SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, einzelne Membranfusionsereignisse zu beobachten, die von neuronalen und exozytotischen SNARE-Proteinen gesteuert werden, um grundlegende Mechanismen der Neurotransmitter- und Hormonfreisetzung zu verstehen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Membranfusion zu beantworten, z. B. wie die Ladungsfreisetzung durch eine dynamische Schmelzpore erfolgt und welches Schicksal die Pore nach der Fusion hat. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass unterschiedliche Stadien des Vesikelandockens, der Fusion zum Öffnen und der Kinetik der Ladungsfreigabe für einzelne Ereignisse in biochemisch definierten Umgebungen beobachtet werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Exozytose geben kann, kann sie auch auf andere Membranfusionsreaktionen angewendet werden, wie z. B. die Fusion von Hüllviren mit Zielzellmembranen während der Infektion. In der Regel werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da viele verschiedene Schritte von der Mikrofabrikation über die Proteinreinigung bis hin zur Bildgebung gemeistert werden müssen. Bereiten Sie zunächst eine Silikon-Masterform unter Verwendung von Standard-Fotolithographietechniken und der hier gezeigten Vorlage vor.

Geben Sie anschließend 100 Milliliter PDMS-Base und 10 Milliliter des Härters in einen Einweg-Plastikbecher und rühren Sie die Mischung gut um. Stellen Sie dann den Becher in einen Vakuumexsikkator. Wenden Sie ein Vakuum an, aber beobachten Sie es genau, um ein Überlaufen der Mischung zu verhindern.

Gießen Sie nach der Entgasung einen großen Tropfen der entgasten PDMS-Mischung in eine Petrischale aus Glas und drücken Sie die Form mit der Schablonenseite nach oben auf das PDMS, um Blasen unter dem Wafer zu vermeiden. Gießen Sie nun entgastes PDMS auf die Schablone, bis sie von fünf bis acht Millimetern des Polymers bedeckt ist. Wenn eine Luftblase auftritt, entfernen Sie diese vorsichtig mit einer Pipettenspitze.

Legen Sie die mit PDMS abgedeckte Schablone auf die ebene Fläche eines Ofens und backen Sie sie drei Stunden lang bei 60 Grad Celsius. Schneiden Sie dann mit einer neuen Skalpellklinge einen PDMS-Block aus, der die geformten Kanalstrukturen enthält. Beachten Sie, dass der ausgeschnittene Block auf ein Deckglas passen muss.

Platzieren Sie als Nächstes die seitlichen Rillen des Kanals nach oben und bohren Sie mit einem Locher in einer kontinuierlichen Bewegung durch den Block. Achten Sie darauf, das ausgestanzte Stück an jeder der acht Lochstellen zu entfernen. Wenn du fertig bist, klebe die Blockrillen nach unten auf ein sauberes Stück Alufolie.

Schneide nun den Schlauch so ab, dass er an einem Ende eine leichte Schräge hat, und schiebe den Schlauch mit einer Pinzette etwa ein Drittel des Weges in die gestanzten Löcher. Schneiden Sie die Schläuche so ab, dass sie den Pufferbehälter und die Spritzenpumpe erreichen können. Um den Schlauch mit den Spritzen an der Spritzenpumpe zu verbinden, schneiden Sie ein kurzes Stück aus dem größeren Silikonschlauch ab und führen Sie den dünneren Schlauch in eine Seite ein.

Dieser gebrauchsfertige PDMS-Block kann einige Monate aufbewahrt werden. Legen Sie zunächst den PDMS-Block für mindestens 20 Minuten unter Hochvakuum, um gelöste Gase zu entfernen und das Risiko von Luftblasen in den mikrofluidischen Kanälen während des Fusionsexperiments zu verringern. Stellen Sie anschließend sicher, dass der Bereich des Mikroskoptisches auf die gewünschte Temperatur eingestellt ist.

Während sich die Temperatur ausgleicht, bereiten Sie die fluoreszenzmarkierten NBD-PE-Vesikel vor, die t-SNARE-Proteine enthalten, oder proteinfreie Kontrollen, indem Sie 30 Mikroliter der Vesikel mit 60 Mikrolitern Puffer verdünnen. Ziehe dann die Lösung in eine Drei-Milliliter-Spritze auf. Drücken Sie den größten Teil der Luft über der Probe heraus, während Sie die Spritze senkrecht halten.

Versiegeln Sie dann die Spitze mit Paraffinfolie und erzeugen Sie ein Vakuum, indem Sie den Kolben nach unten ziehen. Während Sie ein Vakuum ziehen, klopfen Sie auf den Spritzenzylinder, um die Entgasung der Lösung zu beschleunigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang einige Male, bis beim Anlegen des Vakuums keine Luftblasen mehr entstehen.

Verwenden Sie als Nächstes eine Injektionsnadel mit einem Durchmesser, der etwas größer als der mikrofluidische Schlauch ist, um ein Loch in die Kappe eines Mikrozentrifugenröhrchens zu stanzen. Füllen Sie die entgasten kleinen unilamellären Vesikel in das Mikrozentrifugenröhrchen, setzen Sie es in die Halterung auf dem Mikroskoptisch ein und lassen Sie die Lösung auf die eingestellte Temperatur ausgleichen. Legen Sie einen sauberen Deckglas in einen Plasmareiniger und lassen Sie das Abdeckglas etwa fünf Minuten lang mit Luftplasma besprühen.

Entfernen Sie dann den Deckbezug und legen Sie ihn mit der behandelten Seite nach oben auf ein paar fusselfreie Taschentücher, die als Kissen dienen. Legen Sie als Nächstes den PDMS-Block mit der gemusterten Seite nach unten auf den Deckglas. Drücke mit einer Pinzette vorsichtig auf den Block, aber drücke nicht so fest, dass das Glas zerbricht.

Platzieren Sie die zusammengebaute Durchflusszelle auf dem Mikroskoptisch. Verbinden Sie dann die Schläuche mit den kleinen unilamellären Vesikelreservoirs und mit der Spritzenpumpe. Beginnen Sie mit dem Aspirieren der kleinen unilamellären Vesikel mit drei Mikrolitern pro Minute, bis die Lösung die Kanäle vollständig ausfüllt.

Wenn sich die Lösungen in allen Kanälen in den Schläuchen auf der Austrittsseite nach oben bewegen, reduzieren Sie den Durchfluss auf 0,5 Mikroliter pro Minute und inkubieren Sie 30 bis 45 Minuten lang. Die Zeit zwischen der Plasmabehandlung des Glasabdeckglases und dem Einströmen der SUVs in den Kanal sollte 10 Minuten nicht überschreiten, da die Wirkung der Plasmabehandlung vorübergehend ist. Überprüfen Sie die Kanäle mit Hilfe der Fluoreszenzbildgebung mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung auf Lecks und spülen Sie dann alle Kanäle mit entgastem Puffer aus, um ungebundene Vesikel wegzuspülen.

Wechseln Sie dann zum Ölimmersionsobjektiv mit hoher Vergrößerung für die TIRF-Mikroskopie und befestigen Sie die Durchflusszelle, indem Sie sie auf den Mikroskoptisch kleben. Schließen Sie die Blende des Feldes auf einen Durchmesser von etwa 40 Mikrometern und stellen Sie die Anregungslichtintensität von 488 Nanometern mit der Software ein, um die Fluoreszenz im belichteten Bereich deutlich, aber nicht vollständig zu bleichen. Die Fluoreszenzintensität in der Mitte des belichteten Bereichs sollte geringer sein als an den Rändern, da die intakten NBD-PE-Moleküle vor dem Bleichen in eine gewisse Distanz eindringen und diffundieren.

Wenn die oberflächenhaftenden SUVs jedoch nicht platzen, sollten alle Fluorophore im exponierten Bereich bleichen. Um die Ergebnisse der Messungen des Studienzustands zu überprüfen, stoppen Sie die Beleuchtung und starten Sie sie einige Minuten später neu, um zu sehen, ob sich die Fluoreszenz erholt hat. Entgasen Sie den Rekonstitutionspuffer und verwenden Sie ihn, um die v-SNARE-rekonstituierte kleine unilamelläre Vesikel-Stammlösung zu verdünnen, so dass die resultierende Lösung im Verlauf von 60 Sekunden 10 bis 100 Fusionsereignisse im Sichtfeld erzeugt.

Zu viele Fusionsereignisse erhöhen die Hintergrundfluoreszenz und erschweren die Detektion und Analyse der Ereignisse. Im Gegensatz dazu kann eine zu niedrige Fusionsrate zu schlechten Statistiken führen. Fließen Sie die rekonstituierten v-SNARE-rekonstituierten kleinen unilamellären Vesikel mit einer Flussrate von zwei Mikrolitern pro Minute in den Kanal und wechseln Sie zu den entsprechenden Anregungsemissionseinstellungen, um die Lipidmischung zu überwachen.

Passen Sie dann den TIRF-Winkel und die Polarisation an, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Stimulieren und überwachen Sie kontinuierlich die Fluoreszenz der Vesikel mit einem 561-Nanometer-Laser. Wenn die Vesikel den Strömungskanal erreichen und an die gestützte Doppelschicht andocken und mit ihr verschmelzen, beginnt sich das Hintergrundfluoreszenzsignal zu akkumulieren.

Passen Sie die Intensität des Anregungslasers über die Software an, um die Hintergrundfluoreszenz kontinuierlich zu bleichen, so dass neue Andock- und Fusionsereignisse leicht beobachtet werden können. Nehmen Sie mehrere Filme an verschiedenen Positionen in einem bestimmten Kanal auf. Überprüfen Sie die NBD-PE-Fluoreszenz, um sicherzustellen, dass die unterstützte Doppelschicht an diesen Positionen keine Defekte aufweist.

Die Fluoreszenzerholung nach Photobleichen ist hier für eine t-SNARE-rekonstituierte gestützte Doppelschicht dargestellt, die relativ defektfrei und flüssig war. Der Bereich wird bei schwachem Licht abgebildet, um die Fluoreszenzwiederherstellung durch Diffusion von NBD-markierten Lipiden zu verfolgen. Es ist einfacher, Andock- und Fusionsereignisse zu beobachten, während die Fluoreszenz allein anhand von Lipidmarkierungen überwacht wird.

In der hier gezeigten Bildsequenz wurde alle 18 Millisekunden ein Frame aufgenommen. Bei der Fusion werden die Lipidmarkierungen in die gestützte Doppelschicht übertragen und diffundieren von der Fusionsstelle weg. In einigen Fällen ist es wünschenswert, die Lipidmischung und die Freisetzung löslicher Fracht gleichzeitig zu überwachen.

Ein repräsentatives Ereignis, das die gleichzeitige Vermischung von Lipiden und die Freisetzung löslicher Fracht beschreibt, ist hier dargestellt. Bei den hohen Konzentrationen, die für die Verkapselung verwendet werden, wird die rot dargestellte Fluoreszenz des löslichen Gehalts zunächst selbst abgeschreckt. Ein starker Anstieg der Lipidfluoreszenz, der in Blau dargestellt ist, deutet auf eine Lipidmischung aufgrund eines Fusionsereignisses hin, wie bei der zuvor gezeigten einfarbigen Überwachung von Lipidmarkierungen

Die Porenöffnung setzt löslichen Farbstoff frei und löst die anfängliche Selbstlöschung des Farbstoffs im Vesikellumen. Dies führt zu einer Erhöhung des löslichen Frachtsignals, das rot dargestellt ist. Interessanterweise erreichte die Fluoreszenz der Ladung ein stabiles Plateau.

Dies deutet darauf hin, dass sich die Pore nach der Freisetzung aller Lipidmarkierungen und eines Bruchteils der löslichen Fracht wieder verschlossen hat. Am Ende nimmt das Signal für den löslichen Gehalt, das in Rot dargestellt ist, sehr schnell ab. Dies ist wahrscheinlich entweder auf eine schnelle vollständige Fusion oder das Platzen der Liposomen zurückzuführen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine mikrofluidische Flusszelle aus einer mit t-SNARE-Proteinen rekonstituierten gestützten Doppelschicht vorbereiten und einzelne Vesikelfusionsereignisse mit Hilfe der TIRF-Mikroskopie überwachen und analysieren. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.