Name: Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Thymusschnitten zur Modellierung der positiven und negativen Selektion von T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse der Thymozytenmigration und Signalwege in situ.

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Wir danken Marilaine Fournier für ihre Kommentare zum Manuskript und Josée Tessier für die technische Unterstützung. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 wurden über das NIAID Exchange Program, NIH, bezogen. Diese Forschung wird durch einen Zuschuss der SickKids Foundation und des CIHR-IHDCYN (NI15-002), einen Betriebskostenzuschuss des CIHR-III (MOP-142254) und Startkapital des FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) und der Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation an HJM unterstützt. HJM ist Junior 1 Scholar des FRQS, CIHR New Investigator (MSH-141967) und Preisträger des Cole Foundation Early Career Transition Award.

Hôpital Maisonneuve-Rosemont - Protokolle für alle Tierstudien wurden von der Animal Care Committee am Centre de recherche genehmigt. 1. Die Ernte Maus Thymus für Herstellung von Thymus-Scheiben und Einzelzellsuspensionen <ol><li> Euthanize die Maus mit CO 2 durch Genickbruch folgte. </li><li> In einer Laminar-Flow-Haube, Pin mit der Maus Bauchseite zu einer Dissektion Brett. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Entfernen überschüssigen Alkohols durch Abtupfen mit Gaze ethanol vom Eintritt in den Brusthöhle zu verhindern und um das Gewebe zu beschädigen. </li><li> Heben Sie die Haut an der Unterseite des Brustbeins mit einer Pinzette und einen Schnitt durch die Haut. Erweitern Sie den Schnitt der Haut nach oben in jedem forelimb. </li><li> Machen Sie einen zusätzlichen Schnitt an der Basis des Brustbeins die Membran aus dem Brustkorb zu trennen. Dann schneiden Sie jede Seite des Brustkorbs in Richtung des Schlüsselbeins. Klappen Sie den Brustkorb über in Richtung des Kopfes der Brusthöhle ausgesetzt wird. Die beiden LappenThymus liegen auf der Oberseite des Herzens. </li><li> Entfernen Sie das Bindegewebe um den Thymus Lappen mit einer Pinzette, Mikro-Dissektion Schere und / oder scharf gebogenen Schere. Verwenden Sie ein Paar feine Spitze gebogenen Pinzette die einzelnen Lappen zu heben von unten oder über Bindegewebe bleiben. Hinweis: Verwenden Sie nicht den Thymus direkt erfassen. </li><li> Legen Sie die Thymus Lappen in einem 15 ml konischen Röhrchen mit PBS und beiseite stellen auf Eis, bis sie benötigt. </li></ol> 2. Agarose Embedding und Vibratom Aufschneiden von Thymic Lobes <ol><li> Bereiten Sie 4% igen Lösung für die Einbettung durch Lösen von 2 g mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in 50 ml sterilem PBS und microwaving auf eine niedrige Einstellung, bis die Agarose vollständig gelöst hat. Decken Kolben mit Alufolie und in einem Wasserbad bei 55 ° C bis zur Verwendung. </li><li> In einem Gewebekulturabzug, herzustellen vollständigem RPMI-1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum (FBS), 4 mM L Glutamin, 1x Penicillin / Streptomycin enthält, und 10 &amp; mgr; M2-Mercaptoethanol. </li><li> 1,5 ml vollständiges RPMI-1640-Medium pro Vertiefung zu einer 6-Well-Zellkulturplatte und legen einen Zellkultureinsatz in jeder Vertiefung. Stellen Sie den Teller zur Seite in einem Inkubator bei 37 ° C, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Sie einen matschigen Eiswasser-Bad mit Wasser und Eis in einem Eiskübel. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig alle restlichen Bindegewebe um jede feine Spitze Pinzette Thymus Lappen. Tun Sie dies, während der Thymus Lappen in PBS in einer Gewebekulturschale eingetaucht ist, nach der Übertragung auf ein Gewebe mit PBS getränkten Wischtuch, oder unter einem Binokular. </li><li> Lassen Sie die Agarose unter 40 ° C abkühlen, wenn der Kolben nur warm anfühlt ist, zu vermeiden, dass die Gewebe Überhitzung. Gießen des abgekühlten 4% Agarose in eine Gewebeform bis zu einer Höhe von ca. 1 cm. </li><li> Verwenden Sie ein Paar Pinzette vorsichtig den Thymus Lappen auf ein Gewebe übertragen wischen und rollen Sie sie vorsichtig, um zu trocknen, ohne das Gewebe zu schädigen. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe trocknet vollständig oder es wird aus dem Agarose gleiten während des Schneidens. </li><li> Schieben Sie die Lappen in die Agarose und positionieren sie entweder horizontal (zur Erhöhung der Oberfläche jeder Scheibe) oder vertikal (zur Erhöhung der Anzahl der Scheiben) am unteren Ende der Form. Legen Sie die Form in Eiswasser für 5-10 min die Agarose zu ermöglichen, sich zu verfestigen. </li><li> Während dieser Zeit bereiten die Vibratom zum Schneiden von Pufferwanne Montage, die Montage des Objektplatte und Einsetzen des Vibratom Klinge. Legen Sie ein Stück Labor Band auf der Probenscheibe. Sterilisieren Sie die sauber, montiert Arbeitsplatz mit 70% Ethanol. </li><li> Nachdem die Agarose erstarrt, invertieren die Form und drücken Sie sanft in seiner Mitte die Agarose eingebettet Lappen freizugeben. </li><li> Mit einem scharfen Messer die überschüssige Agarose rund um die Lappen zu verlassen ~ 2 mm Agarose zu trimmen auf jeder Seite und ~ 0,5 cm an der Unterseite. </li><li> Sichern Sie sich Agaroseblock mit einem Tropfen Gewebekleber auf das Stück Klebeband auf der Probenscheibe. Mehrere Blöcke können auf das Band geklebt werden. </li><li> Richten Sie die Vibratom Klinge with die Spitze des Agaroseblock. Füllen Sie den Pufferwanne mit sterilem PBS, bis die Klinge und Agarose-Block (s) vollständig eingetaucht sind. </li><li> Abschnitt die Agarose eingebetteten Gewebeschnitten mit einer Dicke von 400 bis 500 &amp; mgr; m zu erhalten. Stellen Sie die Vibratom bis 0.225 mm / s Geschwindigkeit, Frequenz von 100 Hz und 5 ° Winkel. </li><li> Verwenden Sie einen gebogenen Spatel die Thymus-Scheiben in eine Gewebekulturplatte mit steriler PBS zu sammeln, wie sie geschnitten werden. Entsorgen Sie die erste und die letzte Scheibe. </li><li> Untersuchen Sie die Scheiben unter einem Lichtmikroskop mit 4-facher Vergrößerung. Wählen Sie die Scheiben mit intakten Thymusgewebes und umgebende Agarose (1A). </li><li> Übertragen Sie die Scheiben auf der Platte vorbereitet in Schritt 2.3 durch eine Pipettenspitze vorsichtig die Thymus-Scheibe aus dem gebogenen Spatel auf die Zellkultureinsatz zu gleiten. Jeder Einsatz kann ~ 3 Scheiben aufnehmen. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben berühren einander nicht oder die Zellkultureinsatz Wände. </li><li> Pflegen Sie die Platte bei 37 ° C, bis sie benötigt. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Herstellung von Thymozyten zum Umlegen <ol><li> Isolieren thymic Keulen wie in 1 beschrieben die Lappen Dissociate manuell eine Einzelzellsuspension unter Verwendung einer sterilisierten 15 ml Gewebemühle mit 5 ml steriler PBS, enthaltend 2% FBS gefüllt zu machen. Übertragen, um die Zellen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1x ACK - Lysepuffer (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA) bei Raumtemperatur für 3 min roten Blutkörperchen zu lysieren. </li><li> Das Rohr wird bis 15 ml mit PBS 2% FBS enthält. Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml PBS, enthaltend 2% FBS und Pass-Zellen durch ein 255 &amp; mgr; m-Mesh-Filter. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Zentrifugieren der Zellen bei 545 xg für 5 min bei 4 ° C und Resuspendieren des Zellpellets in PBS, enthaltend 2% FBS bei einer Konzentration von 1 x 10 7 Zellen pro ml. </li><li> Beschriften Sie die Zellen mit Zellfarbstoffe wie Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) nach Herstellerprotokolle, wenn nicht Thymozyten von Mäusen, die congenic Markern oder genetisch fluoreszierenden Reporter codiert zu unterscheiden von Scheibe körpereigenen Zellen. </li><li> Nach dem letzten Waschen der markierten Zellen, Zellpellet in komplettem RPMI-1640 - Medium bei 1-3 x 10 6 Zellen pro 15 ul. </li></ol> 4. Übereinander Thymozyten auf den Thymus Scheiben <ol><li> rund um die Thymus-Scheiben auf dem Einsatz Verwenden Sie eine Pipette jede Flüssigkeit abzusaugen. Hinweis: Achten Sie darauf, zu vermeiden, die Agarose zu beschädigen. Wenn die Agarose beschädigt wird, werden die überlagerten Thymozyten nicht durch den Verlust von Oberflächenspannung der Schichtoberfläche anschließen. </li><li> Ohne die Scheibe mit der Pipettenspitze berühren, Overlay 15 ul Thymozyten in Abschnitt 3 hergestellt, auf jede Thymus in Scheiben schneiden. </li><li> Inkubieren Sie die plate bei 37 ° C für 2 h, damit die Zellen in die Thymus-Scheiben zu migrieren. </li><li> Nach 2 Stunden, spülen Sie die Thymus-Scheiben 3-mal mit 1 ml PBS Überschuss überlagertem Thymozyten zu entfernen, die noch nicht in das Gewebe gewandert sind. </li><li> Die Platte bei 37 ° C, bis die Thymus-Scheiben bereit sind, geerntet werden, in der Regel 1-72 Stunden je nach Experiment. </li></ol> 5. Die Dissoziation von Thymic Scheiben für die Durchflusszytometrie <ol><li> Bereiten Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen für jede Scheibe durch Zugabe von 150 ul PBS, das 2% FBS. </li><li> 1 ml PBS, enthaltend 2% FBS auf das Gewebekultureinsatz mit den Thymus Scheiben und sanft rühren mit einem gebogenen Spatel die Scheiben von der Oberfläche der Zellkultureinsatz zu lösen. </li><li> Übertragen Sie die Scheibe aus dem Einsatz auf dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem gebogenen Spachtel. </li><li> Manuell stören die Scheibe ein Mikrozentrifugenröhrchen Probe zerstoßen. Zugabe von 150 &amp; mgr; l PBS, enthaltend 2% FBS auf ein Endvolumen von 300ul. </li><li> Filtern Sie das dissoziierte Gewebe durch ein 40 um-Filter in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Die gefilterten Zellen sind bereit für die Durchflusszytometrie - Analyse gefärbt werden 40. </li><li> Filterzellen ein zweites Mal, bevor sie auf einer Flussdurchlass Zytometer um sicherzustellen, daß all die Agarose entfernt und verstopft nicht Durchflusszytometers. </li><li> Erwerben Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer und Analyse von Daten , wie zuvor 40 beschrieben wurde. </li></ol>

<ol><li>Carpenter, A. C., Bosselut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+checkpoints+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decision checkpoints in the thymus.</a> Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).</li>
<li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+thymic+positive+selection+and+the+mature+T+cell+repertoire+for+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen.</a> Immunity. 41, 181-190 (2014).</li>
<li>Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selection of self-reactive T cells in the thymus.</a> Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).</li>
<li>Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymocyte-stromal+cell+interactions+visualized+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy.</a> Science. 296, 1876-1880 (2002).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).</li>
<li>Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+migration+during+human+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Tracking migration during human T cell development.</a> Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).</li>
<li>Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocyte+motility%3A+mutants%2C+movies+and+migration+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns.</a> Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire%3A+what+thymocytes+see+%28and+don%27t+see%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see).</a> Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).</li>
<li>Ross, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phases+in+the+positive+selection+of+CD8%2B+T+cells+distinguished+by+intrathymic+migration+and+T-cell+receptor+signaling+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).</li>
<li>Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR4+promotes+medullary+entry+and+thymocyte-dendritic+cell+interactions+required+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance.</a> J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298, 1395-1401 (2002).</li>
<li>Takaba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+Orchestrates+a+Thymic+Program+of+Self-Antigen+Expression+for+Immune+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance.</a> Cell. 163, 975-987 (2015).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+deletion+of+thymocytes+can+occur+in+the+cortex+with+no+involvement+of+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla.</a> J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).</li>
<li>Stritesky, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+thymic+selection+quantified+using+a+unique+method+to+capture+deleted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+thymus+organ+cultures+and+T-cell+receptor+repertoire+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development.</a> Immunology. 100, 405-410 (2000).</li>
<li>Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of T cell development.</a> Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).</li>
<li>de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+potential+and+development+in+vitro%3A+the+OP9-DL1+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach.</a> Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).</li>
<li>Lian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymically+injected+hemopoietic+stem+cells+can+differentiate+into+all+lineage+cells+in+the+thymus%3A+differences+between+c-kit%2B+cells+and+c-kit+%3C+low+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells.</a> Stem Cells. 15, 430-436 (1997).</li>
<li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrathymic Injection.</a> Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).</li>
<li>Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+thymocytopoiesis+in+rats+and+mice.+I.+Kinetics+of+appearance+of+thymocytes+using+a+direct+intrathymic+adoptive+transfer+assay+for+thymocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors.</a> J Exp Med. 163, 1-17 (1986).</li>
<li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li>
<li>de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+T+lymphocytes+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).</li>
<li>Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+and+functional+evaluation+of+in+vitro+generated+to+ex+vivo+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells.</a> J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).</li>
<li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaggregate+thymus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Reaggregate thymus cultures.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li>
<li>Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells+provide+unique+signals+for+positive+selection+of+CD4%2BCD8%2B+thymocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro.</a> J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+thymus+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fetal thymus organ culture.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+dendritic+cells+and+B+cells+in+the+clonal+deletion+of+Mls-reactive+T+cells+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus.</a> J Exp Med. 173, 539-547 (1991).</li>
<li>Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cytolytic+T+lymphocyte+precursors+in+organ-cultured+mouse+embryonic+thymus+rudiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments.</a> J Exp Med. 155, 617-622 (1982).</li>
<li>Fairchild, P. J., Austyn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+predispose+the+fetal+thymus+to+positive+selection+of+CD4%2BCD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells.</a> Immunology. 85, 292-298 (1995).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).</li>
<li>Le Borgne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-998 (2009).</li>
<li>Ueda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mst1+regulates+integrin-dependent+thymocyte+trafficking+and+antigen+recognition+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus.</a> Nat Commun. 3, 1098(2012).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+self-reactive+T+cells+in+the+thymus%3A+a+timeline+for+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection.</a> PLoS Biol. 11, e1001566(2013).</li>
<li>Halkias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+chemokine+gradients+control+human+thymocyte+migration+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ.</a> J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).</li>
<li>Au-Yeung, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+temporal+requirements+revealed+for+Zap70+catalytic+activity+during+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development.</a> Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).</li>
<li>Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+temporal+patterns+of+T+cell+receptor+signaling+during+positive+versus+negative+selection+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ.</a> Sci Signal. 6, (2013).</li>
<li>Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+thymic+positive+and+negative+selection+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry.</a> J Vis Exp. (68), e4269(2012).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1-deficient+mice+have+no+mature+B+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes.</a> Cell. 68, 869-877 (1992).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+regulatory+T+cell+niche+size+is+dictated+by+limiting+IL-2+from+antigen-bearing+dendritic+cells+and+feedback+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition.</a> Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).</li>
<li>Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+interactions+and+sustained+TCR+signaling+characterize+thymocyte-thymocyte+interactions+that+support+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection.</a> J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+and+mice+expressing+different+GFP+variants+for+multiple+non-invasive+reporter+usage+within+a+single+animal%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal.</a> BMC Biotechnol. 2, (2002).</li>
<li>Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+antigen-dependent+CD8%2B+T-cell%2F+dendritic+cell+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo.</a> Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Thymus Scheiben und repräsentative Ergebnisse effizienter positive und negative Selektion von überlagerten Vorselektion MHC-Klasse-I-restringierten TCR transgene Thymozyten durch Durchflusszytometrie. Dieses System wurde mit ähnlichem Erfolg verwendet , um eine positive Selektion von MHC - Klasse - II-restringierte CD4 + T - Zellen von Vorselektion DP Thymozyten 32 und, in Gegenwart von Agonist - Antigen, negative Selektion und thymic T <su...

T - Zellen differenzieren durch eine Reihe von Entwicklungs Intermediate in den Thymus während welcher Zeit sie mehrere Prüfpunkte auftreten, die die Erzeugung eines funktionellen, selbst tolerant T - Zell - Repertoire 1-3 gewährleisten. Positive Selektion fördert das Überleben von Thymozyten mit T - Zell - Rezeptoren (TCR) in der Lage zu erkennen, mit geringer bis moderater Affinität, Peptid durch Haupthistokompatibilitätskomplex - Moleküle (MHC) auf die kortikale Thymusepithelzellen (cTEC) 2,3 dargestellt. Negative Selektion und regulatorischen T (T reg) Zellentwicklung trägt zur Schaffung der Selbsttoleranz über die Eliminierung oder Abzweigung von Thymozyten , die stark auf Selbst Peptid reagieren presented by MHC 2,4. Unreife CD4 + CD8 + doppelt positiven (DP) Thymozyten TCRs exprimieren, die den Auswahlprozess unterscheiden sich zu reifen T - Zell - Subpopulationen, die meisten davon sind MHC - Klasse - I-restringierte CD8 + zytotoxische passierenoder MHC - Klasse - II-restringierten CD4 + Helfer einzigen positiven (SP) T - Zellen, bevor die Thymusdrüse austretenden Effektor - Funktionen in den sekundären lymphatischen Organen 1-3 auszuführen. Zusätzlich zu der Komplexität der T - Zell - Entwicklung ist die dynamische Migration und zelluläre Begegnungen von Thymozyten ganzen Stromazellen Netzwerk 5-9 entwickeln. Diese Stromazellen spielen verschiedene Rollen in Thymozyten Entwicklung und zwischen den Thymus kortikalen und medullären Regionen unterschiedlich verteilt , in denen positive und negative Selektion 10 auftreten. Obwohl positive Selektion in erster Linie in der Rinde nimmt, gibt es vermehrt Hinweise, dass DP Thymozyten zur Medulla migrieren und weiterhin TCR-Signale zu verlangen, bevor sie sich zu reifen T-Zellen differenzieren was darauf hindeutet, dass die Medulla notwendig, zusätzliche Signale für die Fertigstellung der positiven Selektion und Abstammung liefern kann Differenzierung 11,12. Des Weiteren,Erleichtern Deletion autoreaktiver Thymozyten 13,14 trotz der Anwesenheit von spezialisierten Mark Thymus - Epithelzellen (mTEC) , die und Gegenwart gewebe beschränkt Antigene exprimieren, ein großer Teil der negativen Selektion auftritt in der Hirnrinde in Reaktion auf ubiquitär exprimierten Selbst Peptid präsentiert von dendritischen Zellen 15,16. So müssen genaue Modelle der T-Zell-Entwicklung stellen eine äußerst Thymus Mikro organisiert, mit intakter Rinde und Mark Regionen, die die Interaktion zwischen Thymozyten und Stromazellen erleichtert und unterstützt thymocyte Migration, da diese Zellen positive und negative Selektion unterzogen werden. Zur Ergänzung der ex vivo - Analysen von Thymozyten als Mittel zum Studium positive und negative Selektion, eine Reihe von in vitro, in situ und in vivo Modelle der T - Zellentwicklung wurden 17-22 entwickelt. Es war notorisch schwierig zu rekapitulierenpositive Selektion in vitro, aber Co - Kultur von Stammzellpopulationen oder T - Zell - Vorläufer mit Stromazellen Notch - Liganden exprimieren, insbesondere OP9-DL1 / 4 - Zellen, hat die Fähigkeit , T - Linie Engagement und begrenzte positive Selektion macht es einen unschätzbaren in - vitro - Modell zu unterstützen, Studie T - Zell - Entwicklung 23-25. Einschränkungen dieses Systems gehören jedoch die Tatsache, dass diese Zellen die einzigartige Peptid Maschinen für die Verarbeitung fehlt in Thymus-Stroma-Zellen und die dreidimensionale Thymus-Mikroumgebung gefunden. Obwohl technisch umständlich, in situ und in - vivo - Modellen von Thymus - Auswahl einige der Barrieren in Bezug auf in - vitro - Systemen zu überwinden. Reaggregieren Thymus - Organkulturen (RTOC) enthalten Mischungen von Thymozyten und Thymus - Stroma - Zellen 18,26,27 definiert. Diese Thymus-Epithelzellen-reaggregates halten MHC-Klasse-I und II-Expression und developme unterstützennt beider herkömmlichen Zelluntergruppen T, aber immer noch kortikalen und medullären Strukturen nicht ausreichend definiert. Fötalem Thymus - Organkultur (FTOC) ist ein beliebtes Modell der T - Zell - Entwicklung , die mit Thymozyten über hanging-drop Kultur lymphodepleted Thymus Lappen oder durch Injektion von Thymozyten in lymphoreplete thymic Keulen und unterstützen effiziente Entwicklung von CD4 + und CD8 + T ausgesät werden können Zellen im Laufe der Zeit in Kultur 18,28-31. Bei Beginn der Kultur von fötalen Thymus Lappen gibt es einen Mangel von mTEZ, aber definierten kortikalen und medullären Strukturen können im Laufe der Zeit in Abhängigkeit von Bedingungen zu entwickeln. Eine wichtige Überlegung ist, dass dieses Modell bevorzugt im Vergleich zu Erwachsenen-T-Zell-Entwicklung fötalen unterstützen. Schließlich ist intrathymischen Injektion von definierten Thymus-Vorstufen in erwachsenen Mäusen technisch anspruchsvoll, aber stellt klar, eine Umgebung zu unterstützen T - Zell - Entwicklung in vivo. Diese in situ und in - vivo - Modelle sind hervorragende Werkzeuge to Studie T-Zell-Entwicklung und ihre Verwendung sollte an einem Experiment-by-Experiment Basis betrachtet werden. Thymus - Scheiben haben sich jedoch heraus kürzlich als vielseitiges, komplementärer Modell thymic Auswahl in situ mit der Möglichkeit zu untersuchen einzigartig, komplex aufzunehmen, und in der Regel einen höheren Durchsatz Experimenten. Thymus - Scheiben , die Integrität der kortikalen und medullären Regionen zu erhalten und einen Rahmen von Stromazellen bereitzustellen , die Thymozyten Migration während der Entwicklung sowie effiziente positive und negative Selektion 11,32-39 unterstützt. Thymocyte Subsets oben auf Thymus - Scheiben wandern in das Gewebe und in die entsprechenden Mikroumgebungs Nische 34,37 hinzugefügt. Das überlagerte Thymozyten aus Thymus-slice endogene Zellen über kongenen Marker oder Fluoreszenzmarkierungen unterschieden werden und kann in Kultur für mehrere Tage aufrechterhalten werden. Thymic Scheibe organotypischen Kulturen können verwendet werden, um verschiedene Aspekte zu studierenvon T-Zell-Entwicklung, einschließlich Thymus-Selektion, Thymozyten Verhalten (Migration und zellulären Wechselwirkungen) und Thymocyten-Lokalisierung, unter anderem. In Anbetracht der Fähigkeit ~ 20 Thymus - Scheiben zu erzeugen pro Maus, ist die Skalierbarkeit von Experimenten im Allgemeinen größer als andere in situ Modelle von Thymus - Auswahl. Obwohl die Herstellung von Thymus slices spezialisierte Ausrüstung erfordert, wie dem Vibratom und die Lebensdauer der Thymus-Scheiben in Kultur begrenzt ist, zu einem Verlust von Zellen im Laufe der Zeit über den Zelltod aufgrund und das Fehlen einer einkapselnden Membran bereitzustellen thymic Scheiben ein ausgezeichnetes Modell zur Analyse von Thymus Auswahl von synchronisierten Populationen von Thymozyten innerhalb eines reifen Thymus-Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Herstellung von Thymus-Scheiben (einschließlich Ernten des Thymus, Agarose Einbettung von Thymus Lappen und Vibratom Schnitte des eingebetteten Gewebe), Isolation und Überlagerung von Thymozyten und Dissoziation von Thymus-Scheiben für die Durchflusszytometrie-Analyse.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50080</td> Agarose-Einbettungsform <td>mit niedriger Schmelztemperatur</td></tr><tr><td>(abgeschnitten - T12)</td><td>Polyzienzen</td><td>18986</td><td>22 mm x 22 mm quadratisch, abgeschnitten auf 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>Doppelschneidige Vorbereitungsklingen</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekleber</td><td>3M&nbsp;</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>0,4 & Mikro; m Zellkultur-Einsätze&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>Von mehreren getesteten Marken, diese hielten die Zellen auf den Scheiben am besten</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 mit L-Glutamin</td><td>Wisent</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Wisent</td><td>080-110</td><td>Hitzeinaktiviertes</td></tr><tr><td>L-Glutamin, 200 mM</td><td>Wisent</td><td>609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tenbroeck Tissue Grinders</td><td>Wheaton</td><td>357426</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh Filter</td><td>Komponentenversorgung</td><td>U-CMN-255</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen Probenstößel</td><td>Bel-Art</td><td>F19922-0000</td><td></td></tr><tr><td>40 & Mikro; m Nylon Zellsieb</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Inox Spitze</td><td>Dumont&nbsp;</td><td>RS-5047</td><td>Gebogene Pinzette mit feiner Spitze, Größe .17 x .10 mm</td></tr><tr><td>Mikropinzette</td><td>Dumont&nbsp;</td><td>RS-5090&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung und bedeutung von organotypischen thymic scheibe kulturen

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Thymic Auswahl erfolgt in einem einzigartigen und Thymus - Mikro hoch organisierte was zur Erzeugung eines funktionellen, selbst tolerante T - Zell - Repertoires. In - vitro - Modellen T - Linie Engagement und Entwicklung zu studieren , haben wertvolle Einblicke in diesen Prozess. Jedoch fehlt es diesen Systemen die vollständige dreidimensionale thymic milieu notwendig T - Zell - Entwicklung und sind daher unvollständig Approximationen in vivo Thymus - Selektion. Einige der Herausforderungen im Zusammenhang mit Modellierung T - Zell - Entwicklung kann durch die Verwendung in situ Modelle überwunden werden , die eine intakte Thymus - Mikroumgebung schaffen , die vollständig Thymus Auswahl der Entwicklung eines T - Zellen unterstützt. Thymic Scheibe organotypischen Kulturen ergänzen in - situ - Techniken existieren. Thymus-Scheiben, die Integrität der Thymus kortikalen und medullären Regionen erhalten und eine Plattform Entwicklung von überlagerten Thymozyten einer definierten Entwicklungsstadium oder endogener T c zu studierenells innerhalb eines reifen Thymus-Mikroumgebung. Aufgrund der Fähigkeit, ~ 20 Scheiben zu erzeugen pro Maus, präsentieren Thymus-Scheiben einen einzigartigen Vorteil in Bezug auf Skalierbarkeit für Hochdurchsatz-Experimenten. die Vielseitigkeit dieses Verfahren weiter verbessert die relative Leichtigkeit thymic Scheiben und Potential bei der Erzeugung von verschiedenen Thymus Subsets oder andere Zellpopulationen aus verschiedenen genetischen Hintergründen zu überlagern. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Thymus Scheiben, Isolierung und Überlagerung von Thymozyten und Dissoziation von Thymus-Scheiben für die durchflusszytometrische Analyse. Dieses System kann auch als auch visualisieren Thymozyten Migration, Thymozyten-stromal Zell-Wechselwirkungen und TCR-Signale mit Thymus Auswahl durch Zwei-Photonen-Mikroskopie assoziiert zu studieren nicht-konventionellen T-Zell-Entwicklung angepasst werden.

Thymus slices Unterstützung Analyse verschiedener Aspekte der T-Zell-Entwicklung, wie beispielsweise positive und negative Selektion. Für eine erfolgreiche Versuche, die Qualität des Thymus-Scheibe von größter Bedeutung. Somit sollte thymic Scheiben untersucht werden , um die Integrität des Thymusgewebe zu gewährleisten , und dass die Agarose die Thymus - slice (1a Abbildung) intakt umgibt. Oberflächenspannung kann beeinträchtigt werden, wenn die Agaro...

Wir beschreiben die Herstellung von Thymus-Scheiben, die in Kombination mit Durchflusszytometrie verwendet werden können positive und negative Selektion der Entwicklung T-Zellen zu modellieren. Thymus Scheiben können auch für die in situ - Analyse von Thymozyten Migration, Lokalisierung angepasst werden und Signalisierung über Immunofluoreszenz und Zwei-Photonen - Mikroskopie.

Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, thymische Schnitte herzustellen, die in Kombination mit der Durchflusszytometrie verwendet werden können, um die positive und negative Selektion sich entwickelnder T-Zellen zu modellieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur T-Zell-Entwicklung zu beantworten, beispielsweise welche Signale die positive und negative Selektion sich entwickelnder T-Zellen in situ regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass thymische Schnitte die Integrität der Thymuskapsel und -medulla bewahren und eine Plattform bieten, um die Entwicklung definierter Thymozyten-Teilpopulationen innerhalb eines intakten thymischen Mikromilieus zu untersuchen.Beginnen Sie damit, eine euthanasierte Maus mit der Bauchseite nach oben auf ein Präparationsbrett zu heften. Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol ein und tupfen Sie überschüssigen Ethanol mit Mullbinde ab, um zu verhindern, dass dieser in die Brusthöhle gelangt und das Gewebe beschädigt. Heben Sie anschließend die Haut an der Basis des Brustbeins mit einer Pinzette an und schneiden Sie durch die Haut.Verlängern Sie den Hautschnitt nach oben bis zu jedem Vordergliedmaß. Führen Sie einen zusätzlichen Schnitt an der Basis des Brustbeins durch, um das Zwerchfell vom Rippenkorb zu trennen. Schneiden Sie dann entlang jeder Seite des Rippenkorbs in Richtung Schlüsselbein und klappen Sie den Rippenkorb nach vorne in Richtung Kopf, um die Brusthöhle freizulegen.Die beiden Lappen des Thymus liegen über dem Herzen. Entfernen Sie mit einer Pinzette und einer mikrochirurgischen Schere das Bindegewebe um die Thymuslappen herum. Heben Sie anschließend die einzelnen Lappen mit einer feinen, gebogenen Pinzette von unten oder über verbliebenes Bindegewebe an.Legen Sie die Thymuslappen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß mit PBS und stellen Sie es bis zur weiteren Verwendung auf Eis. Bereiten Sie zunächst eine vierprozentige Agarose zum Einbetten vor, indem Sie zwei Gramm Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 50 Milliliter steriler PBS lösen und bei niedriger Stufe in der Mikrowelle erhitzen, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Bedecken Sie das Gefäß mit Aluminiumfolie und stellen Sie es bis zur Verwendung in ein Wasserbad bei 55 Grad Celsius.Fügen Sie in einer Zellkulturhaube 1,5 Milliliter komplettes RPMI-1640-Medium den Vertiefungen einer sechs-Vertiefungs-Zellkulturplatte hinzu. Anschließend stellen Sie einen Zellkulturinsert in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platte bis zum Gebrauch in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius.Bereiten Sie ein eisiges Wasserbad aus Wasser und Eis in einem Eimer vor. Überführen Sie die Thymuslappen auf ein mit PBS getränktes Papiertuch und entfernen Sie vorsichtig mit feinen Pinzetten das restliche Bindegewebe, das jeden Thymuslappen umgibt. Überführen Sie die Lappen in eine Zellkulturschale, die PBS enthält.Nachdem man dem Agarose erlaubt hat, abzukühlen, bis der Kolben sich nur noch leicht warm anfühlt, gießt man die abgekühlte vierprozentige Agarose in eine Gewebeform bis zu einer Höhe von etwa einem Zentimeter. Anschließend fasst man mit einer Pinzette vorsichtig den Thymuslappen am verbleibenden Bindegewebe und rollt ihn sanft auf einem Gewebetuch ab, um ihn zu trocknen, ohne das Gewebe zu beschädigen. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig trocknet, andernfalls rutscht es während des Schneidens aus der Agarose heraus.Setzen Sie das Läppchen vorsichtig in die Agarose ein und positionieren Sie es entweder horizontal am Boden der Form, um die Oberfläche jeder Scheibe zu vergrößern, oder vertikal, um die Anzahl der Scheiben zu erhöhen. Stellen Sie die Form für fünf bis zehn Minuten in Eiswasser, damit die Agarose aushärten kann. Bereiten Sie in dieser Zeit das Vibratom zum Schneiden vor, indem Sie die Pufferwanne montieren, die Vibratomklinge einsetzen und die Probenscheibe zusammenbauen.Bringen Sie ein Stück Laborband auf der Probenscheibe an. Zuletzt desinfizieren Sie den sauberen, zusammengestellten Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol. Nachdem sich das Agarose verfestigt hat, stülpen Sie die Form um und drücken Sie vorsichtig in deren Mitte, um den in der Agarose eingebetteten Lappen freizugeben.Verwenden Sie nun eine scharfe Klinge, um das überschüssige Agarose um den Lappen herum zu beschneiden, wobei etwa zwei Millimeter Agarose an jeder Seite und 0,5 Zentimeter am Boden verbleiben. Geben Sie einen Tropfen Gewebekleber auf das Klebeband auf der Probenscheibe und befestigen Sie den Agaroseblock auf dem Klebeband der Probenscheibe. Mehrere Blöcke können auf dem Klebeband befestigt werden.Als Nächstes richten Sie die Vibratomschneide mit der Oberseite des Agaroseblocks aus, füllen dann die Pufferwanne mit steriler PBS, bis die Schneide und die Agaroseblöcke vollständig eingetaucht sind. Stellen Sie die Schneideparameter am Vibratom ein. Schneiden Sie das in Agarose eingebettete Gewebe in Schnitte mit einer Dicke von 400 bis 500 Mikron.Verwenden Sie einen gebogenen Spatel, um die Thymusschnitte in eine Gewebekulturplatte mit steriler PBS zu sammeln, sobald sie geschnitten sind. Untersuchen Sie die Schnitte unter einem Lichtmikroskop bei vierfacher Vergr&ouml;&szlig;erung. W&auml;hlen Sie die Schnitte mit intaktem Thymusgewebe und umgebendem Agarose aus.Verwenden Sie anschließend eine Pipettenspitze, um vorsichtig eine Thymusschnittstelle von dem gebogenen Spatel auf die Zellkultur-Einlagen in der 6-Loch-Platte zu schieben. Jede Einlage kann bis zu drei Schnittstellen aufnehmen. Bewahren Sie die Platte bis zum Gebrauch bei 37 Grad Celsius auf.Nach der Isolierung der Thymuslappen von konrogenen Mäusen wie zuvor beschrieben, verwenden Sie einen sterilen 15-Milliliter-Gewebemörser, der mit fünf Millilitern steriler PBS mit zwei Prozent FBS gefüllt ist, um die Lappen manuell zu dissoziieren. Überführen Sie die Einzelzell-Suspension in ein 15-Milliliter-Konischglas. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 545 ×g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Nach dem Verwerfen des Überstandes die Zellen in einem Milliliter eines X ACK-Lysepuffers resuspendieren und drei Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Danach das Gefäß mit PBS, der zwei Prozent FBS enthält, auf 15 Milliliter auffüllen. Die Zellen bei vier Grad Celsius mit 545 × g fünf Minuten lang zentrifugieren.Nachdem das Zellpellet in 10 Milliliter PBS mit zwei Prozent FBS resuspendiert wurde, werden die Zellen durch einen 255-Mikrometer-Mesh-Filter gegeben. Die Zellen werden mit einem Hämozytometer gezählt. Nach einer Zentrifugation der Zellen bei 545 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius wird das Zellpellet in komplettem RPMI-1640-Medium bei einer Dichte von ein bis drei mal zehn hoch sechs Zellen pro 15 Mikroliter resuspendiert und anschließend die Thymozyten überlagert.Verwenden Sie eine Pipette, um vorsichtig das PBS um die Thymusschnitte auf dem Insert herum abzusaugen, ohne die Agarose zu beschädigen. Überlagern Sie jeden Thymusschnitt, ohne die Pipettenspitze den Schnitt berühren zu lassen, mit 15 Mikrolitern der vorbereiteten Thymozyten. Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Zellen in die Thymusschnitte migrieren können.Nach zwei Stunden die Thymusschnitte dreimal mit je einem Milliliter PBS spülen, um überschüssige überlagernde Thymozyten zu entfernen, die noch nicht in das Gewebe eingewandert sind. Die Platte bei 37 Grad Celsius inkubieren, bis die Thymusschnitte zur Gewinnung bereit sind, typischerweise zwischen einer und 72 Stunden, abhängig vom Experiment. Vor der Selektion MHC-Klasse-I-reakstriktive T-Zellrezeptor-transgene Thymozyten wurden über die Thymusschnitte gelegt, und die Entwicklung reifer CD4-positiver oder CD8-positiver einzelpositiver T-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie verfolgt.Wenn präselektierte OT-1-T-Zellrezeptor-transgene Thymozyten auf beta-2m-Knockout-Thymusschnitten kultiviert werden, verbleiben diese im doppelt positiven Stadium und bilden keine signifikante Anzahl CD8-positiver einpositiver T-Zellen aus. Im Gegensatz dazu zeigt die Entwicklung von CD8-positiven T-Zellen nach 72 Stunden, wenn sie auf Wildtyp-Thymusschnitten mit endogenen Selektionsliganden kultiviert werden, dass dieses Modell die positive Selektion unterstützt. Um die negative Selektion gegenüber ubiquitärer Antigene zu modellieren, wurden CTV-markierte Thymozyten von Wildtyp-Mäusen und CFSE-markierte Thymozyten von OT-1-T-Zellrezeptor-transgenen RAG-1-Knockout-Mäusen im Verhältnis 1:1 gemischt und entweder in Gegenwart oder Abwesenheit eines Ovalbumin-Peptids auf Wildtyp-Schnitten kultiviert.Nach 24-stündiger Inkubation wurden die relativen Anteile der überlappenden Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dieses Bild zeigt die relativen Verhältnisse von lebenden, CFSE-positiven OT-1-transgenen Zellen zu lebenden, CTV-positiven Wildtyp-Zellpräparaten nach Inkubation mit oder ohne Ovalbumin-Peptid. Eine Abnahme des relativen Anteils von OT-1-transgenen Zellen stellt eine negative Selektion der OT-1-transgenen Zellen in Gegenwart von Ovalbumin-Peptid dar.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man thymische Schnitte herstellt, Thymozyten isoliert und Zellen auf die thymischen Schnitte aufbringt, um ihre Entwicklung in situ zu analysieren. Thymische Schnitte können auch für andere Anwendungen verwendet werden, beispielsweise für Immunfluoreszenz und Zweiphotonen-Mikroskopie, um die Lokalisation, Migration, zellulären Interaktionen und T-Zell-Rezeptor-Signalgebung von Thymozyten während der thymischen Selektion zu untersuchen.

preparation-and-applications-of-organotypic-thymic-slice-cultures

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Zerlegung und Entfernung der fetalen Thymus sowie die Vorbereitung der ex vivo Kulturen von 2-dGuo behandelten Thymus.

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

Wir beschreiben eine Methode zur organotypischen Schnitten des Hippocampus, die leicht auf andere Hirnregionen angepasst werden vorbereiten können. Hirnschnitten sind auf porösen Membranen und Kulturmedien ist erlaubt, um eine Schnittstelle bilden gelegt. Diese Methode schont die grobe Architektur des Hippocampus für bis zu 2 Wochen in Kultur.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

Eine Methode zur organotypischen Slices aus dem E12.5 murinen embryonalen Mittelhirns zu erzeugen, ist beschrieben. Die organotypischen Kulturen verwendet, um das Verhalten von dopaminergen Neuronen oder anderen ventralen Mittelhirn Nervenzellen zu beobachten.

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

Eine Technik zur Untersuchung von NG2-Zellen und Oligodendrozyten unter Verwendung eines Schnittkultursystems des Vorderhirns und des Kleinhirns wird beschrieben.  Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Dynamik der Proliferation und Differenzierung von Zellen innerhalb der Oligodendrozytenlinie, bei der die extrazelluläre Umgebung leicht manipuliert werden kann, während die Zytoarchitektur des Gewebes erhalten bleibt.

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Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese mit dem organotypischen Kulturtechnik. Dieses Verfahren ermöglicht die in vitro Manipulation von Neurogenese und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Wirkstoffen an die kultivierten Hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Die Untersuchung medullärer Thymusepithelzellen in vitro war weitgehend erfolglos, da aktuelle 2D-Kultursysteme das in vivo-Szenario nicht nachahmen. Das hierin beschriebene 3D-Kultursystem - ein modifiziertes organotypisches Hautkulturmodell - hat sich bei der Rekapitulation der mTEC-Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression als überlegen erwiesen.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die gleichzeitige Darstellung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde. Individuelle Thalamocortical Axone und ihre präsynaptischen Terminals werden durch eine einzelne Zelle Elektroporation Technik mit DsRed und GFP-Tags Synaptophysin visualisiert.

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Wir stellen eine Methode zur Energieerzeugung, Anbau und systematische Analyse der organotypischen Scheiben aus murinen Lungentumoren abgeleitet. Wir beschreiben auch für Scheibendicke optimieren und das Medikament Konzentrationen zur Behandlung von Tumor-Scheiben auswählen.

Einrichtung und Analyse der Tumor Slice Explants als Voraussetzung für diagnostische Tests

Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten thymischen Auswanderern (iTE) durch ein dreidimensionales (3D) thymische Kultursystem. iTE sind eine homogene Teilmenge von T-Zellen, die eng mit naiven T-Zellen verwandt sind und die Fähigkeit zur Proliferation, Gedächtnisbildung und Tumorunterdrückung haben.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Hier präsentieren wir eine Methode um organotypischen Slice Kulturen aus Maus Kleinhirn und Myelinscheide Färbung von Immunohistochemistry geeignet für die Untersuchung von Mechanismen der Myelinisierung und Remyelinisierung in das zentrale Nervensystem vorzubereiten.

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von organotypischen Schnittkulturen (OTSCs). Diese Technik ermöglicht die ex vivo-Kultivierung von intaktem mehrzelligem Gewebe. OTSCs können sofort eingesetzt werden, um ihr jeweiliges Ansprechen auf Medikamente in einer multizellulären Umgebung zu testen.

Organotypische Schnittkulturen als präklinische Modelle der Tumormikroumgebung bei primärem Pankreaskarzinom und Metastasierung

Erfahren Sie die Herstellung von Thymusschnitten zur Modellierung der positiven und negativen Selektion von T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse der Thymozytenmigration und Signalwege in situ.

Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

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