Olfaktorischen Behaviors Assayed von Computer-Tracking Drosophila In einem Vier-Quadranten-Olfaktometer

Das übergeordnete Ziel dieses Aufbaus ist es, das Geruchsverhalten von Fliegen in einem Vier-Quadranten-Olfaktometer unter Verwendung eines bereitgestellten automatisierten Fliegenverfolgungssoftware-Skripts zu testen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zu beantworten, wie olfaktorische neuronale Systeme die Außenwelt erkennen und wie das Gehirn Verhaltensentscheidungen entschlüsselt und steuert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie vielseitig und robust ist und es ermöglicht, die Geruchsreaktionen der Fliegenpopulation in einem großen Versuchsbereich wiederholt zu testen.

Bereiten Sie für dieses Protokoll fünf Odoriermittelkammern vor, die aus einem Außenbehälter aus Kunststoff, einem Innenbehälter aus Glas und einem speziell angefertigten PTFE-Deckeleinsatz bestehen. Der Einsatz ist ein originaler Behälterdeckel, bei dem der Mittelteil entfernt und zwei Einwegventile angebracht sind. Verwenden Sie vier der Odoriermittelkammern für die Lösungsmittelkontrolle und eine Kammer für einen Testodorierstoff.

Stellen Sie sicher, dass jede Kammer sauber ist, und befüllen Sie dann einen Odormittelbehälter mit einem Milliliter Lösungsmittel oder Odoriermittelverdünnung. Überprüfen Sie dann die Position des Behälters in der Kunststoffkammer und stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeit verschüttet wurde. Sichern Sie den Deckel mit dem Schraubverschluss und einem O-Ring am PTFE-Einsatz, um ein Auslaufen zu verhindern.

Ziehen Sie die Fliegen auf handelsüblichem Maismehlmedium auf. Geben Sie 30 männliche und 30 weibliche Tiere in eine Standardflasche und lassen Sie die Eier fünf Tage lang bei Raumtemperatur ablegen. Sammeln Sie aus solchen Flaschen neu eingeschlossene Fliegen.

Für jede Versuchskohorte werden 25 männliche und 25 weibliche Fliegen unter kurzer Kohlendioxid-Narkose gesammelt und die Kohorte zwei bis vier Tage lang auf Standard-Fliegenmedium altern lassen. 40 bis 42 Stunden vor dem Experiment wird die Kohorte in ein Fläschchen mit etwa 10 Millilitern einprozentigem Agarose-Gel für die Feuchtigkeit ohne Nahrung umgefüllt. Hungern hilft, die gesamte Bewegung zu verstärken, und mehr als 90% der Fliegen sollten den Hungerprozess überleben.

Wenn mehr als 10% sterben, was bei einem schwachen Genotyp passieren kann, versuchen Sie, für alle Fliegen im Experiment einen Tag Hunger zu verwenden. Schalten Sie den Temperaturregler mindestens fünf Minuten vorher ein und stellen Sie ihn auf 25 Grad Celsius ein. Verbinden Sie dann die Odoriermittelkammern über ein Kunststoffrohr mit der Arena.

Überprüfen Sie den Luftdurchsatz in jedem Quadranten der Arena mit einem elektronischen Durchflussmesser. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Kontroll- als auch der Odorierluftstrom mit 100 Millilitern pro Minute laufen. Fliegen reagieren sehr empfindlich auf Luftströmungen, und es ist wichtig, dass der Luftstrom für jeden Quadranten vor jedem Experiment überprüft wird.

Reinigen Sie nun die Arena und die Glasplatten mit 70% Ethanol. Wischen Sie alle Teile zwei- bis dreimal ab und lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen, bevor Sie fortfahren. Als nächstes klemmst du die Glasplatten an die Arena.

Bringen Sie die Fliegen dann ohne Betäubung in die Arena. Lassen Sie sie mit Hilfe der Schwerkraft durch das Loch in einer der Glasplatten eindringen und decken Sie das Loch dann mit einem kreisförmigen Netz ab. Lege nun die mit Fliegen beladene Arena in die lichtdichte Kammer.

Verbinden Sie dann die vier Steuerluftströme mit jeder Ecke der Arena. Schließen Sie die Tür der Kammer und lassen Sie die Fliegen sich 10 bis 15 Minuten lang an die neue Umgebung gewöhnen. Führen Sie nach der Eingewöhnungsphase ein fünf- bis zehnminütiges Kontrollexperiment durch, bei dem die Fliegen vier Kontrollluftströmen ausgesetzt werden.

Es ist wichtig, die Daten jetzt sofort zu analysieren. Sind die Fliegen nicht gleichmäßig in der Arena verteilt, muss die Arena zurückgesetzt werden. Es ist wichtig, das Verhalten von Kontrollfliegen zu testen, um nur die Luft zu reinigen.

Auf diese Weise wird schnell überprüft, ob alle Hintergrundbedingungen normal sind. Austretendes Licht, Temperaturungleichgewicht, gekippte Arena oder eine Geruchskontamination können Probleme verursachen. Falls nötig, wirf die Fliegen weg und reinige die Arena erneut.

Bei Verdacht auf eine Verunreinigung des Odoriermittels alle Schläuche austauschen. Wiederholen Sie den Kontrolltest mit neuen Kohorten, bis die Tiere keine Präferenz mehr für einen der vier Quadranten zeigen. Verbinden Sie dann die Testodormittelkammer über ein Dreiwegeventil mit dem Aufbau oder schließen Sie den Schlauch wieder an und führen Sie ein Testexperiment für fünf bis 10 Minuten durch.

Bei längeren experimentellen Aufzeichnungen sollten Sie das Tracking-Programm alle 20 Minuten schnell stoppen und neu starten, da sonst die Datendateien zu groß werden. Entsorgen Sie zwischen den Tests die Fliegen, reinigen Sie die Arena und die Glasplatten mit 70 % Ethanol und ersetzen Sie die Verbindungsrohre. Halten Sie den trockenen Luftstrom in Gang, um das System kontinuierlich zu spülen.

Aus Gründen der Effizienz ist es gut, zwei Arenen zu haben, damit die Reinigung während der Läufe durchgeführt werden kann. Wenn mehrere Experimente am selben Tag falsch sind, achten Sie äußerst darauf, dass kein Geruch von einem früheren Lauf im System zurückbleibt. Bei niedrigen Konzentrationen des Odoriermittels oder bei CO2 ist dies normalerweise kein Problem, aber bei hochkonzentrierten Reizen kann ein Abstand von bis zu 24 Stunden zwischen den Versuchsläufen erforderlich sein.

Verwenden Sie für die Datenanalyse die bereitgestellte benutzerdefinierte Matlab-Routine, um die Daten in ein Matlab-Format zu konvertieren. Laden Sie die von der Tracking-Software in Echtzeit erstellte Rohdatendatei und erstellen Sie eine räumliche Maske, die den Konturen der Arena folgt. Wenden Sie die Maske auf die Rohdaten an, um alle Datenpunkte zu entfernen, die außerhalb der Arena liegen, da sie Rauschen darstellen.

Entfernen Sie dann alle Datenpunkte, die sich länger als drei Sekunden mit weniger als 0,163 Zentimetern pro Sekunde bewegen. Bei diesen Daten handelt es sich wahrscheinlich um Lärm oder sich nicht bewegende Fliegen. Visualisieren Sie nun die verbleibenden Datenpunkte, indem Sie sie alle durch die Aufzeichnungszeiträume darstellen.

Die Daten können auch als einzelne Trajektorien betrachtet werden. Geruchsgrenzen können auf der Grundlage der Verhaltensdaten der Fliege schnell abgeschätzt werden. Berechnen Sie dann den Anziehungsindex und führen Sie statistische Tests durch, wie im Textprotokoll beschrieben.

25 männliche und 25 weibliche Fliegen wurden im Verhaltensapparat getestet. Als Reaktion auf trockene Luft erkundeten die Fliegen die gesamte Arena, ohne einen Quadranten zu bevorzugen. Die Linie zeigt die verfolgte Flugbahn einer Fliege.

Als Apfelessig in den Luftstrom des oberen linken Quadranten eingeführt wurde, wurden die meisten Fliegen von diesem Geruchsquadranten angezogen. Wenn ein abweisender Geruchsstoff, 10 % Ethylpropionat, in den oberen linken Quadranten eingeführt wurde, wurde dieser Quadrant vermieden. Der attraktive Index dieses Quadranten erreichte einen Wert von 0,68.

Ein attraktiver Index ist der am weitesten verbreitete Index bei der Messung der Geruchsreaktion. Ein Wert über oder unter Null zeigt Anziehung oder Abstoßung an. Das Drehbuch kompensierte leichte Schwankungen in der Arenaposition zwischen den Prüfungen.

Datenpunkte, bei denen es sich möglicherweise um Rauschen oder sich nicht bewegende Fliegen gehandelt haben könnte, wurden entfernt. Obwohl der Test für eine beliebige Dauer durchgeführt werden kann, ist es interessant, Veränderungen in den Bewegungen der Kohorte über 10-Sekunden-Bins hinweg zu beobachten, um die Geruchsgewöhnung und andere Phänomene zu verstehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Geruchsverhalten in einem Vier-Felder-Assay effektiv durchführen und analysieren können.

Einmal gemeistert, kann jedes Geruchsexperiment in etwa einer Stunde abgeschlossen werden, und wir führen routinemäßig vier bis sechs Experimente an einem Tag durch.