Zelloberflächenmarker oder andere Verfahren bestimmt werden, die Spenderzellen des Empfängers wird zu unterscheiden, oder Host. Die am häufigsten verwendeten Marker sind sicherlich die beiden Allele des Gens oder Protein-Tyrosinphosphatase CD45 Leukozyten - Antigen 7 , die wir für die Beispiele unten angegeben gewählt. Die klonalen Neubesiedlung Test kann entweder kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein. In einer nicht-kompetitiven Einstellung, Kontrolle und Prüfung HSCs werden in getrennte Empfängermäuse übertragen und das Ergebnis für jeden Zelltyp wird von der anderen unabhängig sein. In einem kompetitiven Einstellung wird die Funktion sowohl Test- und Kontroll HSCs gegen eine Population von Kompetitor HSCs gemessen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die Wettbewerbs Einstellung kann aber auch für nicht-kompetitiven Situationen angepasst werden. Beide Ansätze haben ihre Vor- und Nachteile, und wir werden sie im Detail in der VergleichsDiskussion. Wir beschreiben auch verschiedene Ansätze Eigenkapital in der Zahl der transplantierten HSZ, um sicherzustellen, erklären, wie der Test für die Quantifizierung von HSZ anzupassen, indem Verdünnungsanalyse Begrenzung (LDA), und beide Beispiele für die Interpretation der Ergebnisse erfolgreichen und nicht erfolgreichen Transplantationen zur Verfügung stellen.

<table><tbody><tr><td>Microtainer-Röhrchen mit K2EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 G Nadel</td><td>BD Spritze</td><td></td><td>Zur Blutentnahme aus der Unterkiefervene</td></tr><tr><td>LabQuake Shaker Drehspieß</td><td>Thermo&nbsp; Wissenschaftliche</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>Aufgereinigtes Anti-Maus-CD16/CD32 (Klon 2.4G2, Fc-Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>2.50 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Pe-Cy7-konjugiertes Anti-Maus-CD3e (Klon 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0031</td><td>0,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>PE-konjugiertes Anti-Maus-CD19 (Klon 1D3)</td><td>eBioscience</td><td>12-0193</td><td>0,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>APC-eFluor780 (APC-Cy7-Äquivalent)-konjugiertes Anti-Maus-Produkt GR1 (Klon RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>47-5931</td><td>0,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>FITC-Konjugat Anti-Maus CD45.1 (Klon A20)</td><td>eBioscience</td><td>11-0453</td><td>2,50 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>eFluor450-konjugiertes Anti-Maus-Produkt CD45.2 (Klon 104)</td><td>eBioscience</td><td>48-0454</td><td>1,00 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Anti-Human-/Maus-CD45R (B220) (Klon RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td>1,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Anti-Maus-CD3e (Klon 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>13-0031</td><td>1,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Anti-Maus-CD11b (Klon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>13-0112</td><td>1,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Anti-Maus-Produkt GR1 (Klon RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931</td><td>1,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Anti-Maus-Mittel TER119 (Klon TER119)</td><td>eBioscience</td><td>13-5921</td><td>0,625 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>V500 Streptavidin</td><td>BD Biosciences</td><td>56149</td><td>0,5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>PE-konjugiertes Anti-Maus-CD117 (Klon 2B8)</td><td>BD Biosciences</td><td>553355</td><td>0,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>PE-Cy7-konjugiertes Anti-Maus-Ly6A/E (Sca1) (Klon D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>558162</td><td>0,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>PerCP-eFluor710-konjugiertes Anti-Maus-CD135 (Klon A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46-1351</td><td>0,5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-konjugiertes Anti-Maus-CD150 (Klon TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115918</td><td>0,625 μm; g/ml
BD Biosciences und eBioscience führen nicht den gleichen Klon</td></tr><tr><td>1 ml Tuberkulinspritze mit 27 G Nadel</td><td>BD Spritze</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Tuberkulin Spritze mit 25 G Nadel</td><td>BD Spritze</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>70 μmu; m Zellensieb</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

competitive transplantationen blutstammzell-fitness zur bewertung

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Die Goldstandard-Definition einer hämatopoetischen Stammzelle (HSC) ist eine Zelle, die, wenn sie in einen bestrahlten Empfänger übertragen wird, die Fähigkeit hat, die Blutzellproduktion für die Lebensspanne des Empfängers wiederherzustellen. In diesem Protokoll wird erläutert, wie ein funktioneller Assay eingerichtet wird, um die HSC-Kapazitäten von zwei verschiedenen Zellpopulationen, wie z. B. Knochenmark von Mäusen mit zwei verschiedenen Genotypen, zu vergleichen, und wie die Empfängermäuse mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Das Protokoll verwendet zur Standardisierung HSC-Äquivalente anstelle von Zellsortierung und diskutiert die Vor- und Nachteile beider Ansätze. Darüber hinaus diskutieren wir verschiedene Variationen des Basisprotokolls, einschließlich serieller Transplantationen, limitierender Verdünnungsassays, Homing-Assays und nicht-kompetitiver Transplantationen, einschließlich der Vorteile und bevorzugten Anwendungen dieser verschiedenen Ansätze. Diese Assays sind von zentraler Bedeutung für die Untersuchung der HSC-Funktion und könnten nicht nur für die Untersuchung grundlegender HSC-intrinsischer Aspekte der Biologie verwendet werden, sondern auch für die Entwicklung präklinischer Assays für die Knochenmarktransplantation und die HSC-Expansion in Kultur.

Eine allgemeine Beschreibung der Wettbewerbs Transplantation Einstellung, einschließlich der sekundären Transplantationen (weiter unten erörtert) in Abbildung 1 zu entnehmen. Eine repräsentative Analyse vor der Transplantation des Knochenmarks HSZ in 2 zu . Nähere Informationen über den Ausschluss von Dubletten zu finden und tote Zellen können an anderer Stelle 9. Figuren 3<...

Dieses Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Einrichtung kompetitiver Knochenmarktransplantationsexperimente an Mäusen, um die Funktion hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen ohne vorherige Reinigung von Stammzellen durch Zellsortierung zu untersuchen.

Competitive Transplantationen Blutstammzell-Fitness zur Bewertung

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Fitness von hämatopoetischen Stammzellen aus Knochenmark in vivo mithilfe eines kompetitiven Transplantationsassays zu bestimmen. Diese Methode kann daher helfen, zentrale Fragen im Bereich der Stammzellbiologie und der hämatopoetischen Zelltransplantation bezüglich der Auswirkungen verschiedener Eingriffe auf die Selbstvermehrung von Stammzellen nach Transplantation zu beantworten. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass sie nur eine begrenzte Anzahl von Tieren erfordert und keine Zellsortierung beinhaltet.Obwohl diese Methode Einblicke in die Stammzellfunktion ermöglichen kann, ist sie auch in anderen Bereichen wie der Immunologie nützlich, beispielsweise durch die Verwendung gemischter Knochenmark-Chimären. Die ursprüngliche Entwicklung dieser Technik in den 1960er Jahren ebnete Forschern auf dem Gebiet der Stammzellbiologie den Weg, um Identität und Funktion hämatopoetischer Stammzellen beim Menschen und bei Mäusen zu untersuchen. Die Durchführung des Verfahrens wird Roxanne Hetu-Arbour, eine Masterstudentin im Labor, und Edward Owusu Kwarteng, ein Doktorand, demonstrieren.Beginnen Sie damit, die M

competitive-transplants-to-evaluate-hematopoietic-stem-cell-fitness

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Manuskript bietet eine Beschreibung der Methodik, die zur Etablierung von Transduktions-Transplantations-Mausmodellen verwendet wurde. Es wird detailliert über technische Fehler berichtet, die bei der Durchführung von Knochenmarktransplantationen vermieden werden sollten. Es sollte ein klares Verständnis für die Bedeutung eines hohen Virustiters, Transfektion/Transduktion und Bestrahlung gewonnen werden.

Transduction-Transplantation Maus-Modell der myeloproliferativen Neoplasien

Quantifizierung der Spender gewonnenen Zellen ist erforderlich, um Engraftment nach Stammzelltransplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien überwachen. Eine Kombination von Flow Cytometry-basierte Zellsortierung Kolonie Bildung Assay und anschließende Analyse von kurzen Tandem, die wiederholt verwendet werden, um die Verbreitung zu beurteilen und Differenzierung im Fach erythroiden Vorläuferzellen.

Erkennung von passives Spender erythroiden Vorläuferzellen nach hämatopoetische Stammzell-Transplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien

Wir beschreiben die Verwendung von hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Das maligne Potential der gentechnisch veränderten blutbildenden Zellen zu beurteilen. HSCT ist nützlich für die Bewertung der verschiedenen malignen hämatopoetischen Zellen in Vivo sowie die Generierung einer großen Kohorte von Mäusen mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder Leukämie um neue Therapien zu bewerten.

Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms

Ziel dieses Protokolls ist es, nichtmenschlichen Primaten CD34 isolieren+ Zellen aus grundiert Knochenmark, um diese Zellen mit Lentivirale Vektoren gen zu modifizieren und ein Produkt zur Infusion in die autologe Host vorzubereiten. Die Gesamt-Protokoll-Länge ist ca. 48 h.

Vorbereitung und gentechnische Veränderung von Nichtmenschen Primas hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Massen- und Membranpotenzials in ex vivo kultivierten hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

Wir beschreiben drei Methoden der Knochenmarktransplantation (BMT): BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit abgeschirmter Bestrahlung und BMT-Methode ohne Vorkonditionierung (adoptive BMT) zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese in Mausmodellen.

Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese

Dieses Protokoll ermöglicht die Aufrechterhaltung von ruhenden humanen hämatopoetischen Stammzellen in vitro, indem die Mikroumgebung des Knochenmarks mit reichlich Fettsäuren, Cholesterin, niedrigeren Konzentrationen von Zytokinen und Hypoxie imitiert wird.

Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die intrafemorale Injektion einiger hämatopoetischer oder leukämischer Stammzellen, einschließlich geneditierter Zellen, in murine Xenotransplantatmodelle, die nicht nur eine schnelle und sichere Transplantation von Zellen, sondern auch serielle Analysen des Knochenmarks ermöglichen.

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

Intrafemorale Injektionen ermöglichen die Transplantation einer kleinen Anzahl von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), indem die Zellen direkt in der Knochenmarkhöhle platziert werden. Hier beschreiben wir ein experimentelles Protokoll zur intrafemoralen Injektion von humanen HSPCs in immundefiziente Mäuse.

Intrafemorale Injektion von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse 

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die CRISPR/Cas9-Technologie mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay integriert, um Kandidatengene zu identifizieren, die für die abnormale proliferative Kapazität von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen entscheidend sind.

Bewertung abnormer wachstumsbezogener Gene von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch Kombination der CRISPR/Cas9-Technologie mit der Zellzählung

Erfahren Sie die kompetitive Knochenmarktransplantation zur Bewertung der Stammzell-Fitness in vivo bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht Einblicke in Selbsterneuerungsmechanismen ohne Zellsortierung.

Competitive Transplantationen Blutstammzell-Fitness zur Bewertung

Weitere Videos entdecken