Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein zelluläres Co-Kultursystem aus zwei Zelltypen unter Verwendung von Inserts mit einer durchlässigen Membran zu schaffen, das die Diffusion von sezernierten löslichen Faktoren ermöglicht. Dies wird durch eine Reihe von Schritten erreicht, bei denen Inserts, die einen Zelltyp enthalten, fein platziert werden, in eine Multiwell-Gewebekulturplatte, die einen zweiten Zelltyp enthält. Wir beginnen mit der Aussaat von Zelltyp Nummer eins in Inserts und der Aussaat von Zelltyp Nummer zwei in einer Multi-Well-Gewebekulturplatte.

Der zweite Schritt besteht darin, die Einsätze in die Vertiefungen der Platte zu übertragen, die den Zelltyp Nummer zwei enthält. Letztendlich ist dies die Möglichkeit, sowohl die beiden Zelltypen als auch die jeweiligen Überstände zu ernten. Daher ist es möglich, die Wirkung von sezernierten löslichen Faktoren auf den interessierenden Zelltyp zu bewerten.

In mehrzelligen Organismen lösen sezernierte lösliche Faktoren Reaktionen von verschiedenen Zelltypen als Ergebnis des parakrinen Signalwegs aus. Der Wert eines Insert-Co-Kultursystems liegt also in seiner Fähigkeit, eine originelle Möglichkeit zur Beurteilung der Veränderungen zellulärer Parameter zu bieten, die durch sezernierte lösliche Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt vermittelt werden. Insert-Co-Kultursysteme bieten verschiedene Vorteile gegenüber anderen Co-Kulturtechniken, wie z. B.: eine durch Richtungssignalisierung; zwei konservierte Zellpolarität; und drei populationsspezifische Detektionen zellulärer Veränderungen.

Ein spezifisches Protokoll zur Messung der toxischen Wirkungen von Zytokinen, die von Lipopolysaccharid-aktivierten N9-Mikroglia auf neuronale PC12-Zellen sezerniert werden, wird im Folgenden detailliert beschrieben, um ein konkretes Verständnis der Insert-Co-Kultur-Methodik zu ermöglichen. Lösen Sie zunächst die 24-Well-Gewebekulturplatte und die 0,4-Mikron-Por-Polytetrafluorethylen-Einsätze aus der Verpackung. Legen Sie dann die Einsätze in die leeren Vertiefungen der Gewebekulturplatte, indem Sie die oberste Kante des Einsatzes mit einer sterilen Pinzette greifen.

Füllen Sie anschließend die Einsätze mit routinemäßigem N9-Medium, bis die Membran vollständig bedeckt ist. Inkubieren Sie die Inserts mindestens eine Stunde lang oder über Nacht, um die Fähigkeit der Zellen zur Anheftung zu verbessern. Sobald die Einsätze fertig sind, spalten Sie die N9-Mikroglia bei 80 bis 90 % Konfluenz mit routinemäßigem N9-Medium, um eine Zellsuspension zu erhalten, die zum Aussäen der Einsätze verwendet wird.

Entfernen Sie dann das Routinemedium von den Einsätzen und achten Sie darauf, die Membran nicht mit der Mikropipettenspitze zu perforieren. Als nächstes säen Sie jeden Einsatz bei 60.000 Zellen pro Quadratzentimeter mit 50 Mikrolitern der Zellsuspension oder gemäß dem Protokoll des Einsatzherstellers. Achten Sie beim Verteilen der Zellsuspension darauf, dass sie homogen bleibt, indem Sie das Röhrchen gelegentlich umdrehen.

Wenn alle Einsätze ausgesät sind, bewegen Sie die Platte vorsichtig hin und her, dann von links nach rechts, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Vermeiden Sie kreisende Bewegungen, da sich die Zellen sonst in der Mitte des Einsatzes ansammeln. Inkubieren Sie anschließend die Platte mit den Einsätzen 24 Stunden lang, bevor Sie mit der Aktivierung der N9-Mikroglia fortfahren.

Beginnen Sie mit dem Wiegen von 10 Milligramm Lipopolysaccharid und bewahren Sie es für den späteren Gebrauch in einem 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen auf. Da Lipopolysaccharid ein starkes entzündungsförderndes Endotoxin ist und besondere Sicherheitsvorkehrungen erfordert, werden Brille, Handschuhe und eine Atemschutzmaske dringend empfohlen. Erstellen Sie anschließend einen Satz von seriellen Verdünnungen von Lipopolysaccharid unter Verwendung eines warmen N9-Behandlungsmediums, um Arbeitslösungen von vier, zwei und einem Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.

Entfernen Sie abschließend die Hälfte des Kulturmediums von den Einsätzen und achten Sie darauf, die Zellen nicht zu stören. Geben Sie dann vorsichtig 25 Mikroliter der Lipopolysaccharid-Arbeitslösungen zu den Einsätzen, um endgültige Verdünnungen von zwei, einem oder 0,5 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Inkubieren Sie die Platte für weitere 24 Stunden, bevor Sie mit den Co-Kultur-Experimenten fortfahren.

Dieser Schritt erfordert PC12-Zellen, die mit 30.000 Zellen pro Quadratzentimeter differenzierten Interneuronen plattiert sind, und N9-Mikroglia, die 24 Stunden lang mit Lipopolysaccharid aktiviert werden, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Beginnen Sie damit, das gesamte Medium vorsichtig von den Einsätzen zu entfernen und es durch 50 Mikroliter frisches, warmes N9-Behandlungsmedium zu ersetzen. Dies ist notwendig, um alle Spuren von Lipopolysaccharid zu entfernen, so dass nur aktivierte N9-Mikroglia übrig bleiben.

Beachten Sie, dass die Einsätze lose in den Vertiefungen der Gewebekulturplatte liegen und sich bewegen können, wenn die Spitze zu stark auf die Wand gedrückt wird. Dieser Schritt sollte nacheinander ausgeführt werden, um ein Austrocknen der Zellen durch längeren Kontakt mit der Luft zu verhindern. Entfernen Sie anschließend das neuronale PC12-Zellmedium vollständig und ersetzen Sie es durch 0,6 Milliliter frisches, warmes PC12-Behandlungsmedium.

Tun Sie dies nacheinander gut, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen. Fassen Sie mit einer Pinzette die oberste Kante eines Einsatzes und legen Sie ihn vorsichtig in die Vertiefung mit den neuronalen PC12-Zellen. Wenn alle Einsätze übertragen sind, prüfen Sie, ob sich unter den Membranen der Einsätze Luftblasen befinden.

Luftblasen verhindern einen Austausch über die Membran des Einsatzes und können das gesamte Experiment gefährden. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie den Einsatz mit einer Pinzette sehr vorsichtig aus der Vertiefung heben und wieder in das Zellkulturmedium einsetzen, diese Aktion sollte die meisten Blasen entfernen. Bei hartnäckigen Blasen versuchen Sie jedoch, den Einsatz vorsichtig und schräg zurück in das Zellkulturmedium zu tauchen.

Klopfen oder rühren Sie nicht an Einsätze, da dies die Tendenz hat, die Dissoziation der adhärenten Zellen zu verursachen. Überprüfen Sie anschließend das Medienvolumen sowohl in den Einsätzen als auch in den Vertiefungen, die Flüssigkeit in beiden Kammern sollte in etwa auf dem gleichen Niveau sein. Wenn alle Luftblasen entfernt wurden und die Medienvolumina angemessen sind, inkubieren Sie die Platte.

Die Zellen, das Kulturmedium oder beides können dann geerntet werden, um die Auswirkungen der parakrinen Signalübertragung zwischen den N9-Mikroglia und den neuronalen PC12-Zellen zu messen. Enzymgebundene Immunsorbent-Assays wurden auf dem Zellkulturmedium des unteren Kompartiments durchgeführt, um proinflammatorische Zytokine zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen, dass N9-Mikroglia, die mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Lipopolysaccharid behandelt wurden, 24 Stunden nach der Aktivierungsphase signifikant mehr proinflammatorische Zytokine wie Interluken-6, Tumornekrosefaktor-alpha und Interferon gamma sezernierten als nicht behandelte Mikroglia.

Darüber hinaus sezernierten N9-Mikroglia, die mit einem Mikrogramm pro Milliliter Lipopolysaccharid behandelt wurden, nach 24 Stunden deutlich mehr Interferon-Gamma, während es 48 Stunden dauerte, bis ein signifikanter Anstieg der zellmittleren Spiegel von Interluken-6 und Tumornekrosefaktor-alpha zu sehen war. Im Gegensatz dazu konnte die Bedingung von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter die Zytokinexpression in N9-Mikroglia sowohl 24 als auch 48 Stunden nach der Aktivierungsphase nicht erhöhen. Darüber hinaus deuten die Daten nach 24 Stunden in der Gruppe mit zwei Mikrogramm pro Milliliter darauf hin, dass es eine Mikrogliose gab, eine Zunahme der Mikrogliapopulation.

Erst nach 48 Stunden war die Mobilfunkzahl jedoch signifikant erhöht. Um die Folgen der Mikroglia-Aktivierung, die zu einer erhöhten Zytokinsekretion und Mikrogliosen führt, zu bewerten, wurde schließlich die Zytotoxizität in den co-kultivierten neuronalen PC12-Zellen untersucht. Durch die Messung des Spiegels der extrazellulären Laktatdehydrogenase, die von geschädigten Zellen freigesetzt wird, wurde festgestellt, dass neuronale PC12-Zellen einen höheren Zelltod aufweisen, wenn die Konzentration von Lipopolysacchariden auf den N9-Zellen zunimmt.

Diese Ergebnisse zeigen, dass sekretierte lösliche Faktoren in der Lage sind, die Membran der Co-Kultur-Inserts zu durchdringen und zytotoxische Schäden an neuronalen PC12-Zellen verursachen können, wenn kein Zell-Zell-Kontakt besteht. Obwohl hier nur ein Szenario der Insert-Co-Kultur vorgestellt wurde, handelt es sich um eine sehr flexible Technik. In diesem Protokoll wurde ein Zelltyp mit dem Molekül vorbehandelt, das für die Verringerung der Sekretion löslicher Faktoren verantwortlich ist, die beim Transfer des Inserts in die Vertiefung das Verhalten des zweiten Zelltyps beeinflussen.

Es ist jedoch möglich, beide Zelltypen zusammen in einem Co-Kultursystem zu inkubieren, um die erhöhte Schwäche oder Resistenz einer oder beider Zellpopulationen gegenüber einer späteren Behandlung zu erkennen. Bei dieser Technik können einfach zwei Populationen von Zellen verwendet werden, die ohne Behandlung zusammen inkubiert werden, um beispielsweise die basale parakrine reziproke Signalübertragung zu bewerten. Zusätzlich zu ihrer Wertschätzung auf dem Gebiet der Neuroinflammation, wie hier gezeigt, können Insert-Co-Kultursysteme verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen zu beantworten, die sich auf die Tumorregenese, das Neurolathyrisma, die Apoptose-Signalgebung oder jedes andere Thema mit einer Komponente der parakrinen Signalübertragung beziehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie Insert-Co-Kultursysteme eine einfache Möglichkeit bieten können, die durch den sezernierten löslichen Faktor vermittelten Veränderungen zu beurteilen. Und wir hoffen, Sie von dem hohen Potenzial dieser Insert-Co-Kultursysteme bei der Erforschung der multizellulären parakrinen Signalübertragung ohne Zell-Zell-Kontakt überzeugt zu haben.