Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein zelluläres Ko-Kultursystem aus zwei Zelltypen unter Verwendung von Inserten mit einer durchlässigen Membran zu erstellen, wodurch die Diffusion sezernierter löslicher Faktoren ermöglicht wird. Dies wird durch eine Abfolge von Schritten erreicht, bei denen Inserte, die einen Zelltyp enthalten, präzise in eine mehrfachgefasste Gewebekulturplatte mit einem zweiten Zelltyp eingesetzt werden. Zunächst säen wir Zelltyp Nummer eins in die Inserte und Zelltyp Nummer zwei in eine Mehrloch-Gewebekulturplatte aus.

Der zweite Schritt besteht darin, die Inserts in die Vertiefungen der Platte mit der Zelltypennummer zwei zu überführen. Dadurch ist es letztendlich möglich, die beiden Zelltypen sowie die jeweiligen Überstände zu gewinnen. Somit kann der Einfluss sezernierter löslicher Faktoren auf den Zelltyp der Untersuchung bewertet werden.

Bei vielzelligen Organismen lösen sezernierte lösliche Faktoren Reaktionen in verschiedenen Zelltypen als Ergebnis einer parakrinen Signalübertragung aus. Daher liegt der Wert eines Insert-Kokultursystems in seiner Fähigkeit, eine ursprüngliche Methode zur Beurteilung von Veränderungen zellulärer Parameter bereitzustellen, die durch sezernierte lösliche Faktoren vermittelt werden, und zwar ohne direkten Zell-Zell-Kontakt. Insert-Kokultursysteme bieten verschiedene Vorteile gegenüber anderen Kokulturtechniken, wie zum Beispiel: erstens gerichtete Signalübertragung; zweitens erhaltene Zellpolarität; und drittens populations-spezifische Nachweisbarkeit zellulärer Veränderungen.

Ein spezifisches Protokoll zur Messung der toxischen Wirkungen von Zytokinen, die von lipopolysaccharidaktivierten N9-Mikrogliazellen sezerniert werden, auf neuronale PC12-Zellen wird im Folgenden detailliert beschrieben, um ein konkretes Verständnis der Insert-Kokulturmethode zu vermitteln. Zunächst entfernen Sie die 24-Loch-Gewebekulturplatte und die 0,4-Mikron-Pore-Polytetrafluoroethylen-Inserts aus der Verpackung. Anschließend bringen Sie die Inserts mithilfe steriler Pinzette, indem Sie die oberste Kante des Inserts greifen, in die leeren Vertiefungen der Gewebekulturplatte ein.

Füllen Sie die Inserts anschließend mit herkömmlichem N9-Medium, bis die Membran vollständig bedeckt ist. Inkubieren Sie die Inserts mindestens eine Stunde lang oder über Nacht, um die Anheftungsfähigkeit der Zellen zu verbessern. Sobald die Inserts bereit sind, passagieren Sie die N9-Mikroglia bei 80 bis 90 % Konfluenz mit herkömmlichem N9-Medium, um eine Zellsuspension zu erhalten, mit der die Inserts besiedelt werden.

Entfernen Sie dann das Routine-Medium vorsichtig aus den Einsätzen, wobei darauf zu achten ist, die Membran nicht mit der Mikropipettenspitze zu durchstechen. Anschließend säen Sie jeden Einsatz mit 60.000 Zellen pro Quadratzentimeter durch Zugabe von 50 Mikrolitern der Zellsuspension aus, oder gemäß dem Protokoll des Herstellers der Einsätze. Während der Verteilung der Zellsuspension stellen Sie durch gelegentliches Umstülpen des Rohrs sicher, dass diese homogen bleibt.

Wenn alle Inserts beimpft sind, schwenken Sie die Platte vorsichtig vor und zurück sowie anschließend von links nach rechts, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Vermeiden Sie kreisförmige Bewegungen, da diese dazu führen, dass sich die Zellen in der Mitte des Inserts ansammeln. Inkubieren Sie die Platte mit den Inserts anschließend 24 Stunden lang, bevor Sie mit der Aktivierung der N9-Mikroglia fortfahren.

Wiegen Sie zunächst 10 Milligramm Lipopolysaccharid ab und lagern Sie es in einem 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen für die spätere Verwendung. Da Lipopolysaccharid ein starkes proinflammatorisches Endotoxin ist und besondere Sicherheitsvorkehrungen erfordert, werden Schutzbrille, Handschuhe und eine Partikel-Atemschutzmaske dringend empfohlen. Anschließend stellen Sie eine Reihe serieller Verdünnungen von Lipopolysaccharid unter Verwendung des warmen N9-Behandlungsmediums her, um Arbeitslösungen mit vier, zwei und einem Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.

Entfernen Sie abschließend die Hälfte des Kulturmediums aus den Inserten, wobei darauf zu achten ist, die Zellen nicht zu stören. Geben Sie anschließend vorsichtig 25 Mikroliter der gebrauchsfertigen Lipopolysaccharidlösungen zu den Inserten, um endgültige Verdünnungen von zwei, einem oder 0,5 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Inkubieren Sie die Platte weitere 24 Stunden, bevor Sie mit den Co-Kultur-Experimenten fortfahren.

Dieser Schritt erfordert PC12-Zellen, die mit 30.000 Zellen pro Quadratzentimeter beschichtet wurden, differenzierte Interneurone und mit Lipopolysaccharid über 24 Stunden aktivierte N9-Mikroglia, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Entfernen Sie zunächst vorsichtig das gesamte Medium aus den Einsätzen und ersetzen Sie es durch 50 Mikroliter frisches, warmes N9-Behandlungsmedium. Dies ist notwendig, um alle Rückstände von Lipopolysaccharid zu entfernen und lediglich aktivierte N9-Mikroglia zurückzulassen.

Beachten Sie, dass die Einsätze lose in den Vertiefungen der Zellkulturschale liegen und sich verschieben können, wenn die Pipettenspitze zu stark gegen die Wand gedrückt wird. Dieser Schritt sollte einzeln für jeden Einsatz durchgeführt werden, um zu verhindern, dass die Zellen durch längere Luftexposition austrocknen. Anschließend wird das neuronale PC12-Zellmedium vollständig entfernt und durch 0,6 Milliliter frisches, warmes PC12-Behandlungsmedium ersetzt.

Führen Sie dies einzeln sorgfältig durch, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht austrocknen. Greifen Sie mit einer Pinzette die oberste Kante eines Inserts und platzieren Sie es vorsichtig in die Vertiefung mit neuronalen PC12-Zellen. Sobald alle Inserts übertragen sind, überprüfen Sie, ob sich Luftblasen unter den Membranen der Inserts befinden.

Luftblasen verhindern jeden Austausch über die Membran des Inserts und können das gesamte Experiment gefährden. Entfernen Sie etwaige Luftblasen, indem Sie das Insert mit einer Pinzette sehr vorsichtig aus der Vertiefung heben und es erneut in das Zellkulturmedium zurücklegen; diese Maßnahme sollte die meisten Blasen beseitigen. Bei hartnäckigen Blasen versuchen Sie, das Insert vorsichtig in einem Winkel erneut in das Zellkulturmedium einzutauchen.

Schlagen oder rühren Sie die Einsätze nicht, da dies zur Ablösung adhärenter Zellen führen kann. Überprüfen Sie danach die Mediumvolumina in den Einsätzen und den Vertiefungen; die Flüssigkeit in beiden Kompartimenten sollte sich ungefähr auf dem gleichen Niveau befinden. Sobald alle Luftblasen entfernt sind und die Mediumvolumina angemessen sind, inkubieren Sie die Platte.

Die Zellen, das Kulturmedium oder beides können anschließend gesammelt werden, um die Auswirkungen der parakrinen Signalübertragung zwischen den N9-Mikroglia und den neuronalen PC12-Zellen zu messen. Auf dem Kulturmedium des unteren Kompartiments wurden Enzyme-gekoppelte Immunosorbens-Assays durchgeführt, um proinflammatorische Zytokine zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die N9-Mikroglia 24 Stunden nach der Aktivierungsphase, die mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Lipopolysaccharid behandelt worden waren, signifikant mehr proinflammatorische Zytokine, wie Interleukin-6, Tumor-Nekrose-Faktor-alpha und Interferon-gamma, freisetzten als Mikroglia, die nicht behandelt wurden.

Zusätzlich sekretierten N9-Mikrogliazellen, die mit einem Mikrogramm pro Milliliter Lipopolysaccharid behandelt wurden, nach 24 Stunden deutlich erhöhte Mengen Interferon-Gamma, während ein signifikanter Anstieg der Konzentrationen von Interleukin-6 und Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha im Zellkulturüberstand erst nach 48 Stunden beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit 0,5 Mikrogramm pro Milliliter nicht zu einer gesteigerten Zytokingexpression in N9-Mikrogliazellen, weder nach 24 noch nach 48 Stunden Aktivierungszeit. Darüber hinaus deuten die Daten nach 24 Stunden in der Gruppe mit zwei Mikrogramm pro Milliliter darauf hin, dass eine Mikrogliose, also eine Zunahme der Mikroglia-Population, stattfand.

Jedoch erst nach 48 Stunden stieg die Zellanzahl signifikant an. Schließlich wurde, um die Folgen der Mikroglia-Aktivierung, die zu erhöhter Zytokinsekretion und Mikrogliose führt, zu bewerten, die Zytotoxizität in den kokultivierten neuronalen PC12-Zellen untersucht. Durch die Messung der Konzentration von extrazellulärer Lactatdehydrogenase, die von geschädigten Zellen freigesetzt wird, zeigte sich, dass die neuronalen PC12-Zellen mit zunehmender Konzentration von Lipopolysaccharid in den N9-Zellen stärker abstarben.

Daher zeigen diese Ergebnisse, dass sezernierte lösliche Faktoren in der Lage sind, die Membran der Co-Kultur-Einsätze zu durchqueren, und ohne direkten Zell-Zell-Kontakt zytotoxische Schäden an neuronalen PC12-Zellen verursachen können. Obwohl hier nur ein Szenario einer Insert-Co-Kultur dargestellt wurde, handelt es sich um eine sehr flexible Technik. In diesem Protokoll wurde ein Zelltyp vorbehandelt mit dem Molekül, das für die Verringerung der Sekretion löslicher Faktoren verantwortlich ist, die sich nach dem Übertragen des Inserts in die Vertiefung auf das Verhalten eines zweiten Zelltyps auswirken.

Es ist jedoch möglich, beide Zelltypen in einem Ko-Kultursystem gemeinsam zu inkubieren, um die erhöhte Schwäche oder Resistenz einer oder beider Zellpopulationen gegenüber einer späteren Behandlung nachzuweisen. Diese Technik kann einfach zwei Zellpopulationen nutzen, die ohne jegliche Behandlung zusammen inkubiert werden, um beispielsweise die basale parakrine wechselseitige Signalübertragung zu bewerten. Neben ihrer Bedeutung im Bereich der Neuroinflammation, wie hier gezeigt, können Insert-Ko-Kultursysteme verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen im Zusammenhang mit Tumorregenese, Neurolathyrisma, Apoptose-Signalgebung oder jedem anderen Thema mit einem parakrinen Signalbestandteil zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie Insert-Ko-Kultursysteme eine einfache Möglichkeit bieten, die durch sekretierte lösliche Faktoren vermittelten Veränderungen zu bewerten. Und wir hoffen, Sie von dem hohen Potenzial dieser Insert-Ko-Kultursysteme bei der Untersuchung von parakriner Multizell-Signalgebung in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt überzeugt zu haben.