Externe Anregung von Neuronen mittels elektrische und magnetische Felder in One- und Zweidimensionale Kulturen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls für die elektrische und magnetische Stimulation von eindimensionalen und zweidimensionalen Kulturen ist es, neuronale Kulturen effizient als reduziertes Modell für die Hirnstimulation zu nutzen, aus dem wir Erkenntnisse und wichtige Parameter extrahieren können. Die Verwendung unseres elektrischen Stimulationsprotokolls mit eindimensionalen Kulturen ermöglicht es uns, spezifische Parameter im Zusammenhang mit der neuronalen Erregung zu messen, z. B. Chronaxie und Rheobase in verschiedenen Kompartimenten des Neurons. Die Magnetstimulationstechnik ermöglicht es uns, die Wirkung von magnetischen und elektrischen Feldern auf neuronale Kulturen zu vergleichen.

Dieses Modell ermöglicht es uns auch, Erkrankungen des Gehirns besser zu diagnostizieren und zu behandeln. Wir schlagen eine effektive und einfache Methode zur Kultivierung von neuronalen Musternetzen in jedem Designmuster vor, auch in eindimensionalen Netzwerken. Wir können dann elektrische und zeitlich veränderliche Magnetfelder in Bezug auf diese Netzwerke ausrichten, um die Beiträge verschiedener Kompartimente des Neurons zu trennen und zu beobachten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie keine menschlichen Probanden oder Tiermodelle benötigt, was eine umfassende und erschöpfende Suche nach den richtigen Parametern für die neuronale Stimulation ermöglicht. Das Verfahren wird von Yuri Burnishev, einem Techniker aus meinem Labor, und Ami Eisen, einem Doktoranden im Labor, demonstriert. Bereiten Sie zunächst gemusterte neuronale Kulturen vor, indem Sie Nervenzellen auf Glasdeckgläser säen, die teilweise mit einer Bioabstoßungsschicht vorbeschichtet sind.

Reinigen Sie dazu 25 Millimeter Deckgläser. Beschichten Sie das Deckglas mit einer Sputtermaschine mit einer Biorejektschicht. Passen Sie die Parameter für den Abscheidungsprozess an, um eine Schicht zu erzeugen, die aus einem dünnen Chromfilm von sechs bis 10 Angström besteht, der die Stabilität der Beschichtung gewährleistet, und einer 30 Angström dicken Goldschicht, die der Beschichtung eine Thiolreaktivität verleiht.

Sobald der Vorgang abgeschlossen ist, entfernen Sie das Deckglas von der Sputtermaschine und untersuchen Sie die erhaltene Beschichtung. Bauen Sie als Nächstes ein modifiziertes Stiftplottersystem zusammen, indem Sie eine Tintenspitze eines Plotterstifts durch eine scharfe Metallätznadel ersetzen. Legen Sie eine auf eine steife Platte geklebte Gummiplatte in den Plotter, so dass beim Ätzen eine stabile und reibungsstarke Oberfläche gewährleistet ist.

Passen Sie dann die Position des Blattes an, indem Sie die Tasten am Plotter drücken. Sobald die Gummiplatte an Ort und Stelle ist, pipettieren Sie einen kleinen Tropfen Wasser auf die Oberfläche und legen Sie das vorbeschichtete Deckglas über den Tropfen. Ätzen Sie anschließend mit dem Plotter durch wiederholtes Kratzen durch die Metallschichten, um 200 Mikrometer dicke Linien zu erzeugen, um die gewünschten Muster zu erzeugen.

Legen Sie vor einer elektrischen Stimulation das ausgesäte Deckglas in eine Bildgebungskammer. Um die Zellen mit einem elektrischen Feld konstanter Richtung zu stimulieren, verwenden Sie zwei parallele Elektroden, die 11 Millimeter voneinander entfernt sind und sich an gegenüberliegenden Seiten der Kultur befinden, die auf den 13-Millimeter-Deckgläsern plattiert sind. Bauen Sie dann die Bildgebungskammer für die Kultur und den passenden Elektrodenhalter so zusammen, dass die Drahtelektroden in das extrazelluläre Medium eingetaucht und einen Millimeter über der Kultur positioniert werden.

Schließen Sie dann das einzelne Elektrodenpaar an den Operationsverstärker an, der das Signal des Generators verstärkt. Legen Sie einen einzelnen bipolaren Rechteckimpuls mit einer Einschaltdauer von 50 % und einer Amplitude von 22 Volt an. Verwenden Sie eine bipolare Welle ohne Gleichstromanteil, um eine Elektrolyse zu vermeiden, die an den Elektroden auftreten kann.

Wenden Sie den Impuls an, der zwischen 10 Mikrosekunden und vier Millisekunden dauert, um eine effektive Stimulation zu gewährleisten, aber Zellschäden zu vermeiden. Um die Zellen mit elektrischen Feldern wechselnder Richtung zu stimulieren, verwenden Sie zwei senkrechte Elektrodenpaare. Stellen Sie sicher, dass die beiden Elektrodenpaare sowie ihre Strom- und Überwachungsanschlüsse vollständig elektrisch voneinander getrennt sind und vom Erdboden aus schweben.

Um die Ausrichtung des elektrischen Feldes zu ändern, variieren Sie die Amplitude der Spannung, die an die beiden Elektrodenpaare angelegt wird. Bestimmen Sie dann die Intensität und die Richtung des resultierenden Feldes durch Vektoraddition. Um ein rotierendes Feld mit fester Amplitude zu erzeugen, legen Sie eine Sinuswelle an ein Elektrodenpaar an, während Sie das andere Paar mit einer Kosinuswelle versorgen.

Um mit der Magnetstimulation zu beginnen, positionieren Sie eine neuronale Kultur, die in einem kreisförmigen Muster gezüchtet ist, unter dem Mikroskop. Stimulieren Sie die Kultur mit einer handelsüblichen zirkulären Magnetstimulationsspule und einem unterstützenden Stimulator, die im Handel erhältlich sind. Um die Kulturen mit nicht standardmäßigen Magnetfeldintensitäten zu stimulieren, schließen Sie eine speziell angefertigte Magnetstimulationsspule an den speziell angefertigten Stimulator an.

Richten Sie dann mit Hilfe eines Laserpointers die Mitte der Kultur auf die Mitte der Spule aus, um eine erfolgreiche Stimulation zu gewährleisten. Passen Sie die Positionen der Spule so an, dass sie etwa fünf Millimeter über der Mitte der Kultur verbleibt. Sobald die Stimulationsspule richtig positioniert ist, belasten Sie den Stimulator mit einem Potenzial von bis zu fünf Kilovolt.

Entladen Sie dann mit einem Hochstrom-Hochspannungsschalter den Hochvoltagestrom durch die Stimulationsspule, um einen magnetischen Impuls zu erzeugen, der die Aktivität der kultivierten Neuronen stimuliert. Montieren Sie abschließend eine Tonabnehmerspule an der gleichen Position wie die neuronale Kultur und messen Sie die Intensität des erzeugten Magnetfeldes. Dieses Schema zeigt, dass durch Anlegen unterschiedlicher Amplituden von Spannungsimpulsen an die beiden Elektrodenpaare die elektrischen Felder in jeden Winkel ausgerichtet werden können, ohne dass die Kultur manuell gedreht werden muss.

Hier sind die Beispielaufnahmen von Kalziumtransienten mit elektrischer Stimulation bei unterschiedlich angelegten Spannungen. Wenn eine konstante Dauer des elektrischen Feldes angewendet wird, zeigt die Anzahl der Neuronen, die feuern und auf das elektrische Feld reagieren, eine kumulative Gauß-Verteilung in Abhängigkeit von der Amplitude der Spannung. Und dies ist ein Beispiel für eine Festigkeits-Dauer-Kurve, die unter Verwendung dieses Protokolls erhalten wurde.

Bei den Ringkulturen, die auf das Magnetfeld reagieren, wächst die Erfolgsrate der Stimulation mit dem Kulturradius. Diese Grafik zeigt das Verhältnis zwischen der Ringgröße und der magnetischen Feldstärke. Die erfolgreichsten Anregungen der Kulturen liegen in der Überlappung zwischen dem Raum der experimentell zugänglichen Phase und dem Bereich mit hoher Wahrscheinlichkeit.

Einmal gemeistert, kann die Aufbereitung von eindimensionalen Kulturen innerhalb von drei bis vier Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung von elektrischer und magnetischer Stimulation ist es wichtig, daran zu denken, dass sich die Kultur nach dem Stimulationsschritt vollständig erholen kann und dass alle Geräte in Bezug auf den elektrischen Boden schwimmen. Durch dieses Verfahren können andere Fragen beantwortet werden, wie z. B. die Kultivierung von Neuronen aus verschiedenen Bereichen des Gehirns, die Messung von Statistiken, z. B. von kortikalen Neuronen.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, Parameter eines beliebigen Krankheitsmodellneurons zu messen. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik den Weg für die Optimierung der Stärke und Dauer ebnen, die für eine effektive und sichere Hirnstimulation erforderlich sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie jedes gewünschte Muster von neuronalen Kulturen erzeugen und in der Lage sein können, sie elektrisch oder magnetisch zu stimulieren, um die Wechselwirkungen von Neuronen mit elektromagnetischen Feldern zu untersuchen.