Name: SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Beobachtung einzelner SNARE-vermittelter Membranfusionsereignisse mit polarisierter TIRF-Mikroskopie in einer mikrofluidischen Zelle. Diese Methode ermöglicht die simultane Detektion von Lipid- und Frachtfreisetzung mit hoher Zeitauflösung.

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Wir danken Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) für das Design und die Konstruktion des polarisierten TIRF-Mikroskops, David Baddeley (Yale University) für die Hilfe bei der zweifarbigen Detektionsinstrumentierung und James E. Rothman (Yale University) und Ben O'Shaughnessy (Columbia University) und Mitgliedern ihrer Gruppen für die anregenden Diskussionen. EK wird durch einen Kavli Neuroscience Scholar Award der Kavli Foundation und das NIH-Stipendium 1R01GM108954 unterstützt.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die erfolgreiche Umsetzung des SUV-SBL Fusionstest hier beschrieben hängt entscheidend von mehreren wichtigen Schritten, wie funktionelle Rekonstitution von Proteinen in Liposomen, gute Qualität SBLS zu erhalten, und die Wahl der richtigen Abbildungsparameter einzelner Moleküle zu detektieren. Obwohl es einige Zeit und Mühe in Anspruch nehmen , um zu folgen, sobald der Test erfolgreich durchgeführt wird, liefert es eine Fülle von Informationen über den Schweißvorgang nicht bei jedem anderen in vitro Fusionstest...

Die Membranfusion ist ein universeller biologischer Prozess , die für intrazellulären Transport von Lipiden und Proteinen, Sekretion, Befruchtung, Entwicklung und umhüllte Virus den Eintritt in die Wirtsorganismen 1-3. Für die meisten intrazellulären Fusionsreaktionen einschließlich der Freisetzung von Hormonen und Neurotransmittern über Exozytose, die Energie zwei Lipid - Doppelschichten zu verschmelzen wird durch die Bildung eines Vier-Helix - Bündel von cognaten löslichen N-Ethylmaleimid-sensitive Faktor Attachment - Protein - Rezeptor (SNARE) Proteine ​​zur Verfügung gestellt, verankert in das Vesikel (v-SNARE) und die Zielmembran (t-SNARE) 4. Synaptischen Vesikel Exocytose ist die streng reguliert Fusionsreaktion und tritt innerhalb einer Millisekunde nach der Ankunft eines Aktionspotentials 1,4,5. Die Fusionspore, die erste Verbindung zwischen den beiden Verschmelzen Fächer, flackern offen und geschlossen mehrere Male vor der Wiederverschließung oder irreversibel 5-7 erweitert. Die bisherigen Ergebnissein transient, &quot;Kiss &amp; run&quot; Fusion, während Letzteres führt zur vollständigen Fusion. Faktoren , die die Balance zwischen diesen beiden Modi der Fusion regeln und Mechanismen Poren Flimmern Regulierung sind nicht gut 5,8 verstanden. SNARE-Proteine ​​sind für die Exocytose erforderlich; synaptischen Vesikel Fusion 9 , bei der Spaltung von SNARE durch Neurotoxine abgeschafft. Bulk - Fusionsexperimente mit kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs) haben gezeigt , dass SNAREs sind nicht nur erforderlich, sondern auch eine ausreichende Membranfusion 10 zu fahren. In diesem bulk Assay mit v-SNARE rekonstituiert SUVs (v-SUV) wurden mit fluoreszierenden Phospholipide (N dotiertem - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) -phosphoethanolamine (NBD-PE) und ( N -. (Lissamins Rhodamin B sulfonyl) -phosphoethanolamine (LR-PE) und gemischt mit nicht - markierten Vesikeln t-SNAREs (t-SUV) Zunächst wird die Fluoreszenz von NBD-PE in v-SUVs wird abgeschreckt durch Förster - Resonanzenergietransfer (FRET enthaltend ) zu LR-PE. Da LaborELED v-SUVs Sicherung mit unmarkiertem t-SUVs, das Fluorophor Oberflächendichte in der nun kombinierten Membran reduziert wird und die sich ergebende Erhöhung der NBD-PE - Fluoreszenz berichtet , um das Ausmaß der Lipid - 10 gemischt wird . Da der Groß Assay einfach einzurichten und zu analysieren ist, wurde es allgemein zu untersuchen Mechanismen der SNARE-vermittelte Fusion 10-14 verwendet. Allerdings hat es einige Einschränkungen, wie niedrige Empfindlichkeit und schlechte Zeitauflösung. Am wichtigsten ist, als Ensemble-Messung, mittelt Ergebnisse aller Ereignisse zwischen docking und Fusion sowie Detektion von hemifusion Zwischenprodukte erschwert Diskriminierung. In den letzten zehn Jahren mehrere Gruppen, darunter auch unsere, haben neue Assays entwickelt , um Fusionsereignisse an der einzelnen Vesikel Ebene 15-27 überwachen. Ha und Kollegen verwendeten V-SUVs auf eine Oberfläche gebunden und überwacht ihre Fusion mit kostenlosen T-SUVs 18,19. Lipidmischung wurde unter Verwendung von FRET zwischen einem Paar von Lipid-gebundenen Fluorophoren überwacht emin der v- und T-SUVs bett jeweils 18 Totalreflexions - Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie. Später benutzte Brunger Labor eine einzige Lipid-Label - Spezies zusammen mit einem Inhalt Marker für die simultane Detektion von Lipid und Inhalt 20,28 mischen. Sowohl das Lipid und die Inhalte Marker wurden bei hohen, selbstlöschenden Konzentrationen enthalten sind; Fusion mit unmarkierten SUVs führte Fluoreszenz Dequenching 20,28. Andere haben fusioniert v-SUVs auf planaren Doppel Rekonstitution mit t-SNAREs 15-17,21-27,29. Die planare Geometrie des Targets (t-SNARE enthält) bilayer besser imitiert die physiologische Fusionsprozess von kleinen, stark gekrümmten Vesikel mit einer flachen Plasmamembran. Die Steinem Gruppe poren Spanning Membranen rekonstituiert mit t-SNAREs, suspendiert über ein poröses Siliciumnitridsubstrats und detektiert Fusion mit einzelnen V-SUVs mit der konfokalen Laser - Scanning - Mikroskopie 23 eingesetzt. Andere fgebrauchte v-SUVs zu planar bilayers mit t-SNAREs rekonstituiert, auf einem Glassubstrat 15-17,21,22,24-27,29 unterstützt. Der große Vorteil bei der Verwendung unterstützt Bilayer (SBLS) ist, dass die TIRF-Mikroskopie verwendet werden können, Docking und Fusionsereignisse mit hervorragenden Signal-Rausch-Verhältnis und ohne Interferenz von freiem V-SUVs zu erkennen, obwohl auch Einzelereignis Mikrofluidik mit Auflösung bietet mit Standard Fernfeld - Epifluoreszenzmikroskopie 24. Ein wichtiges Anliegen ist, ob und wie Substrat-Wechselwirkungen Bilayer Bilayer Qualität und den Fusionsprozess unterstützt Affekt. Frühe Arbeiten gemacht Verwendung von planaren SBLS , die auf einem Glas- oder Quarzsubstrat 15-17 direkt unterstützt wurden. Diese SBLS wurden durch Adsorption hergestellt, bersten, Aufstreichen und Fusion von T-SUV Membranen auf dem Substrat. Es wurde jedoch bald erkannt, dass ein Schlüssel t-SNARE-Komponente weggelassen, SNAP25 aus SBLS auf diese Weise hergestellten führte V-SUV Andocken und Fusion Kinetik indistinguisHable von denen 17 mit der kompletten t-SNAREs erhalten. Da SNAP25 absolut für die Fusion in vivo 30,31 erforderlich ist, wurde die physiologische Relevanz dieser frühen Versuche in Frage gestellt. Tamm Gruppe überwanden diese Herausforderung durch eine bessere Verwendung von 21 unterstützten Doppelschichtbildung gesteuert. Es verwendete Langmuir-Blodgett - Abscheidung für die proteinfreie erste Beilage des SBL, gefolgt von der Fusion von dieser Monoschicht mit t-SUVs 21. Dies resultierte in SNAP25 abhängigen Fusion. Potentielle Artefakte mit einer Doppelschicht direkt unterstützt auf einem Glassubstrat ohne die Notwendigkeit zu verwenden , Langmuir-Blodgett - Verfahren, zu vermeiden, Karatekin et al. Eingeführt einem weichen, hydratisierten Poly (ethylenglycol) (PEG) Polsters zwischen der Doppelschicht und dem Substrat 24. Diese Änderung führte auch in SNAP25 abhängigen Fusion 24. Doppelschichten auf einer Schicht weichen Polymer abgefedert war bekannt Trans besser zu bewahrenProtein Mobilität und Funktion 32, und hatte in der Fusionsstudien mit Viren 33 verwendet. Zusätzlich PEGylierten bilayers scheinen gewisse Fähigkeit zur Selbstheilung und sind sehr robust 34,35 zu halten. Zunächst wird eine Fraktion des handelsüblichen, Lipid-gebundenen PEG-Ketten sind in der t-SUV-Membran enthalten. Wenn diese t-SUVs bersten und eine planare Doppelschicht auf einem Glassubstrat bildet, erstreckt sich ein PEG brush beide Blättchen der planaren Bilayer. Weil planaren Doppelschichtbildung durch Anhaften der PEG-Ketten umgebenden t-SUVs auf die hydrophile Glasoberfläche, Liposom Berst- und planaren Doppelschichtbildung sind relativ unempfindlich gegenüber der Lipidzusammensetzung eingesetzt angetrieben wird. Wenn jedoch große Mengen an Cholesterin enthalten sind, die Kohäsionseigenschaften der SUVs zu erhöhen, können die SUVs nicht spontan platzen. Wenn dies der Fall ist, kann osmotischen Schock oder zweiwertige Ionen eingesetzt werden 25 planar Doppelschichtbildung zu helfen. Wie oben erwähnt, in diesem apsatz eine PEG-Bürste auf beiden Seiten des ebenen umfasst, supported bilayer. Die Bürste den mikrofluidischen Strömungskanal zugewandt hilft unspezifischen Adhäsion von eingehenden v-SUVs zu verhindern, die sich auch in der Regel mit einer PEG-Schicht bedeckt. Die Bildung von v- und T-SNARE - Komplexen geht von der Membran-distalen N-Termini und verläuft in Stufen in Richtung der Membran-proximalen Domänen 36. Für die V-SUVs mit dem t-SBL, die v- und t-SNARE N-Termini Notwendigkeit vorzustehen über den PEG Bürsten zu interagieren, was der Fall unter den Bedingungen des Assays zu sein scheint. Bürstenhöhe können an andere Proteine ​​als SNAREs studieren angepasst werden , indem die Dichte von PEGyliertem Lipiden variierende und die PEG - Kettenlänge 37,38. Ein weiterer Vorteil der PEG - Bürsten die proximalen Oberflächen der Fusionieren Bilayer bedeckt , ist , dass sie die überfüllten Umgebung von biologischen Membranen imitieren , die mit 30.000-40.000 integrale Membranproteine ​​pro Quadratmikrometer 39 verpackt werden. Genau wie die PEG-Ketten in diesem Assay die repulsive Proteinschicht, die biologischen Membranen muss gedrückt werden, zur Seite für den Kontakt zwischen den beiden Phospholipiddoppelschichten zu ermöglichen für die Fusion auftritt. Mikrofluidischen Strömungskanäle werden in diesem Test verwendet, da sie einzigartige Vorteile bieten. Erstens ermöglicht mikrofluidischen Strömungs einheitlichere Abscheidung von T-SUVs zu verbreiten und Sicherung der t-SBL zu bilden. Zweitens ist die kleine Kanalvolumen (&lt;1 &amp; mgr; l) minimiert Probenverbrauch. Drittens benötigt die kleinen Volumina ermöglichen das gesamte Experiment unter konstanten Fluss durchgeführt werden. Fluss entfernt schwach, vermutlich nicht spezifisch haftete v-SUVs von der SBL 16. Es unterhält auch eine konstante Dichte von v-SUVs über dem t-SBL, kinetische Analyse zu vereinfachen 17. Schließlich werden dockt Vesikel aus kostenlos sind durch die Strömung 25 durch leicht zu unterscheiden. Viertens mehrere mikrofluidische Kanäle auf dem gleichen Deckglas verwendet werden, die jeweils einen anderen Zustand Sondieren. Dies ermöglicht den Vergleich der Bedingungen during der gleichen Versuchslauf. Ein ähnlicher Ansatz wurde von der van Oijen Gruppe verwendet Fusion zwischen Influenza - Virus zu studieren und gepolsterten SBLS 33. In TIRF Mikroskopie, das exponentielle Abklingen des evaneszenten Feldes (mit einer Zerfallskonstante ~ 100 nm) Fluoreszenzanregung beschränkt auf diejenigen Moleküle, die in unmittelbarer Nähe der Glaspufferschnittstelle sind. Dies minimiert Beitrag von fluoreszierenden Molekülen, die weiter entfernt sind, erhöht das Signal-zu-Rauschverhältnis und erlaubt Einzelmolekülempfindlichkeit mit Rahmen Belichtungszeiten von 10-40 msec. Das abklingende Feld führt auch zu einem Signalanstieg beim Schmelzen: als markierter Lipide Transfer vom SUV in die SBL, finden sie sich im Durchschnitt in einer stärkeren Erregungsfeld. Dieser Anstieg in der Fluoreszenz ist für größere Liposomen stärker. Wenn polarisiertes Licht verwendet wird, das abklingende Feld zu erzeugen, tragen zusätzliche Effekte zu Veränderungen in der Fluoreszenz auf transfer von Etiketten aus dem SUV in die SBL. Einige Lipid-Farbstoffe haben einen Übergangsdipolmomente orientiert mit einem bevorzugten mittleren Winkel in Bezug auf die Doppelschicht in die sie eingebettet sind. Dies erzeugt eine Differenz in der Menge an Fluoreszenz , die durch die Fluorophore emittiert wird, wenn sie in der gegenüber dem SUV SBL sind, da die polarisierten Strahl Farbstoffe in den beiden Membranen unterschiedlich erregt wird. Für erstere wird der Anregungsstrahl mit Übergangsdipole interagieren um den sphärischen SUV orientiert, während für letztere Dipolorientierungen wird durch die flache SBL Geometrie beschränkt werden. Wenn beispielsweise s-polarisierte einfallende Licht (polarisiertes normal zur Einfallsebene) verwendet wird, ist Erregungs effizienter , wenn der Farbstoff in der SBL ist als im SUV für eine Lipidfarbstoff Übergangsdipolmomente parallel zu der Membran 29,40 (wie die von Dil oder DiD 41-43). Ein SUV mit einem solchen Fluorophor dotierten erscheint dunkler , wenn es Docks auf die SBL (Bild 7, Representat<html> ive Ergebnisse). Als Fusions Pore öffnet und verbindet die SUV und SBL Membranen diffundieren Fluoreszenzsonden in das SBL und werden eher durch den s-polarisierten abklingende Feld 25,27,29 angeregt werden. Folglich erhöht sich das Fluoreszenzsignal um die Fusionsstelle integriert scharf während der Farbstoffübertragung von dem SUV in die SBL 27 (Abbildung 3 und Abbildung 7). Ein zusätzlicher Faktor, der auf Signaländerungen trägt, die Fusions begleiten wird Dequenching von Fluoreszenzmarkierungen, wie sie verdünnt werden, wenn sie in die SBL übertragen. Der Beitrag der Dequenching ist üblicherweise gering im Vergleich zu abklingende Feld Zerfalls und Polarisationseffekte in dem Assay hier beschrieben, da nur ein kleiner Bruchteil ( <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ) Der Lipide sind markiert. Der Signalanstieg bei Fusion kann ausgenutzt werden, um Fusionsporeneigenschaften ableiten, indem sie die Zeit zu vergleichen,1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;, die für ein Lipid durch eine Pore zu entkommen, die frei durchlässig Lipide auf die tatsächliche Release-Zeit ist, <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> . Wenn die beiden Zeitskalen vergleichbar sind, würde geschlossen werden, daß die Poren wenig Widerstand gegen Lipidfluss darstellt. Wenn jedoch die tatsächliche Auslösezeit wesentlich länger als die Zeit für die Diffusion begrenzte Freisetzung ist, wäre dies ein Verfahren zeigen, wie Poren Flackern, Lipid-Freisetzung zu verzögern. Die diffusionsbegrenzten Freigabezeit, <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> , Hängt von der Größe des Schmelz Liposom und Lipid-Diffusionsvermögen; seine Schätzung erfordert diese beiden Parameter zu quantifizieren. Die Einzelmolekülempfindlichkeit des Assays ermöglicht Lipid Diffusität durch die Verfolgung mehrerer Einzellipid Fluorophore nach ihrer Freisetzung in die SBL für jedes Fusionsereignis 26 gemessen werden. Die Größe jedes Verschmelzen Vesikel27 durch die Kombination von (i) geschätzt werden , um die Intensität eines einzelnen Lipid Farbstoff kann, (ii) die Änderung der Gesamtfluoreszenz um eine Andockstelle nachdem alle Fluorophore in die SBL beim Schmelzen übertragen werden, (iii) die bekannte Markierungsdichte von SUV Lipide, und (iv) die Fläche pro Lipid. Für viele Fusionsereignisse wurden die tatsächlichen Lipid Freisetzungszeiten gefunden viel langsamer als 27 durch diffusionskontrollierte Freisetzung erwartet, wie zuvor einheitliche Größe SUV 44 unter der Annahme festgestellt wurde. Unter der Annahme , Verzögerung der Lipid - Freisetzung durch flackert Poren, ein quantitatives Modell ermöglicht Schätzung von &quot;Poren Offenheit&quot;, der Anteil der Zeit bleibt die Pore offen bei der Fusion 27. Wann immer praktisch, ist es wichtig, Fusionsmechanismen zu testen, unter Verwendung von sowohl Lipid und löslichen Inhalt Etiketten. Zum Beispiel könnte Lipid-Freisetzung durch andere Prozesse als die Poren Flackern, wie die Beschränkung der Lipid-Diffusion durch die SNARE-Proteine, die Surround-t verzögert werdener Pore. Wenn dies der Fall wäre, dann loslassen Inhalts würde Freisetzung von Lipid Etiketten voran, vorausgesetzt die Poren groß genug ist, Durchgang von löslichen Sonden zu ermöglichen. Ein grundlegender Fehler im Ansatz könnte in der Annahme sein, dass die Übertragung von markierten Lipide an die SBL einer engen Fusionspore erfolgt durch die SBL zu einem Vesikel anschließen, der seine Pre-fusion Form weitgehend erhalten hat. Lipid - Transfer in die SBL könnte auch mit einer begleitenden von einer schnellen Erweiterung der Fusionspore führen, extrem schnellen Zusammenbruch des SUV in die SBL - Membran, wie zuvor auf den Lipidfreisetzungsdaten allein 29 basierend vorschlug. Überwachung sowohl Lipid und Inhalt freigeben gleichzeitig wurde festgestellt , dass viele Poren wieder verschlossen , nachdem alle Etiketten ihre Lipid zu veröffentlichen, aber 27 einige ihrer löslichen Ladung erhalten. Dies zeigt, dass zumindest einige Liposomen in die SBL nicht nach dem Verschmelzen kollabieren, und daß die Lipidfarbstoffübertragung in die SBL Fusions Pore erfolgt durch. Zudem lIPID und Inhalt Release aufgetreten 27 gleichzeitig, ist es unwahrscheinlich , dass Verzögerung der Lipid - Release machen zurückzuführen war durch die SNARE - Proteine ​​von Lipiddiffusion Behinderung 45 der Pore umgibt. Ein SUV-SBL Fusionsprotokoll , die nicht löslichen Anteile Release überwachen tat , war zuvor von Karatekin und Rothman 25 veröffentlicht. Hier neuere Entwicklungen enthalten sind, nämlich die gleichzeitige Überwachung von Lipid und Inhalte freigeben und die Schätzung von SUV, Lipid und Fusionspore - Eigenschaften 27. Das Protokoll beginnt mit Anweisungen für die Mikrofluidik - Zellen vorbereitet, hergestellt durch ein Poly (dimethylsiloxan) Bindung (PDMS) Elastomerblock enthält Rillen mit einem Deckglas 25. Als nächstes Herstellung von v-SUVs mit sowohl Lipid und Inhalt Marker erläutert. Abschnitte 4 und 5 enthalten Anweisungen für die Mikrofluidik - Zellen zusammenbauen, die SBLS in situ Bildung und Überprüfung auf Defekte und Flüssigkeit, die Einführung von vSUVS in den Flusszellen und die Detektion von Fusionsereignissen. Abschnitt 6 enthält Anweisungen für die Datenanalyse.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenzien</td></tr><tr><td>Milli-Q (MQ) Wasser</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 190 Proof</td><td>Decon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A416P4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcholrid (KCl)</td><td>AmericanBio</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490</td><td></td></tr><tr><td>N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409911000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>HEPES-KOH-Puffer (pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>25 mM HEPES-KOH, 140&nbsp; mM KCl, 100&nbsp; &mu; M EGTA, 1&nbsp; mM DTT</td></tr><tr><td colspan="4"><stark>Lösungsmittel</stark></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>9180-01</td><td>in Glasflasche, ACHTUNG, PSA</td></tr><tr><td>Methanol</td> tragen <td>J.T. Baker</td><td>9070-03</td><td>in Glasflasche, ACHTUNG, PSE</td></tr><tr><td colspan="4"><stark>Liposomenpräparat</stark></td></tr><tr><td>Gasdichte Hamilton Spritze</td><td>Hamilton</td><td>var. Größen</td><td>nur Glasschere mit Solenten verwenden (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)</td></tr><tr><td>Glasröhrchen Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm Schraubverschluss Kulturröhrchen</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>70825-16</td><td>gründlich reinigen, spülen mit Chloroform</td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, 16:0-18:1 PC (POPC)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850457</td><td>Lipide werden in CHCl3 oder als lyphilisiertes Pulver in verschlossenen Durchstechflaschen gelöst. Aliquot beim Öffnen. Übereinander als getrocknete Lipidfilme unter inerter Atmosphäre bei -20 °C lagern. Lagerbestände in CHCl<>sub3/MeOH (2:1, v/v) bei -20 °C lagern. Vor dem Öffnen</td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (Natriumsalz), 18:1 PS (DOPS)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840035</td><td>Wie oben lagern.</td></tr><tr><td>1-Stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850804</td><td>Wie oben.</td></tr><tr><td>L-&-alpha;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (Gehirn, Schwein) (Ammoniumsalz), Gehirn PI(4,5)P2</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840046</td><td>Wie oben.</td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(7-Nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (Ammoniumsalz), 18:1 NBD PE</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>810145</td><td>Wie oben.</td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz), 18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>880130</td><td>Wie oben.</td></tr><tr><td>Cholesterin (Schafwolle, >98%)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>Wie oben.</td></tr><tr><td>DiD'-Öl; DiIC18(5)-Öl (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanin-Perchlorat)</td><td>Molekulare Sonden</td><td>D-307</td><td></td></tr><tr><td>Rotavapor R-210</td><td>Büchi</td><td>R-210</td><td>Wärmebad über Tm der verwendeten Lipide</td></tr><tr><td>OG n-Octyl-&beta;-D-Glucopyranosid</td><td>Affymetrix</td><td>0311</td><td>lagern bei -20 &de; C, vor dem Öffnen auf RT kommen lassen</td></tr><tr><td>Schüttler - Eppendorf Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyze Dialysekassetten, 20k MWCO, 3&nbsp; ml</td><td>life technologies</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbentien</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&nbsp; Dichtegradient Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugationsröhrchen, dünnwandig, ultraklar, 13,2&nbsp; ml, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Schar</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41 Ti Rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuflorhodamineB</td><td>Molekulare Sonden</td><td>S-1307</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Säule&nbsp; Chromatographie-Säulen, 2,5-fach; 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0150-01</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange Protein Gel Stain</td><td>Molecular Probes</td><td>S-6650</td><td>5.000x Konzentrat in DMSO</td></tr><tr><td colspan="4">PDMS block</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer-Kit, PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale aus Pyrex-Glas, 150 x 20 mm, komplett mit Abdeckung</td><td>Corning</td><td>3160-152</td><td></td></tr><tr><td>Locher - Wiederverwendbarer Biopsie-Stanzer, 0,75&nbsp; mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Manuelle Lochstanzmaschine&nbsp;</td><td>SYNEO</td><td>MHPM-UNV</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN beschichteter Rundstempel</td><td>SYNEO</td><td>CR0350265N20R4</td><td>Bohrdurchmesser: 0.9 mm, Bohrungsgröße: 0.74 mm</td></tr><tr><td>Tygon Microbore Schlauch, 0.25 mm ID, 0.76 mm AD</td><td>Cole-Parmer</td><td>06419-00</td><td>0.010" ID, 0.030" OD</td></tr><tr><td>Silikonschlauch (0.51 mm ID, 2.1 mm AD</td><td>Cole-Parmer</td><td>95802-00</td><td>0.020" ID, 0.083" OD</td></tr><tr><td colspan="4">Deckglas - Reinraum gereinigt</stark></td></tr><tr><td>Schott Nexterion Deckglas D</td><td>Schott</td><td>1472305</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pTIRF Aufbau und Zubehör</td></tr><tr><td>IX81 Mikroskopgehäuse</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>EM CCD-Kamera</td><td>Andor</td><td>ixon-ultra-897</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate, beheizter Mikroskoptisch</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U52RA26</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Hamilton Glasspritzen (4x)</td><td>Hamilton</td><td>81365</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>kd Scientific</td><td>KDS-230</td><td></td></tr></tbody></table>

snare-vermittelte fusion von einzelproteoliposomen mit tethered unterstützte bilayers in einer zelle mikrofluidik-flow-Überwacht durch polarisierte tirf mikroskopie

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In der allgegenwärtigen Prozess der Membranfusion die Eröffnung einer Fusionspore gründet die erste Verbindung zwischen zwei ehemals getrennten Fächern. Während Neurotransmitter oder Hormonfreisetzung über Exozytose, kann die Fusionspore vorübergehend öffnen und schließen sich immer wieder, die Regulierung Ladung Freisetzungskinetik. Pore ​​Dynamik bestimmen auch die Art der Vesikelrecycling; irreversible Wiederverschließbarkeit Ergebnisse in transient, &quot;kiss-and-run&quot; Fusion, während Dilatation führt zu Vollfusion. Um besser zu verstehen , welche Faktoren bestimmen Poren Dynamik entwickelten wir einen Test der Membranfusion unter Verwendung von polarisierten Totalreflexions - Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie mit Einzelmolekülempfindlichkeit und ~ 15 ms Zeitauflösung in einem biochemisch gut definierten in vitro - System zu überwachen. Fusion von fluoreszenzmarkierten kleine unilamellare Vesikel enthalten, v-SNARE-Proteine ​​(v-SUVs) mit einem planaren Bilayer Lager T-SNAREs, auf einem weichen Polymer Kissen unterstützt (t-SBL, t-supported bilayer), Wird überwacht. Der Test verwendet mikrofluidischen Strömungskanäle, die nur minimale Probenverbrauch gewährleisten, während eine konstante Dichte von SUVs liefern. Ausnutzen der schnellen Signalverstärkung bei der Übertragung von Lipid-Etiketten aus dem SUV auf die SBL bei der Fusion, die Kinetik der Lipid-Farbstoffübertragung wird überwacht. Die Empfindlichkeit der TIRF-Mikroskopie ermöglicht es einzelnen fluoreszierenden Lipid-Etiketten-Tracking, von dem Lipid Diffusität und SUV-Größe kann für jede Fusion Veranstaltung abgeleitet werden. Lipid Farbstofffreisetzungszeiten können viel länger sein als für die ungehinderte Passage erwartet durch permanent offenen Poren. Mit Hilfe eines Modells, das Verzögerung der Lipid-Release übernimmt aufgrund flackert Poren, eine Pore &quot;Offenheit&quot;, den Anteil der Zeit, die Poren bei der Fusion offen bleibt, kann abgeschätzt werden. Ein lösliches Marker kann in den SUVs für die gleichzeitige Überwachung von Lipid und lösliche Ladung Freisetzung verkapselt werden. Solche Messungen zeigen einige Poren nach dem Verlust einer Fraktion des löslichen Ladung wieder verschließen kann.

SBL - Qualität Es ist wichtig, die Qualität und die Fluidität des SBL vor dem Fusionsexperiment zu verifizieren. Die Fluoreszenz an der Unterseite, Glasseite eines mikrofluidischen Kanal sollte ohne offensichtliche Mängel einheitlich sein. Wenn eine Luftblase, obwohl der Kanal passiert, lässt es in der Regel sichtbare Narben auf der SBL. Wenn es eine solche groß angelegte Narben / Defekte sind...

Hier präsentieren wir ein Protokoll Single, SNARE-vermittelte Fusion Ereignisse zwischen Liposomen und unterstützt Bilayer in mikrofluidischen Kanälen unter Verwendung von polarisierten TIRFM, mit Einzelmolekülempfindlichkeit und ~ 15 ms Zeitauflösung zu erfassen. Lipid und lösliche Ladung Freisetzung können gleichzeitig erfasst werden. Liposomgröße, Lipid-Diffusität und Fusion Poreneigenschaften gemessen werden.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, einzelne Membranfusionsereignisse zu beobachten, die durch neuronale und exozytotische SNARE-Proteine vermittelt werden, um die grundlegenden Mechanismen der Freisetzung von Neurotransmittern und Hormonen zu verstehen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Membranfusion zu beantworten, beispielsweise wie die Freisetzung von Frachtstoffen über ein dynamisches Fusionspore erfolgt und welches Schicksal die Pore nach der Fusion hat. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass einzelne Stadien der Vesikel-Dockung, der Fusion zur Porenöffnung sowie die Kinetik der Frachtstofffreisetzung für einzelne Ereignisse in biochemisch definierten Umgebungen beobachtet werden können.Obwohl diese Methode Einblicke in die Exozytose ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Membran-Fusionsreaktionen anwenden, beispielsweise auf die Fusion von umhüllten Viren mit Zielzellmembranen während einer Infektion. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da viele verschiedene Schritte – von der Mikrofabrikation bis zur Proteinreinigung und Bildgebung – beherrscht werden müssen. Beginnen Sie

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Unterstützte planaren Doppelschichten sind leistungsfähige Werkzeuge, die verwendet werden, um die molekularen Wechselwirkungen in einer immunologischen Synapse Modell werden können. Hier zeigen wir Methoden zur Verankerung Zelladhäsionsproteine ​​bekannt zu modulieren Synapsenbildung an der oberen Flugblatt der Lipid bilyer und visualisieren Synapsenbildung mit TIRF-Mikroskopie.

Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Wir haben eine Zellfusion Assay, SNARE-vermittelte Membranfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase entwickelt.

Analyse der SNARE-vermittelte Membranfusion Verwendung eines enzymatischen Cell Fusion Assay

Polarisation-basierte Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) ermöglicht die Echtzeit-Erkennung von Zellmembrandynamik. Dieser Artikel beschreibt die Umsetzung der pTIRFM für das Studium der Membran Umbau während regulierten Exozytose. Die Technik ist generalisierbar auf andere Prozesse in der Zellbiologie, die Veränderungen in Membranform, die direkt oder indirekt beteiligen.

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

Die Herstellung von proteinfunktionalisierten planaren glasgestützten Lipiddoppelschichten, die Bestimmung der Proteinmobilität innerhalb und die Messung von Proteindichten wird hier gezeigt. Es wird eine Roadmap zum Bau eines rauschreduzierten Totalreflexionsmikroskops skizziert, das die Visualisierung von in einzelnen Doppelschichten residenten Fluorochromen mit hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren für die quantitative Darstellung der Komplexbildung des SNARE-Proteine, basierend auf Förster Resonance Energietransfer und Fluoreszenz Lifetime imaging-Mikroskopie ermöglicht.

Visualisierung von intrazellulären SNARE Menschenhandel durch Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Mitochondriale Fusion ist eine wichtige panostatische Reaktion, die der mitochondrialen Dynamik zugrunde liegt. Hier wird ein In-vitro-Rekonstitutionssystem beschrieben, um die mitochondriale Innenmembranfusion zu untersuchen, die Membran-Tethering, Andocken, Hämifusion und Porenöffnung auflösen kann. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes bei der Erforschung von Zellmembransystemen wird diskutiert.

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung und Analyse der Bindung, Mobilität und Assemblierung einzelner Moleküle auf künstlichen überfüllten Lipidmembranen unter Verwendung der Einzelmolekül-Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (smTIRF) vorgestellt.

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Dieses Protokoll beschreibt, wie die TIRF-Mikroskopie verwendet werden kann, um einzelne Ionenkanäle zu verfolgen und ihre Aktivität in geträgerten Lipidmembranen zu bestimmen, wodurch das Zusammenspiel zwischen lateraler Membranbewegung und Kanalfunktion definiert wird. Es beschreibt, wie die Membranen vorbereitet, die Daten aufgezeichnet und die Ergebnisse analysiert werden.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung, wie Proben für die Tracking von Einzelproteinen in festgestützten Lipiddoppelschichten erstellt werden können. Es erklärt außerdem ein einfaches Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülempfindlichkeit und hoher Bildrate. Abschließend skizzieren wir das Verfahren zur Extraktion von Einzelprotein-Trajektorien.

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Erfahren Sie die Beobachtung einzelner SNARE-vermittelter Membranfusionsereignisse mit polarisierter TIRF-Mikroskopie in einer mikrofluidischen Zelle. Diese Methode ermöglicht die simultane Detektion von Lipid- und Frachtfreisetzung mit hoher Zeitauflösung.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie (Video) | JoVE Journal

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

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