Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) und Genexpressionsanalyse von Fos-exprimierenden Neurone von Frische und Gefrorene Rattenhirngewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Fos-exprimierende Neuronen von frischem oder gefrorenem adultem Rattenhirngewebe für die anschließende fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zu dissoziieren. Diese Methode kann verwendet werden, um neuronale Zellen von Interesse zu isolieren, um die einzigartige molekulare Neuroadaptation von verhaltensaktivierten Neuronen zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Verwendung von gefrorenem Gewebe ermöglicht, was die Isolierung von Zellen aus mehreren Gehirnbereichen an verschiedenen Tagen erleichtert.

Um dieses frische Hirngewebe zu verarbeiten, führen Sie zwei oder mehr vorgekühlte Rasierklingen in die Schlitze einer eiskalten Gehirnschneidematrix ein, um ein bis zwei Millimeter große koronale Scheiben zu schneiden, die die interessierenden Gehirnregionen enthalten, und legen Sie die Schnitte während des Schneidens auf eine gekühlte Glasplatte. Präparieren Sie zunächst die interessierende Gehirnregion, verwerfen Sie die anderen Bereiche und entfernen Sie die weiße Substanz. Um das Gewebe einzufrieren, geben Sie die Proben in ein Mikroröhrchen und tauchen Sie das Röhrchen 20 Sekunden lang in minus 40 Grad Celsius Isopentan, um es bis zur weiteren Verarbeitung bei minus 80 Grad Celsius zu lagern.

Um das Gewebe zu zerkleinern, lassen Sie die Proben nicht länger als eine Minute auf einer kalten Glasplatte auftauen, bevor Sie die Proben mit ein bis zwei Tropfen Puffer-A-Lösung bedecken. Halten Sie dann eine Rasierklinge vollständig senkrecht zur Platte und hacken Sie das Gewebe 100 Mal in jede orthogonale Richtung. Um das Gewebe gründlich zu zerkleinern, ist es wichtig, das Gewebe mit Puffer A feucht zu halten und die angegebenen Zerkleinerungszeiten und -richtungen einzuhalten.

Es ist wichtig, den Großteil der weißen Substanz während der Gewebedissektion zu entfernen und das Gewebe mit Puffer A bedeckt zu halten, um die Zerkleinerungseffizienz zu verbessern und die Gesundheit der Zellen zu erhalten. Wenn das Gewebe gründlich verarbeitet wurde, übertrage die Stücke mit der Rasierklinge in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Milliliter kalten Puffer A enthält, und drehe das Röhrchen drei- bis fünfmal um, um das gesamte zerkleinerte Gewebe in die Lösung zu tauchen. Um die Gewebefragmente in Einzelzellsuspension zu dissoziieren, pelletieren Sie die Proben durch Zentrifugation.

Entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie dann langsam einen Milliliter kalte, frisch aufgetaute Enzymlösung durch die Innenwand des Mikroröhrchens. Verwenden Sie eine Pipette mit großem Spitzendurchmesser, um jedes Pellet sofort viermal vollständig abzusaugen und abzugeben, um die gehackten Gewebestücke zu dispergieren.

Als nächstes drehen Sie das Mikroröhrchen schnell um, um zu verhindern, dass die Pellets an den Röhrchenböden kleben, und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Am Ende des Aufschlusses zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut und geben 0,6 Milliliter kalten Puffer A in die Zellen. Aspirieren und dosieren Sie die Pellets mit derselben Pipettenspitze sofort fünfmal.

Wählen Sie dann eine 1,3-Millimeter-Glaspipette aus und verwenden Sie sie, um die Proben 10 Mal vorsichtig zu zerreiben. Legen Sie die Probe zwei Minuten lang auf Eis, damit sich die Rückstände und undissoziierten Zellen auf dem Boden des Röhrchens absetzen können. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie anschließend 600 Mikroliter Puffer-A-Lösung zum verbleibenden Pellet und verwenden Sie eine Pipette mit einem Durchmesser von 0,8 Millimetern, um die Probe weitere 10 Mal zu zerreiben. Nachdem Sie das Gewebe wie gerade gezeigt abgesetzt haben, poolen Sie den Überstand mit der ersten Zellsuspension und fügen Sie dem Pellet weitere 600 Mikroliter Puffer hinzu. Verwenden Sie dann eine 0,4-Millimeter-Pipette, um die Probe zu verreiben, und legen Sie das Röhrchen zwei Minuten lang auf Eis, damit sich das Gewebe absetzen kann.

Das Befolgen der mechanischen Verreibungsschritte im Protokoll ist wichtig für eine erfolgreiche Sortierung. Anschließend wird der Überstand mit den dissoziierten Zellen gepoolt. Geben Sie dann 600 Mikroliter Puffer A in die Probe und wiederholen Sie die 0,4-Millimeter-Pipettenverreibung noch dreimal.

Legen Sie die Röhrchen zwei Minuten lang auf Eis, damit sich die Zellen absetzen können. Und dann den Überstand in einem zweiten 15-Milliliter-Röhrchen sammeln. Wiederholen Sie den Verreibungsvorgang noch drei Mal mit der kleinsten Glaspipette, um die Ausbeute der Zellen für die anschließende Sortierung deutlich zu erhöhen.

Nachdem alle Überstände gesammelt wurden, geben Sie 800 Mikroliter minus 20 Grad Celsius 100%iges Ethanol in vier Miroröhren auf Eis. Dann werden 800 Mikroliter Zellen aus dem ersten Röhrchen mit dem gesammelten Überstand in jedes der ersten beiden Röhrchen mit Ethanol und 800 Mikroliter Zellen aus dem zweiten Röhrchen mit Überstand in jedes der letzten beiden Röhrchen mit Ethanol übertragen. Drehen Sie die Röhrchen um, um die Proben zu mischen.

Legen Sie die Proben dann 15 Minuten lang auf Eis, wobei alle fünf Minuten durch Inversion gemischt wird. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen. Berühren Sie dann nur die Wand des Mikroröhrchens und entfernen Sie mit einer Mikropipette langsam alle bis auf die letzten 50 Mikroliter jedes Überstands.

Filtern Sie jede der beiden Zellsuspensionen separat mit zwei verschiedenen Paaren von Zellsieben. Die Zellen sind dann bereit für die Markierung mit Antikörpern gegen die interessierenden Zellmarker und die Sortierung durch Durchflusszytometrie. Die Analyse von frischen und gefrorenen Hirngewebeproben zeigt das Vorhandensein kleiner homogener Populationen von neuronalen Zellen mit ähnlicher Größe und Granularität.

Die kleinen homogenen Populationen können so gegated werden, dass sie Zellaggregate ausschließen, und die Neuronen können anhand ihrer NeuN- und DAPI-Positivität identifiziert werden. Sowohl in frischen als auch in gefrorenen Gewebeproben sind die NeuN-mRNA-Spiegel in den NeuN-positiven Populationen ebenfalls signifikant höher als in den NeuN-negativen Populationen. Im Gegensatz dazu sind die mRNA-Spiegel der Glia- und Olidogodendrozytenzellmarker in der NeuN-negativen Population höher als in der NeuN-positiven Population.

Ein ähnlicher Trend zu höheren mikrogialen Zellmarker-mRNA-Spiegeln wird in der NeuN-negativen Population beobachtet, obwohl dies statistisch nicht signifikant war. Darüber hinaus sind die Fos-mRNA-Spiegel in den Fos-positiven Neuronen größer als in den Fos-negativen Neuronen, mit einer dreifachen Zunahme der Fos-mRNA in den Fos-positiven Neuronen aus frischem Gewebe und einer elffachen Zunahme der Fos-mRNA in Fos-positiven Neuronen aus gefrorenem Gewebe, was die Gültigkeit des Verfahrens zur Identifizierung spezifischer Gene von Interesse aus flusssortierten Zellen sowohl unter frischen als auch unter gefrorenen Gewebebedingungen bestätigt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die kritischen Schritte zur Verhinderung der Zelllyse zu befolgen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung durchgeführt werden, um die interessierenden Zelluntergruppen für die weitere nachgelagerte molekulare Analyse zu isolieren. Durch die Verwendung von gefrorenem Gewebe können die Proben an verschiedenen Tagen sortiert werden, was für Experimente, die langwierige und komplizierte Verfahren zur Gewebeentnahme und -aufbereitung erfordern, von entscheidender Bedeutung ist. Diese Technik kann auch verwendet werden, um postmortale gefrorene menschliche Gehirnproben vorzubereiten, die mehrere Monate oder Jahre gelagert wurden, um sie durch Durchflusszytometrie zu sortieren.

Diese Technik ebnete Forschern im Bereich der Neurowissenschaften den Weg für die Erforschung der molekularen Mechanismen, die dem Verhalten von Fos-exprimierenden Neuronen oder anderen immunmarkierten Wildtyp-Zellen von Interesse zugrunde liegen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen von frischem oder gefrorenem Rattenhirngewebe für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung von Neuronen oder Zelltypen von Interesse dissoziiert.