Protokoll für die Maus Kreis von Willis Trenn

Das übergeordnete Ziel dieses Präparierverfahrens ist es, den murinen Willis-Kreis zu isolieren, um die Untersuchung der großen Gefäße des Zerebrovaskulaturs der Maus zu erleichtern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Erforschung der zerebrovaskulären Genexpression bei verschiedenen Krankheiten zu beantworten, die die Hirngefäße betreffen, wie z. B. die Alzheimer-Krankheit und die zerebrale ameloide Angiopathie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die großen Gefäße schnell und einfach isoliert werden können, ohne die Gefäßstruktur zu verändern.

Beginnen Sie damit, mit einer Irisschere einen vier Zentimeter langen Schnitt in die Bauchdecke und das Bauchfell einer letalnarkotisierten Maus direkt unter dem Brustkorb zu machen. Machen Sie als Nächstes einen einige Millimeter langen Schnitt in das Zwerchfell und setzen Sie den Schnitt über die gesamte Länge des Brustkorbs fort, um die Pleurahöhle freizulegen. Heben Sie das Brustbein an und klemmen Sie die Spitze mit einem Hämostaten ein, wobei Sie das Blutstillen auf dem Hals ablegen.

Schneiden Sie dann vorsichtig das Fettgewebe ab, das das Brustbein mit dem Herzen verbindet. Führen Sie nun eine 15-Gauge-Profusionsnadel durch den linken Ventrikel in die Herzspitze und schneiden Sie mit einer Schere einen der Leberlappen ab, um einen Ausgang für das Perfusat zu schaffen. Perfundierten Sie das Tier etwa zehn Minuten lang mit 25 bis 50 Millilitern PBS bei einer Pumpleistung von 2,5 Millilitern pro Minute.

Die Leber sollte blanchieren, wenn das Blut durch PBS ersetzt wird. Wenn die Flüssigkeit aus der Leber vollständig klar ist, stoppen Sie die Durchblutung. Um das Gehirn zu isolieren, verwenden Sie eine Irisschere, um einen Mittellinienschnitt entlang der Haut vom Hals bis zur Nase zu machen.

Schneiden Sie die Haut mit der Irisschere ab, um den Schädel freizulegen und Muskel- und Fettgewebereste zu entfernen. Platzieren Sie dann die Iris-Scherenspitzen in eine Seite des Foramen magnum und schieben Sie die Spitzen vorsichtig entlang der inneren Oberfläche des Schädels zum äußeren Gehörgang. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt auf der anderen Seite des Foramen magnum, gefolgt von einem Mittellinienschnitt entlang der Innenfläche des interparietalen Knochens bis zum Anfang der sagittalen Naht.

Platzieren Sie die geschlossene Irisschere in das Stirnbein zwischen den Augen in der sagittalen Naht und öffnen Sie die Klingen, um den Schädel in zwei Teile zu teilen. Fassen Sie mit einer Pinzette die Riechkolben an und schneiden Sie mit der Irisschere die Nervenverbindungen auf der Bauchoberfläche des Gehirns ab. Tauchen Sie dann das Gehirn in eine 60-Millimeter-Petrischale mit eiskaltem PBS.

Um den Kreis von Willis zu isolieren, übertragen Sie die Schale auf einen Eisbeutel unter einem Präpariermikroskop und drehen Sie das Gehirn auf seine dorsale Oberfläche, um den Kreis von Willis zu visualisieren. Fassen Sie mit der kleinen Pinzette die vorderen Hirnarterien an der Basis der Riechlappen und üben Sie Druck aus, um die Arterien vom Gefäßkontinuum zu trennen. Schneide die mittleren Hirnarterien auf die gleiche Weise durch.

Verwenden Sie dann die scharfen Enden der Pinzette, um die mittleren Hirnarterien zu fassen und den Anfang der hinteren Verbindungsarterien anzuheben, wodurch beide Arteriengruppen vom Gehirn getrennt werden. Heben Sie dann die vorderen Arterien an und ziehen Sie sie vorsichtig über das Chiasma opticum in anterior dorsaler Richtung. Die Arteria cerebellaris superior und posterior werden auf die gleiche Weise entfernt, gefolgt von der Verlagerung der Arteria basilaris.

Zum Schluss überführen Sie mit der Pinzette den gesamten Willis-Kreis vorsichtig in eine 60-Millimeter-Petrischale, die eiskaltes PBS enthält, und fixieren Sie die Gefäße mit kleinen Stiften, indem Sie mit zwei Pinzetten vorsichtig das restliche Hirngewebe entfernen. Der Kreis von Willis sollte in einem Stück herauskommen und aufgrund des Fehlens von Blutresten im Gefäßsystem leicht transparent sein. Der saubere Kreis von Willis sollte spezifisch vaskuläre Marker für glatte Muskelzellen exprimieren, wie z. B. Glattmuskel-Aktin, glatte Muskel-Myosin-Schwerkette und Smoothelin.

Neuronale Marker wie das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein oder das Mikrotubuli-assoziierte Protein 2 sollten dagegen im Kreis von Willis nur knapp nachweisbar sein. Des Weiteren ist die Expression des endothelialen Markers, E-Selectin, in einem Nicht-Kreis von Willis-Nervengewebe sehr ähnlich zu derjenigen, die für einen Kreis von Willis-Proben erhalten wurde, was möglicherweise die Existenz eines Gehirn-Kapillar-Netzwerks widerspiegelt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Hirngefäße von Mäusen sehr fein sind und leicht brechen. Daher sollte das Präparieren sehr sorgfältig und ohne Eile durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die gesamte Struktur in einem Stück geerntet wird. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der entzündlichen Nervenerkrankungen den Weg, um zerebrale Gefäßstörungen im Mausmodell für Alzheimer und verwandte Krankheiten wie die zerebrale Amyloid-Angiopathie zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Kreis von Willis von einer Maus isolieren können.